劉莎 朱曉娜 楊志宏 任鑫睿 王昕

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

腦卒中是影響我國居民健康的常見疾病，現(xiàn)每年于40～74歲之間的發(fā)病率以8.3%的幅度增長，且增長幅度已經(jīng)由2012年—2018年從1.89%上升到2.32%，增長了0.43%，同時(shí)缺血性以及出血性腦卒中3月內(nèi)的復(fù)發(fā)率分別為6.8%、0.7%。在2018年的人口普查數(shù)據(jù)中我國大約有194萬人死于此病，傷殘率中缺血性、出血性卒中的達(dá)到1007/10萬、1192/10萬。腦卒中的高初發(fā)率、復(fù)發(fā)率、致殘率以及死亡率，使對卒中的研究越來越多。動(dòng)脈粥樣硬化是引發(fā)卒中的基礎(chǔ)，血脂異常是引起動(dòng)脈硬化的重要因素，據(jù)中國慢病與危險(xiǎn)因素監(jiān)測的數(shù)據(jù)顯示，高膽固醇、高三酰甘油、高低密度脂蛋白以及低高密度脂蛋白發(fā)生率為：6.9%、13.8%、20.4%和8.1%，且在性別上有明顯的不同。因此在治療腦卒中的過程中治療高脂血癥以及動(dòng)脈粥樣硬化是很關(guān)鍵的[1]。陜西省名中醫(yī)楊志宏自擬調(diào)脂柔脈顆粒在臨床治療高脂血癥以及其引起的動(dòng)脈硬化方面有明顯的效果，因此，本文建立高脂血癥大鼠模型，探討其作用機(jī)制，為臨床提供作用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購買健康SPF級雄性大鼠72只，8周齡，平均體重在(220±10)g之間，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證：SCXK(陜)2019-021。動(dòng)物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)溫度維持在20 ℃～27 ℃，室內(nèi)濕度保持在48%～70%，室內(nèi)光照時(shí)間9～10 h·d-1。該實(shí)驗(yàn)得到陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：SUCMDL20210420001)。

1.2藥品和試劑 調(diào)脂柔脈顆粒：購買于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診中藥房，本品為純中藥組成袋裝藥品，每袋藥量為10 g。辛伐他汀鈣片：購買于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診西藥房，廠家：山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格：10 mg×10片/盒，國藥準(zhǔn)字：H20063146。

試劑：甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；0.9%氯化鈉、水合氯醛、乙醇、蘇木素、二甲苯、中性樹脂、玻片(均由西安恩斯維爾生物科技有限公司提供)；蒸餾水(陜西中西藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.3儀器 JJ200電子精密天平(江蘇常熟/雙杰)；SIM-F140BDL制冰機(jī)(日本/SANYO)；TDL-50C低速離心機(jī)(上海安亭/飛鴿)；601051微量離心管(江蘇/耐思)；HARRIS -80 ℃超低溫冰箱(深圳/生泰科技有限公司)；WT84MDF低溫冰箱(日本/三洋)；EXCELSIOR AS全自動(dòng)組織脫水機(jī)(江蘇維林科生物技術(shù)有限公司)；HISTOCENTR包埋機(jī)(上海聚慕醫(yī)療器械有限公司)；LEICA切片機(jī)(常州市飛勒斯儀器有限公司)；LEICA研究級正置顯微鏡(上海/成貫儀器有限公司-顯微系統(tǒng)部)；TBA-120FR全自動(dòng)生化分析儀(日本/東芝)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1分組與造模 72只大鼠給予適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后采取隨機(jī)法，將其分為6組，每組12只大鼠，6組大鼠分別為：空白組、模型組、低劑量調(diào)脂柔脈顆粒組、中劑量調(diào)脂柔脈顆粒組、高劑量調(diào)脂柔脈顆粒組、辛伐他汀組。將所有大鼠給予適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，同時(shí)給予正常飲水、飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，空白組大鼠繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組、調(diào)脂柔脈顆粒各組以及西藥組均給予高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料69.5%+蔗糖10%+蛋黃粉10%+膽固醇0.5%+豬油10%)，同時(shí)每組均給予蒸餾水自由飲用，喂養(yǎng)周期均為12 w。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4.2藥物干預(yù) 大鼠給藥劑量根據(jù)人和動(dòng)物之間體表面積折算的等效劑量比值0.018進(jìn)行計(jì)算，灌胃容量以1 mL/100 g進(jìn)行計(jì)算。中劑量組的調(diào)脂柔脈顆粒為成人的等效劑量。低、中、高劑量組的比例分別以1/2∶1∶2。西藥組給藥劑量為0.9 mg·(kg·d)-1。6組大鼠在飼養(yǎng)8周后造模結(jié)束，并進(jìn)行造模結(jié)果是否成功的檢測。8周后空白組以及模型組給予生理鹽水灌胃，低、中、高調(diào)脂柔脈組以及西藥組均給予對應(yīng)藥物灌胃治療，每天于上午固定時(shí)間灌胃1次，連續(xù)灌胃4 w，每周對大鼠體重進(jìn)行測量，并根據(jù)變化做出相應(yīng)的藥物劑量調(diào)整。

1.4.3取材 在喂養(yǎng)8 w結(jié)束后，每組大鼠禁食不禁水12 h以后，每組隨機(jī)取6只老鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢取血，檢測大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平,如表1結(jié)果所示：證實(shí)高脂血癥動(dòng)物模型造模成功。大鼠于12 w后禁食不禁水12 h，大鼠以10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量麻醉后，仰臥位固定于解剖臺上，于腹主動(dòng)脈處采取大鼠血液于抗凝管中，同時(shí)分離出大鼠頸部血管，并放置于多聚甲醛中。24 h后對頸部血管組織進(jìn)行包埋，行3 μM切片，隨后予以二甲苯脫蠟,分別經(jīng)過不同濃度乙醇洗后置于蒸餾水中，再予以蘇木素染色5 min,自來水沖洗，鹽酸乙醇再次進(jìn)行分化30 s，自來水沖洗，置伊紅染液2 min，常規(guī)脫水，透明，封片，待鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1大鼠造模成功TC、TG檢測表 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，與空白組比較，其余5組在TC、TG上均顯著提高(P<0.05)，與模型組比較，調(diào)脂柔脈低、中、高以及辛伐他汀組未見明顯差異(P>0.05)，表明高脂血癥造模成功，見表1。

表1 各組大鼠造模情況血脂檢測表

2.2調(diào)脂柔脈顆粒對大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量比較 模型組TC、TG、LDL-C顯著高于空白組(P<0.05)，HDL-C顯著低于空白組，調(diào)脂柔脈顆粒低、中、高組以及辛伐他汀組在TC、TG、LDL-C上顯著低于模型組(P<0.05)，其結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HDL-C高于空白組(P>0.05)，但比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 各組大鼠血脂變化表

2.3調(diào)脂柔脈顆粒對大鼠頸部血管病理形態(tài)學(xué)的影響 空白組：其內(nèi)膜是光滑的，管腔厚度是均勻一致的，平滑肌細(xì)胞排列較為整齊，見圖1。模型組：觀察到組織內(nèi)膜受損，管腔厚度明顯不規(guī)則增厚，平滑肌細(xì)胞排列不規(guī)則，見圖2。調(diào)脂柔脈顆粒各劑量組以及辛伐他汀組均可見內(nèi)膜較模型組光滑，且管腔厚度較模型組變薄且厚度較均勻，以中、高劑量組較為明顯，見圖3、4、5、6。

圖1 空白組(40倍)

圖2 模型組(40倍)

圖3 調(diào)脂柔脈低劑量組(40倍)

圖4 調(diào)脂柔脈中劑量組(40倍)

圖5 調(diào)脂柔脈高劑量組(40倍)

圖6 辛伐他汀組(40倍)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化(ATHEROSCLEROSIS，AS)是一種累積全身大、中動(dòng)脈血管的炎癥反應(yīng)疾病，在病情初期主要是脂質(zhì)和復(fù)合糖類積聚、繼而出血和血栓形成；進(jìn)展期的主要反應(yīng)為鈣質(zhì)沉著及纖維組織增生，同時(shí)伴有中層血管的蛻變和鈣化，最終導(dǎo)致動(dòng)脈管壁變硬變脆、管腔狹窄，導(dǎo)致供血部位的缺血、缺氧。高脂血癥是形成AS的高危因素，研究表明，高脂血癥作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成其損傷，刺激內(nèi)膜下LDL-C被氧化，形成可以被巨噬細(xì)胞吞噬的OX-LDL，產(chǎn)生大量的泡沫細(xì)胞，促進(jìn)AS的形成[2-3]。

調(diào)脂柔脈顆粒(天花粉、黃芪、葛根、制首烏、決明子、丹參、大黃、蒼術(shù)、山楂、槐角)是楊志宏主任醫(yī)師根據(jù)“肝脾腎-氣瘀痰”的病位以及病理因素自擬的方藥，具有健脾益腎、燥濕化痰、活血化瘀、降脂化濁的功效。在前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表明[4-5],其可使大鼠總膽固醇、甘油三酯、全血低切、高切黏度降低；抑制大鼠動(dòng)脈壁ICAM-1基因的表達(dá)。在臨床實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)[6-8]，調(diào)脂柔脈顆?？梢詼p慢腦血流動(dòng)力學(xué)中的PI(血管搏動(dòng)指數(shù))、RI(血管阻力指數(shù))，提高M(jìn)CA(大腦中動(dòng)脈)及VA(椎動(dòng)脈)的VS(收縮期血流速度)，調(diào)節(jié)血脂代謝程度，縮小頸動(dòng)脈斑塊面積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。且現(xiàn)代研究表明：其組方中的葛根可減少巨噬細(xì)胞凋亡[9]；黃芪甲苷可降低炎癥因子氨基末端激酶、腫瘤壞死因子-α、核轉(zhuǎn)錄因子KB MRNA[10]；決明子的活性成分影響外源性以及內(nèi)源性脂質(zhì)的吸收、合成、代謝，調(diào)節(jié)膽固醇在體內(nèi)的分布水平[11]；山楂葉總黃酮可以通過干預(yù)血脂、血糖、抗氧化、減輕炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞損傷[12]；丹參素可以降低血清中的IL-6和CRP，參與炎癥反應(yīng)、影響與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有關(guān)的CD4+、CD25+、FOXP3+等細(xì)胞，影響免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、抑制TLR-NF-κB通路中的TLR2和TLR4、P-IκB和NF-κB P65蛋白表達(dá)[13]；大黃素抑制脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP1)，影響脂肪酸的合成代謝、抑制周脂素，使脂肪分解速率降低、增加促進(jìn)三酰甘油水解的脂肪三酰甘油脂肪酶、抑制11BETA-HSD1的活性而影響脂肪代謝[14]；其組方中的多種藥物被現(xiàn)代研究證明可以通過各種途徑抑制高脂血癥，進(jìn)而發(fā)揮抗AS的作用。

他汀類可以通過影響過氧化物酶體增殖活化受體(PPARR)，促進(jìn)脂肪分解，促進(jìn)褐色脂肪細(xì)胞(BAT)分化，減少白色脂肪組織含量，使抑炎因子分泌增多，促炎因子分泌減少，增加胰島素敏感性，干預(yù)炎癥應(yīng)答與糖脂代謝；可以影響肝臟低密度脂蛋白受體(LDLR)，促進(jìn)對糖脂代謝有積極作用的BAT的活化；使心外膜脂肪組織(EAT)沉積減少，及其介導(dǎo)的脂毒性物質(zhì)以及促炎因子減少；增加AS保護(hù)性脂肪因子(APN、APELIN基因、VASPIN基因)與致病性脂肪因子(瘦素、內(nèi)脂素、抵抗素)表達(dá)，發(fā)揮抗AS的作用[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取辛伐他汀作為調(diào)脂柔脈治療對照組，觀察調(diào)脂柔脈顆粒對高脂血癥大鼠的作用。

TC、TG、LDL-C、HDL-C水平是反應(yīng)高脂血癥以及動(dòng)脈硬化的重要指標(biāo)[16]，當(dāng)TG水平升高時(shí)，會(huì)引起機(jī)體內(nèi)的HDL含量降低，sLDL升高，繼發(fā)炎癥反應(yīng)，內(nèi)皮的受損[17]，研究發(fā)現(xiàn),TG水平的升高還與胰腺炎之間有密切關(guān)系，當(dāng)TG>5.65 mmol·L-1時(shí)，應(yīng)該進(jìn)行降脂治療，有益于胰腺炎患者病情的進(jìn)展與預(yù)后[18]。TG水平的升高會(huì)引起機(jī)體損傷，控制TG在適當(dāng)水平是臨床治療的關(guān)鍵。TC作為環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，TC升高會(huì)引起血管壁損害，同時(shí)在各種介質(zhì)作用下，引起脂質(zhì)堆積[19]。LDL-C是構(gòu)成人體內(nèi)固醇類激素、膽酸、細(xì)胞膜的主要物質(zhì)，經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LDL-C控制到30 mg·dL-1水平時(shí)，是臨床上較好的控制其引發(fā)其他疾病如：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的血脂水平[20]。HDL是一種運(yùn)載膽固醇的介質(zhì)，其通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制干預(yù)膽固醇流出、酯化和轉(zhuǎn)化為膽汁酸三種過程，從而調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)平衡，同時(shí)，HDL-C水平與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦動(dòng)脈粥樣硬化以及老年性黃斑變性等多種疾病之間有密切的關(guān)系[21]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用TC、TG、LDL-C、HDL-C作為調(diào)脂柔脈顆粒療效檢測指標(biāo)。

通過最終實(shí)驗(yàn)研究我們可以發(fā)現(xiàn)，調(diào)脂柔脈顆?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)血脂代謝，降低TC、TG、LDL-C，升高HDL-C，改善大鼠血管結(jié)構(gòu)，減輕斑塊形成，在治療效果上可以跟他汀類的作用比擬。調(diào)脂柔脈顆粒治療高脂血癥有一定的實(shí)驗(yàn)支持，但本實(shí)驗(yàn)仍存在很多的不足，在證明調(diào)脂柔脈顆粒進(jìn)一步治療AS上仍需要更多的研究。