尚君鵬，賀曉偉，方秋雨，牟 穎

(1.浙江大學(xué) 控制科學(xué)與工程學(xué)院，工業(yè)控制技術(shù)國家重點實驗室，浙江 杭州 310058；2.浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是一種用于體外擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，該項技術(shù)已經(jīng)逐漸發(fā)展為檢測核酸目標片段的主流分子診斷學(xué)技術(shù).數(shù)字PCR技術(shù)[1-3]屬于第三代核酸檢測技術(shù)，可以在無須建立標準曲線的條件下，實現(xiàn)低濃度的目標核酸分子精確的絕對定量，具有很高的靈敏度及特異性[4-6]，使其在疾病的發(fā)現(xiàn)及治療等方面表現(xiàn)出了極大的優(yōu)越性，對于提升國民衛(wèi)生水平、改善國民生活質(zhì)量具有很高的發(fā)展前景及研究價值[7-8].

目前市面上所售賣的商業(yè)化數(shù)字PCR儀存在著造價昂貴、體積龐大、集成度低、使用成本高等缺點.本文開發(fā)了一種體積小、易攜帶、高集成度、結(jié)構(gòu)簡單、低成本、高效率、高準確度的智能數(shù)字PCR儀，以方便進行現(xiàn)場實時的核酸檢測.

1 系統(tǒng)架構(gòu)概述

為了滿足儀器低成本、高集成的需求，實現(xiàn)更高的現(xiàn)場檢測性能，基于微流控芯片[9-10]與智能手機實現(xiàn)數(shù)字PCR，系統(tǒng)的架構(gòu)主要分為上位機與下位機(溫控?zé)嵫h(huán)系統(tǒng))兩個部分.如圖1所示，上位機主要基于Android智能手機來完成開發(fā)，承擔(dān)的作用主要包括人機交互、數(shù)據(jù)指令通訊、熒光圖像采集、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果輸出等.下位機基于MSP430單片機，實現(xiàn)了一個微型溫控?zé)嵫h(huán)系統(tǒng)，對承載待測樣本的微流控芯片實現(xiàn)精準溫控，以完成復(fù)雜的PCR熱循環(huán).

圖1 智能數(shù)字PCR系統(tǒng)架構(gòu)

2 溫控?zé)嵫h(huán)系統(tǒng)設(shè)計與實現(xiàn)

2.1 硬件選型

2.1.1 溫度傳感器

溫度的準確測量對實現(xiàn)精準的溫度控制具有必要性，因此，選擇一款高精度與高響應(yīng)特性的溫度傳感器具有重要意義.本文采用基于晶體振蕩器的集成測溫模塊DS18B20，能夠直接輸出數(shù)字信號，具有體積小、硬件開銷低、抗干擾能力強、精度高的特點，能夠滿足系統(tǒng)的溫控需求.

2.1.2 藍牙通訊模塊

溫控?zé)嵫h(huán)系統(tǒng)作為小型數(shù)字PCR的一部分，需要與儀器等其他模塊進行實時的信息傳遞.藍牙通訊作為一種經(jīng)典的無線數(shù)據(jù)通訊方式，其技術(shù)成熟、操作簡便，在體積小、功耗低的同時，能夠保證設(shè)備間的穩(wěn)定連接與數(shù)據(jù)流暢通訊.本文采用HC-05藍牙模塊進行上位機與下位機之間的通訊，其成本低，集成度高，并且工作溫度范圍較大，支持多種波特率，采用8位傳輸，能夠很好地滿足本文的儀器設(shè)計需求.

2.1.3 半導(dǎo)體制冷片

PCR過程對控溫的穩(wěn)定性和精準度有很大需求.同時，為了使每個獨立小室中能夠同時在相同的溫度條件下進行生化反應(yīng)，反應(yīng)空間的溫度均勻性同樣至關(guān)重要.因此，作為溫控的核心硬件，半導(dǎo)體制冷片的選型尤為關(guān)鍵.

半導(dǎo)體制冷片是一種熱泵，它通過帕爾貼(Peltier)效應(yīng)可以實現(xiàn)迅速加熱或制冷的目的.本文選擇了馬洛(Marlow)公司生產(chǎn)的LCC-12-10-01L型半導(dǎo)體制冷片(圖2)作為升降溫元件.該半導(dǎo)體制冷片設(shè)計于溫度循環(huán)應(yīng)用，尺寸為40 mm×40 mm×4 mm，體積小，重量輕，且工作溫度可達130 ℃，具有控溫快、溫度均勻性好等優(yōu)點，能夠很好地滿足本設(shè)計方案中PCR反應(yīng)溫度循環(huán)的需求.

圖2 馬洛LCC-12-10-01L型半導(dǎo)體制冷片

2.2 溫控系統(tǒng)電路設(shè)計

溫控系統(tǒng)需要完成的功能主要包括溫度的測量、通過單片機生成的PWM波升壓給帕爾貼元件進行溫度的升降控制、與上位機進行藍牙通訊等，根據(jù)所選硬件，在Altium Designer中設(shè)計各模塊電路原理圖如圖3所示.溫控系統(tǒng)中的核心部分升壓溫控模塊，將單片機輸出的兩路PWM波通過74AHC244緩沖器后，送入由兩個BTS7960芯片組成的H橋中進行升壓，轉(zhuǎn)化成兩路幅值為12 V的PWM波供給半導(dǎo)體制冷片來控制溫度的升降.

圖3 溫控系統(tǒng)原理圖

2.3 溫控系統(tǒng)PCB板的繪制與制作

根據(jù)上述的溫控系統(tǒng)原理圖，將各模塊匯總并設(shè)計成PCB板.該PCB板可通過設(shè)計的單片機接口，使用排插與我們選用的單片機(MSP430FR6989)緊密結(jié)合在一起，實現(xiàn)系統(tǒng)集成的同時，方便系統(tǒng)調(diào)試與改進優(yōu)化.系統(tǒng)的設(shè)計、制作過程以及最終的溫控系統(tǒng)硬件效果如圖4所示，最終得到的溫控系統(tǒng)符合小型化的預(yù)期要求.

圖4 溫控?zé)嵫h(huán)的PCB圖(A)、實物PCB板(B)和完成元件焊接后的PCB板對接單片機的效果圖(C)

2.4 溫控?zé)嵫h(huán)的實現(xiàn)

一次完整的PCR需要經(jīng)過重復(fù)多次升溫變性(90～96 ℃)、降溫退火(60～65 ℃)、恒溫延伸(70～75 ℃)等三個步驟，整個過程需要通過精確及時的溫控來控制反應(yīng)的進行，因此實現(xiàn)優(yōu)秀的溫控?zé)嵫h(huán)控制尤為關(guān)鍵.

2.4.1 主控制器的選型

溫控電路中進行控制的核心元件是主控制器.我們選用了TI公司推出的MSP430FR6989微控制器，其主頻可高達16 MHz，內(nèi)部具有靈活的時鐘配置系統(tǒng).在低功耗方面非常出色，而且價格低廉，體積小，接口豐富，便于設(shè)計配套外設(shè)電路.

2.4.2 溫度控制算法設(shè)計

完整的PCR過程涉及多個溫度階段，需要使得溫度變化階段盡量迅速，而維持溫度階段更加具有準確性與魯棒性.比例、積分、微分算法(PID算法)利用比例單元、積分單元和微分單元進行負反饋調(diào)控，被廣泛運用于工業(yè)控制領(lǐng)域，能夠使系統(tǒng)更加穩(wěn)定，其控制規(guī)律為：

(1)

其中，比例控件考慮當前的誤差，對產(chǎn)生的誤差進行實時的負反饋.積分控件考慮歷史累計誤差，主要用于消除余差，提高系統(tǒng)的無差度.微分控件考慮將來誤差，用比例系數(shù)和誤差的一階導(dǎo)數(shù)表示，對減少控制器短期變化，增加魯棒性具有很大幫助.

對上式離散化，即可得到數(shù)字PID控制算法，用求和代替積分，用一階后向差分代替微分，可得到第k次溫度采樣時的負反饋值.

(2)

本文選擇了MSP430系列的MSP43FR6989作為主控制器.儀器上電初始化后，就與上位機建立藍牙通訊，并等待參數(shù)設(shè)定和開始命令，并進入低功耗模式.當接收到新PCR擴增命令后，上位機通過藍牙將參數(shù)傳入到下位機主控制器，引發(fā)串口中斷，并開始PCR熱循環(huán)，直至達到設(shè)定循環(huán)數(shù).

3 上位機設(shè)計與實現(xiàn)

在本系統(tǒng)中，上位機應(yīng)承擔(dān)的作用有：人機交互、數(shù)據(jù)指令通訊、熒光圖像采集、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果輸出等.本系統(tǒng)選擇智能手機作為上位機，并在Android平臺設(shè)計開發(fā)了軟件，集成以上功能實現(xiàn)更為便捷友好的人機交互.

3.1 數(shù)據(jù)指令通訊

本文選擇藍牙通訊作為智能手機與單片機熱循環(huán)系統(tǒng)的通訊方式.這部分應(yīng)實現(xiàn)以下幾個功能：查看周圍藍牙設(shè)備列表，連接設(shè)備，發(fā)送指令、接收數(shù)據(jù)以及連接失敗等情況的處理等.

3.2 熒光圖像采集

下位機完成PCR的溫度熱循環(huán)后，調(diào)用手機相機對數(shù)字PCR熒光圖片進行成像，并將其存儲在手機中，用于后續(xù)的分析處理.

本系統(tǒng)選用了HUAWEI Mate 40智能手機的后置攝像頭進行熒光圖像的采集.實驗室之前的研究也采用Samsung Galaxy 7 Edge、HUAWEI Mate 8、HUAWEI Honor V10等型號的智能手機進行了相關(guān)測試[11]，均取得了很好的成像效果，證明本系統(tǒng)已經(jīng)能適配目前市面在售的大部分智能手機.

3.3 熒光圖像處理

在微流控芯片上進行PCR，所得的熒光圖像如圖5所示.其中的亮點即為陽性小室.熒光定量PCR檢測的結(jié)果與諸多因素相關(guān)，目前對PCR的熒光圖像進行處理的方法有基于機器學(xué)習(xí)的檢測方法[11-12]與經(jīng)典的基于機器視覺的閾值分割方案[13-17].兩種方法各有所長，均已被證明能夠達到很好的檢測效果.

圖5 微流控芯片上完成PCR過程所得的熒光圖像

其中，基于機器學(xué)習(xí)的熒光圖像檢測方法在處理熒光亮度均勻性差和噪聲雜點多的熒光圖像方面具有更加優(yōu)秀的表現(xiàn).但與此同時，這種方案的模型可解釋性差，檢測精度十分依賴模型的訓(xùn)練效果，也存在著誤判與過擬合等風(fēng)險.基于機器視覺的方法在熒光圖像處理領(lǐng)域十分經(jīng)典，已經(jīng)受到了廣泛的認可，它通過對圖像的校正、濾波、反應(yīng)腔室定位、閾值分割與亮點計數(shù)等過程，也很好地起到了突出圖像有效細節(jié)，排除干擾，提高檢測準確性的效果.

本文采用了基于機器視覺的自適應(yīng)閾值分割方法，基于OpenCV處理所拍攝的圖片，進行圖像裁剪與校正、通道分離、去除雜點、閾值分割、輪廓檢測等操作，最終計算出陽性小室的數(shù)量，完成了數(shù)字PCR的精確定量.

如圖6所示，首先將圖像裁剪為圖6(A)所示包含4 096個腔室的區(qū)域，然后將綠色通道從紅色通道和藍色通道中分離出來.之后，使用top-hat filter對背景進行近似并相減，去除背景后如圖6(B)所示.然后使用自適應(yīng)閾值化方案定義閾值，將圖像轉(zhuǎn)換為二值圖像，如圖6(C)所示，用白色表示陽性小室.最后，采用形態(tài)學(xué)方法將雜點進行移除[圖6(D)],并用輪廓檢測工具對圖像進行分析，就可以計算出陽性小室的數(shù)量，進而得到樣本中靶標分子的濃度.

圖6 熒光圖像處理過程

通過上述過程可以得到陽性小室數(shù)量，由于單個小室中可能存在多個陽性DNA分子，因此需要通過統(tǒng)計學(xué)方法，使用泊松分布對結(jié)果進行校正：

(3)

其中，n代表每個小室的DNA拷貝數(shù)；λ代表DNA總數(shù)與反應(yīng)小室之間的比率.每個小室至少有一個DNA分子的概率可表示為：

f0=P(n>0,λ)=1-P(n=0,λ)=1-e-λ

(4)

因此可計算真實的陽性DNA分子數(shù)：

(5)

陽性DNA分子濃度即為：

(6)

其中，countreal表示泊松分布校正后的DNA總數(shù)；counttotal表示小室總數(shù)(4 096)；countgoal表示圖像檢測得到的陽性小室數(shù).

3.4 上位機軟件設(shè)計

為了實現(xiàn)更為方便的人機交互與數(shù)據(jù)通訊，使系統(tǒng)更加智能化、集成化，本系統(tǒng)在Android平臺設(shè)計了軟件，軟件的操作流程如下：首先選擇一個新測試.選擇核酸擴增反應(yīng)類型(如變溫擴增、等溫擴增等)，藍牙連接手機和下位機設(shè)備，發(fā)出指令，啟動溫控?zé)嵫h(huán)反應(yīng)，控制微流控芯片內(nèi)的樣本進行核酸擴增.反應(yīng)結(jié)束后，對數(shù)字PCR芯片進行熒光成像.對得到的熒光圖片進行閾值分割處理與結(jié)果檢測.輸入反應(yīng)樣本體積，即可得出PCR的定量結(jié)果.

4 結(jié)論

針對目前市場上的商業(yè)數(shù)字PCR儀造價昂貴、體積冗余等缺點，基于智能手機與微流控芯片，作者設(shè)計開發(fā)了一種低成本、高集成的智能數(shù)字PCR系統(tǒng).本文從基本的硬件選型出發(fā)，呈現(xiàn)了完整數(shù)字PCR儀的搭建過程，并設(shè)計搭建溫控系統(tǒng)，采用PID控制算法實現(xiàn)了可靠的PCR溫控?zé)嵫h(huán).最后，使用傳統(tǒng)機器視覺的方法，對微流控芯片上PCR過程得到的熒光圖像進行了處理，成功得到了精確定量的核酸檢測結(jié)果.