許琳灝，劉信澤，劉 偉，向 平，杭太俊，陽 碩，嚴(yán) 慧*

（1司法鑒定科學(xué)研究院上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺司法部司法鑒定重點(diǎn)實驗室，上海 200063；2中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009）

根據(jù)聯(lián)合國毒品和犯罪問題辦公室（United Nations Office on Drugs and Crime，UNODC）的權(quán)威解讀，新型精神活性物質(zhì)（new psychoactive substances，NPS）一詞指的是“不受《1961 年麻醉品單一公約》或《1971 年精神活性物質(zhì)公約》管制，但具有濫用潛力并會對公眾健康帶來威脅的物質(zhì)”。這些物質(zhì)可以是天然或合成的，其目的是模仿傳統(tǒng)濫用藥物的已知效果［1］。在這種情況下，“新”一詞并不一定意味著新合成的，而只是指最近出現(xiàn)在毒品市場上的，它們的化學(xué)或合成過程被稍加修改，以產(chǎn)生與已知非法物質(zhì)（例如大麻素）類似的效果。這些物質(zhì)常常被標(biāo)榜為“法律高點(diǎn)”“浴鹽”或“研究化學(xué)品”來銷售，以規(guī)避法律的制裁［2］。根據(jù)UNODC 關(guān)于NPS 的預(yù)警咨詢（Early Warning Advisory，EWA），市場上銷售的NPS 主要類別為氨基茚類、合成大麻素、合成卡西酮、苯環(huán)類物質(zhì)、苯乙胺、哌嗪、植物性物質(zhì)、色胺類和其他物質(zhì)［1］。截至 2021 年 12 月，134 個國家和地區(qū)已向 UNODC EWA 咨詢報告了1 124種關(guān)于NPS的物質(zhì)，這給進(jìn)行濫用藥物檢測的法醫(yī)實驗室提出了重大挑戰(zhàn)［1］。NPS 進(jìn)入體內(nèi)后通常被廣泛代謝，生物檢測時（特別是在尿液檢測中）應(yīng)側(cè)重于代謝物［3］。因此，代謝研究對于檢測方法開發(fā)是必不可少的。出于倫理考慮和缺乏臨床前安全數(shù)據(jù)，人體研究無法進(jìn)行，真實的人體樣本往往無法獲得，只能在真實案例獲得少量樣本［4］。為了解決這個問題，研究者們使用了各種體外或體內(nèi)模型進(jìn)行代謝物研究［3，5-6］。

斑馬魚是一種小型硬骨魚（3~4 cm），通常來自淡水；最初是由 Streisiger 等［7］在 20 世紀(jì) 80 年代早期作為一種動物模型引入遺傳學(xué)研究。目前斑馬魚已經(jīng)成為生物研究領(lǐng)域包括發(fā)育生物學(xué)、毒理學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)、疾病模型和神經(jīng)生物學(xué)等的流行動物模型［8-20］。斑馬魚具有與人類同源性高、體積小、易于維護(hù)、成本低等優(yōu)勢［6］，非常適于NPS藥理學(xué)、毒理學(xué)、代謝等方面的研究，已成為研究NPS代謝的重要工具。本文在介紹斑馬魚代謝模型優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，總結(jié)了近年來其在NPS 代謝研究方面的應(yīng)用進(jìn)展，旨在為NPS研究提供借鑒。

1 斑馬魚代謝模型的建立

在歐洲，斑馬魚胚胎直到成熟才被視為實驗動物，所以為避免倫理學(xué)問題，傾向于使用斑馬魚胚胎造模［21］。而在巴西、中國和印度，所有用于研究的動物都受到倫理方面的保護(hù)［22］。有學(xué)者評估了斑馬魚幼體在不同成熟階段產(chǎn)生異源代謝物的能力［23-26］。研究表明，成年斑馬魚在產(chǎn)生異物代謝物方面更為有效［27-28］，所以現(xiàn)在一般采用成年斑馬魚進(jìn)行實驗。一般將成年斑馬魚隨機(jī)分為兩組，包括空白斑馬魚組（不含NPS）和實驗組。將斑馬魚放入充滿溶液的容器中，在溶液中接觸NPS，并規(guī)定Ⅰ相和Ⅱ相的浸泡時長。也有通過微量注射的方式對斑馬魚幼蟲進(jìn)行給藥，但礙于斑馬魚體型過小，操作難度較高，且在卵黃囊注射所得的實驗結(jié)果并不好［29］。之后Park 等［30］顯微注射了斑馬魚4 個部位（尾靜脈、心室、后腦、卵黃囊），結(jié)果顯示，除注射卵黃囊外，其他3 個途徑給藥的產(chǎn)生代謝物總量均比暴露在水中給藥要多，且代謝速度快、豐度較高?？偟膩碚f，被動地將化合物送入水中仍然是最簡單和侵入較少的給藥方法。

2 斑馬魚模型在NPS代謝研究中的特點(diǎn)

斑馬魚是目前用于代謝研究的經(jīng)典哺乳動物模型的一個可行的替代方案，作為NPS 代謝研究的動物模型，具有以下特點(diǎn)。

斑馬魚的基因組已經(jīng)被測序，顯示有70%的基因與人類有同源性［31-33］。除了與人類相似的組織和器官的形態(tài)和分子基礎(chǔ)外，它還呈現(xiàn)出與哺乳動物類似的代謝過程［21］。斑馬魚能夠同時進(jìn)行第一階段（氧化、N-去甲基化、O-去甲基化和去烷基化）和第二階段（硫酸化和葡萄糖醛酸化）的代謝反應(yīng)［23，28，31］。在體內(nèi)藥物代謝中發(fā)揮核心作用的是代謝酶［34］。Ⅰ期代謝酶主要是細(xì)胞色素P450（CYP）家族，在人的肝、胃腸道、肺和腎中大量存在，催化許多化學(xué)物質(zhì)和內(nèi)源性化合物的氧化和還原代謝，許多人類CYP 酶在斑馬魚中都有直接的同源基因［33-35］。此外，斑馬魚體內(nèi)還存在人類中缺乏同源基因的細(xì)胞色素P450，例如細(xì)胞色素P1C、細(xì)胞色素 P450-AE 和細(xì)胞色素 P450-2X［33］。在第二階段代謝過程中，來自第一階段的化合物與轉(zhuǎn)移酶結(jié)合：糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UGTS）、磺基轉(zhuǎn)移酶（SULTs）、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（NAT）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、硫代嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（TPMTs）和兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMTs）［34，36］。葡萄糖醛酸化是主要的二期代謝途徑，人體內(nèi)40% ~ 70%的內(nèi)源性和外源性化合物結(jié)合成葡萄糖醛酸化形式排泄出來［27］。在斑馬魚中，共鑒定出 45 個 UGT 基因，可分為 3 個家族，分別是 UGT1、UGT2 和 UGT5（含量最高），其中斑馬魚UG1 和UGT 2 家族和哺乳動物具有高度相似性［37-38］。

在NPS 代謝的研究中，傳統(tǒng)方法是采用常規(guī)的哺乳類動物進(jìn)行體內(nèi)試驗或者體外細(xì)胞實驗。雖然大鼠、帶有人源化肝臟的嵌合小鼠、豬都是成熟的動物模型［39-41］。但相較于斑馬魚模型，小鼠等模型的飼養(yǎng)成本較高，需要的飼養(yǎng)空間較大。與其他動物模型相比，斑馬魚有體型小、易維護(hù)、繁殖成本低和繁殖率高等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞體外實驗的優(yōu)點(diǎn)在于實驗可控性高，干擾較少，但其代謝情況與人體會存在較大的差異；斑馬魚的體內(nèi)環(huán)境及與人類基因的同源性保證了代謝情況的相似性。此外，使用斑馬魚模型預(yù)測新陳代謝的另一大優(yōu)勢是基質(zhì)比尿液或其他動物模型更干凈，這減少了LC-HRMS分析時的基質(zhì)效應(yīng)［42］。但目前大多數(shù)實驗室沒有使用斑馬魚進(jìn)行研究的經(jīng)驗，沒有固定的斑馬魚繁殖基地。斑馬魚和人類代謝之間的物種差異也可能會限制斑馬魚模型的發(fā)展。

3 斑馬魚在代謝研究中的應(yīng)用

3.1 斑馬魚在藥物代謝中的應(yīng)用

斑馬魚在藥物代謝研究中已有廣泛的應(yīng)用［43］。Alderton 等［27］研究了一些藥物和常用的人細(xì)胞色素P450（CYPs）探針在斑馬魚幼體中的積累和代謝。對西沙必利、氯丙嗪、維拉帕米、睪酮和右美沙芬的研究表明，斑馬魚幼體催化Ⅰ相和Ⅱ相反應(yīng)。與哺乳動物相比，斑馬魚幼體在代謝途徑上既有相似之處，也有不同之處。在斑馬魚幼體中觀察到非那西丁代謝為撲熱息痛和右美沙芬代謝為右啡烷（在人類中分別由CYP1A2 和2D6催化的代謝反應(yīng)）。此外，受精后7 d 的斑馬魚幼魚對雙氯芬酸、布洛芬、他克莫司和睪酮進(jìn)行了羥基化。Li 等［44］觀察了中藥淫羊藿苷及其糖苷衍生物在斑馬魚幼體中的代謝和分布，鑒定了淫羊藿苷及其衍生物在斑馬魚體內(nèi)的Ⅰ相和Ⅱ相代謝產(chǎn)物，表明斑馬魚有CYP2 和CYP3A4酶的活性。

3.2 斑馬魚在NPS代謝研究中的應(yīng)用

自2004 年以來，一種名為“Spice”的強(qiáng)效新型精神活性化合物開始在互聯(lián)網(wǎng)上銷售，被廣泛用作大麻的替代品；直到2008年，全球各地的實驗室才陸續(xù)從這些產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)CP-47497 和JWH-018，屬于第一代合成大麻素（synthetic cannabinoids，SCs）［45-48］。合成大麻素作為合成大麻素受體激動劑（synthetic cannabinoid receptor agonists，SCRA），與已知的大麻素受體（CB1，CB2）結(jié)合，并產(chǎn)生類似 于 四 氫 大 麻 酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）的作用，THC 是天然大麻中唯一已知的精神活性成分。合成大麻素是目前NPS占比最大（60%以上）和消費(fèi)最多的一類物質(zhì)。我國是全球首個整類列管合成大麻素類物質(zhì)的國家［49］。

Sardela等［50］最早使用斑馬魚水箱模型（zebrafish water tank，ZWT）對 JWH-073 的代謝進(jìn)行了研究，觀察到的代謝產(chǎn)物與人類的代謝產(chǎn)物相同。JWH-073 的人類尿液代謝物由細(xì)胞色素P450 CYP2C9 和CYP3A4 代謝，前者促進(jìn)吲哚基團(tuán)的單羥基化，后者促進(jìn)烷基ω 位點(diǎn)的單羥基化，然后由UDP 葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶對烷基鏈進(jìn)行ω-羧化。由于斑馬魚中沒有CYP2C9酶同源物，未觀察到吲哚組中的單羥基化。Richter等［29］在2019年第一次使用斑馬魚幼蟲對NPS 進(jìn)行代謝研究。在向培養(yǎng)基中添加底物或向卵黃囊中微量注射底物后孵化斑馬魚幼仔，檢測其代謝產(chǎn)物。結(jié)果顯示，微量注射后僅檢測到1種代謝物，在培養(yǎng)基提取物中發(fā)現(xiàn)了4種代謝物，在幼蟲提取物中發(fā)現(xiàn)了另外14種代謝物。與通過培養(yǎng)基給藥相比，使用微量注射的7'N-5F-ADB 總量要低得多，因為可以注射到幼蟲體內(nèi)的體積很小。但通過添加底物的斑馬魚觀察到酰胺水解、酯水解、烷基鏈羥化和葡萄糖醛酸化等代謝反應(yīng)，與pS9 和HepaRG 細(xì)胞相比提供了更多數(shù)量的代謝物，更接近真實的人類代謝物譜。XU 等［51］通過建立斑馬魚的體內(nèi)代謝模型驗證了人體肝臟微粒體的AMB-FUBINACA 的代謝途徑。在人類肝臟微粒體系統(tǒng)中共鑒定了17 種AMBFUBINACA 的體外代謝物，在斑馬魚模型中檢測到16 種代謝物。肝臟微粒體樣品中檢測到的4 種最豐富的AMB-FUBINACA 酯水解和羥基化代謝物，在斑馬魚模型中都能檢測到。2021 年，學(xué)者采用斑馬魚模型對新型合成大麻素MDMB-CHMINACA［52］、4F-MDMB-BICA［53］、5F-MDMB-PICA［54］和 4FMDMB-BUTINACA［55］的體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化途徑進(jìn)行研究并確定了濫用監(jiān)測的生物標(biāo)志物。Morales-Noé等［56］使用斑馬魚幼蟲模型和液相色譜-高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜（LC-HRMS/MS），研究了5 種第3 代合成大麻素（MMB-CHMICA，ADB-CHMICA，ADB-CHMINACA，MDMB-CHMCZCA 和 NNL-3）的代謝物，并推斷其代謝途徑。這幾種合成大麻素是對JWH-018 4 個亞結(jié)構(gòu)（吲哚環(huán)、甲酮連接基、萘核和戊基尾）之一進(jìn)行改造，形成吲哚或吲唑核心，烷基側(cè)鏈（戊基側(cè)鏈、環(huán)己基），部分通過酰胺與核心相連（如3，3 二甲基丁酸甲酯，MDMB）等。這類化合物是合成大麻素中最豐富、最普遍的一類，而且還在不斷涌現(xiàn)。因結(jié)構(gòu)相似，也有類似的代謝途徑模式。此類合成大麻素優(yōu)先在烷基側(cè)鏈上代謝（羥基化），具有氟烷基側(cè)鏈的合成大麻素主要在末端碳上代謝，形成羥基化和隨后的羧酸。另外酯鍵的水解、MDMB 上的羥基化、脫烷基、N-脫氫也是主要的代謝途徑。

Gampfer 等［57］研究了 2 種芬太尼類 NPS 4F-Cy-BAP，F(xiàn)u-BAP 在人肝S9 組分（pHLS9）和斑馬魚幼蟲體內(nèi)的代謝。通過液相色譜高分辨率-串聯(lián)質(zhì)譜初步鑒定出4F-Cy-BAP 的Ⅰ期和Ⅱ期代謝物7 個，F(xiàn)u-BAP 的Ⅰ期和Ⅱ期代謝物15 個，其中大部分在斑馬魚幼蟲中檢測到，分別為7 個和16 個。N-脫烷基、N-脫酰化、羥化和N-氧化是最豐富的代謝反應(yīng)，相應(yīng)的代謝產(chǎn)物可以成為毒理學(xué)分析的靶標(biāo)。作者進(jìn)行了同工酶的研究，斑馬魚缺少的代謝物正是由CYP2C 和CYP2D 酶所代謝的羥基化的異構(gòu)體，而CYP2C 和CYP2D 是斑馬魚所缺少的CYP酶。在哺乳動物中，間氯苯基哌嗪（mCPP）可以與黑色素結(jié)合，并通過Ⅰ期氧化和Ⅱ期葡萄糖醛酸化和硫酸化消除。斑馬魚幼蟲中mCPP 的生物轉(zhuǎn)化與哺乳動物一致，通過氧化將mCPP 轉(zhuǎn)化為OH-mCPP，然后與葡萄糖醛酸結(jié)合［58］。mCPP 與斑馬魚眼中的黑色素結(jié)合，分布含量最高；并發(fā)現(xiàn)斑馬魚的吸收速率是人吸收的40 倍，可能與人類的腸道屏障比斑馬魚幼體的皮膚屏障或鰓更強(qiáng)有關(guān)。此外，作者還研究了mCPP 在斑馬魚中的代謝動力學(xué)，實驗結(jié)果得到吸收速率常數(shù)Kin為（112.9 ±7.4）L/（kg·h）和消除速率常數(shù)Kout為（0.25 ±0.03）h-1。1%~2%的母體化合物在相同的時間內(nèi)經(jīng)歷了氧化和葡萄糖醛酸化反應(yīng)，這與吸收動力學(xué)分析的時間相符。2020 年，Wagmann 等［59］采用pHLS9、HepaRG 細(xì)胞和斑馬魚幼蟲對4F-MDMBBINACA，4-DMA-NBOMe，ephylone，4F-PHP 和 1PLSD 5 種物質(zhì)進(jìn)行了對比代謝研究。在斑馬魚幼蟲中檢測到的代謝物最多（總共79 個代謝物，第一階段58 個，第二階段21 個），形成的4F-MDMBBINACA、ephylone 和 4F-PHP 豐度最高的代謝物在人類生物樣本中也是豐度最高。然而，一些代謝物只由斑馬魚幼蟲形成，可能表明人類和斑馬魚之間酶的差異?？傮w來說，斑馬魚幼蟲代謝實驗與人類血漿和尿液分析中發(fā)現(xiàn)的代謝物數(shù)據(jù)最吻合，證明了斑馬魚幼蟲作為闡明NPS 代謝研究工具的潛力。

3.3 斑馬魚和其他代謝模型中NPS代謝反應(yīng)比較

Ⅰ相代謝反應(yīng)可分為氧化水解還原3 類。羥基化是斑馬魚中NPS代謝最常見的反應(yīng)，NPS結(jié)構(gòu)中碳原子可氧化成羥基，如果烷基鏈上含有F，一般會氧化脫氟為羥基再進(jìn)一步氧化成酸。另外有脫烷基化（脫?；?、脫氫和N-氧化。水解有酯水解和酰胺水解，酯水解反應(yīng)出現(xiàn)的次數(shù)僅次于羥基化，其產(chǎn)物也通常被指定為標(biāo)志物，酰胺水解較為少見。還原反應(yīng)占一小部分，僅有碳基的還原。斑馬魚體內(nèi)NPS Ⅱ相代謝物的數(shù)量較多，同分異構(gòu)體代謝物較少。Ⅱ相代謝反應(yīng)有葡萄糖醛酸化和硫酸化，NPS代謝物種類葡萄糖醛酸化遠(yuǎn)多于硫酸化，推測和斑馬魚體內(nèi)兩種酶的數(shù)量有關(guān)。與哺乳動物相比，斑馬魚的代謝途徑、代謝產(chǎn)物和數(shù)量都有差異。斑馬魚中代謝物多是單步反應(yīng)，多個代謝步驟形成的代謝物不如在真實人體樣本中豐富［29］，但是人體濫用生物標(biāo)志物在斑馬魚體內(nèi)都能檢出。

斑馬魚體內(nèi)的代謝酶具有與哺乳動物系統(tǒng)相似的氧化和結(jié)合的代謝活性，對合成大麻素來說，斑馬魚產(chǎn)生的代謝物數(shù)量常多于其他代謝模型（pHLS9、HLM、人肝細(xì)胞）［59］。斑馬魚模型也能代謝產(chǎn)生特有的NPS 代謝物，代謝物差異與同工酶的種類有關(guān)［50，57］。5F-MDMB-PICA 中斑馬魚反應(yīng)數(shù)量多于人肝細(xì)胞，斑馬魚特有的代謝反應(yīng)集中在脫烷基化后吲哚環(huán)羥基化和5-氟戊基側(cè)鏈羥基化以及二者的葡萄糖醛酸化和硫酸化，而人肝細(xì)胞特有反應(yīng)多是不同位置的二次羥基化，二者有共同的標(biāo)志性代謝反應(yīng)酯水解（酯水解產(chǎn)物通常為 推 薦 標(biāo) 志 物）［54，60］。 MMB-CHMICA、MDMBCHMCZCA 和ADB-CHMINACA 3 個合成大麻素都是以斑馬魚幼蟲為模型進(jìn)行代謝，由于斑馬魚幼蟲代謝能力弱于成年斑馬魚，所以在代謝反應(yīng)的數(shù)量和步驟上少于所對比的體外代謝模型，但在關(guān)鍵代謝反應(yīng)與體外代謝模型一致［56］。在MDMBCHMCZCA 中，斑馬魚相比于真實尿液樣本缺少了環(huán)己基羥基化的后續(xù)步驟（環(huán)己基二羥基化+酯水解/脫氫，環(huán)己基羥基化+叔丁基羥基化/叔丁基酸化），但推薦代謝標(biāo)志物（環(huán)己基羥基化和咔唑羥基化）與真實尿液樣本一致［56，61］。在 4F-MDMBBINACA 的Ⅰ相代謝反應(yīng)中，斑馬魚幼蟲集中在內(nèi)酯的形成（內(nèi)酯的形成+N-脫烷基/氧化脫氟/氧化脫氟變丁酸/叔丁基羥基化），而真實尿液樣本集中在酯水解（酯水解+吲唑環(huán)羥基化/丁基羥基化/氧化脫氟變丁酸/叔丁基羥基化）［55，62］。在斑馬魚幼蟲體內(nèi)檢測到18 種代謝反應(yīng)（Ⅰ相有14 種，Ⅱ相有4 種），酯水解、內(nèi)酯的形成和氧化脫氟+氧化成羧酸是豐度最高的3個反應(yīng)。在所調(diào)查的模型中，斑馬魚幼蟲反應(yīng)數(shù)量最多［59］。在7'N-5F-ADB 中，斑馬魚與真實尿液樣本的差異主要在酯水解反應(yīng)的數(shù)量上［30，63］。PX-2 中斑馬魚和人肝微粒體的各自獨(dú)有反應(yīng)數(shù)量很少，幾乎全是共同代謝反應(yīng)（酰胺水解，氧化脫氟+苯丙氨酸損失，氧化脫氟）［64］。

在其他類型的NPS 中（芬太尼、苯乙胺、合成卡西酮類等），斑馬魚的代謝物種類數(shù)量并不占優(yōu)勢。在卡西酮類似物ephylone 和4F-PHP 以及3，4-DMA-NBOMe（苯乙胺類）的研究中，斑馬魚幼蟲、pHLS9、HepaRG細(xì)胞和真實尿液樣本作比較，雖然反應(yīng)數(shù)量上與真實尿液樣本相差較大，但相較于其他模型，斑馬魚與真實尿液樣本中發(fā)現(xiàn)的代謝反應(yīng)和信號強(qiáng)度最為相似［59，65］。1P-LSD 是麥角酸酰胺類的迷幻藥物，代謝反應(yīng)主要是脫丙?；筒煌恢昧u基化的組合。在反應(yīng)數(shù)量上斑馬魚和人肝臟S9 組分差異懸殊，可能是個體間代謝差異造成［59］。在戊酰芬太尼（valerylfentanyl）的研究中［66］，人肝微粒體模型共有19種代謝反應(yīng)，雖然斑馬魚較數(shù)量上少于人肝微粒體，但在標(biāo)志性代謝反應(yīng)上二者高度吻合（N-脫烷基化和羥基化等），為斑馬魚作為芬太尼相關(guān)化合物代謝模型提供了支持。

4 總結(jié)與展望

由于新出現(xiàn)的NPS 的人體數(shù)據(jù)不易獲得，因此有必要通過體內(nèi)和體外代謝模型對NPS 代謝進(jìn)行系統(tǒng)研究。斑馬魚是一種新型脊椎類動物模型，具有與人類同源性高、用藥量少以及花費(fèi)較低等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于人類相關(guān)疾病和藥物研究。本文概述了斑馬魚代謝模型在NPS 的應(yīng)用，顯示出了斑馬魚模型在NPS 代謝方面巨大的應(yīng)用潛力。但是，關(guān)于NPS 的斑馬魚行為和代謝研究仍較為匱乏。體內(nèi)的代謝情況能提供部分毒代動力學(xué)信息，有助于評估斑馬魚模型在NPS 的適用性，而行為效應(yīng)對于闡釋NPS 的作用機(jī)制也有相當(dāng)大的幫助；此外，以往研究大多集中在合成大麻素類，其他類型的NPS 較少涉及；且斑馬魚與人體之間的差異也需要進(jìn)一步深入的探索。