陳偉杰，吳浪浪，彭玖燕，梁超男，賀廷貴，吳楚珍，唐文超

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽500025； 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽 500025； 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 500025)

地方性氟中毒是因為人們長期生存在較高濃度氟暴露下，通過飲水、空氣和食物等媒介過量攝入氟化物而致全身慢性積累性中毒，即慢性氟中毒[1]。研究結(jié)果表明，氟中毒可造成骨相損害，其典型臨床癥狀為氟斑牙與氟骨癥[2]。研究者發(fā)現(xiàn)，氟化物還可對非骨相系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損害，如肝臟等[3]。蔡宇等[4]在慢性氟中毒對大鼠肝、腎組織中Nrf2基因表達(dá)影響的研究中指出，氟導(dǎo)致肝、腎損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)有著密切的關(guān)系。氟中毒的防治目前暫無特效藥，但近年來有關(guān)中醫(yī)藥拮抗氟中毒所致危害成為研究的熱點[5]。王飛清等[6]采用不同劑量天冬灌胃治療氟中毒大鼠，結(jié)果顯示，大鼠抗氧化能力得到提升，有效緩解了氟中毒帶來的損傷。小柴胡湯源于漢代張仲景所著《傷寒雜病論》，為中醫(yī)十大名方之一。藥理研究結(jié)果顯示，小柴胡湯具有抑制炎癥、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗肝纖維化以及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功能[7]。相關(guān)研究結(jié)果已證實氟中毒導(dǎo)致肝損傷的作用機制主要與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[8-9]。小柴胡湯可通過抗氧化等作用緩解氧化應(yīng)激所引起的肝損傷[10]。也有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小柴胡湯對肝損傷有很好的保護(hù)作用，其作用機制可能與所含中藥提取物的抗氧化及清除自由基等作用有關(guān)[11-12]。因此，本研究旨在觀察小柴胡湯對慢性氟中毒所致肝損傷的保護(hù)作用，并探討其是否通過抗氧化作用進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激達(dá)到保護(hù)肝的作用，為地方性氟中毒的預(yù)防和治療提供重要的理論基礎(chǔ)，也為傳統(tǒng)中藥小柴胡湯提供更廣闊的應(yīng)用空間。

1 材料

1.1 動物

健康雄性SD大鼠40只，體重(200±5)g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(湘)2019-0014]。飼養(yǎng)于動物設(shè)施中，溫度為(25±2)℃，濕度為(60±1)%，暗/光周期為12 h，所有大鼠均喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料和干凈的水。

1.2 儀器

RM2245型石蠟切片機(德國Leica公司)；KD-BM型石蠟包埋儀(上海卓的儀器設(shè)備有限公司)；ChemidocTMXRS型恒溫水浴鍋(河南省艾瑞德儀器設(shè)備有限公司)；0180511086型分析天平(上海力辰儀器科技有限公司)，F(xiàn)ORMA8800型-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；DP73+standard型光學(xué)顯微鏡(CCD照相系統(tǒng))；C21-WK2102型微波爐(廣東美的電器股份有限公司)；75004250型高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；ISKANMK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；F10型勻漿機(美國Dremel公司)。

1.3 藥品與試劑

柴胡、半夏、黃芩、生姜、黨參、大棗和甘草均購自貴州一品藥業(yè)有限公司；氟化鈉購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司(NaF，分析純，批號：CB/T 1266-2006)；0.9%氯化鈉溶液購自廣州美緹生物科技有限公司。蘇木精-伊紅(HE)染色、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)等試劑盒均購自南京建成生物有限公司。

2 方法

2.1 藥物制備

小柴胡湯組方為：柴胡24 g，黃芩9 g，黨參9 g，炙甘草9 g，生姜(切)9 g，大棗12 g，法半夏9 g。小柴胡湯藥味用量設(shè)置均按照高等醫(yī)藥院校教材《傷寒論》中的中藥劑量，依據(jù)大鼠體重計算灌胃藥量，大鼠每日灌胃給藥小柴胡湯7.29 g/kg相當(dāng)于人日用量[13]。將上述7味藥放入砂鍋，適量水煎，大火煎沸后，再用小火煎20～30 min；第1次煎30 min，第2次煎煮20 min，除去渣合并2次藥液，濃縮藥液至所需濃度，再將中藥湯液放入冰箱保鮮層5 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物分組及給藥

40只健康雄性大鼠按體重隨機分為空白對照組、模型組、小柴胡湯實驗組和小柴胡湯陰性對照組4組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，空白對照組、小柴胡湯陰性對照組大鼠用蒸餾水喂養(yǎng)；模型組、小柴胡湯實驗組大鼠用100 mg/L的NaF溶液喂養(yǎng)，建立慢性氟中毒大鼠模型。小柴胡湯實驗組、小柴胡湯陰性對照組大鼠分別用小柴胡湯中藥湯液灌胃，空白對照組、模型組大鼠則分別灌胃等劑量0.9%氯化鈉溶液。持續(xù)灌胃90 d(每日1次)后，禁食12 h后將大鼠麻醉，腹主動脈取血，獲得血液樣本，置于冰上迅速解剖取出肝臟，記錄大鼠體重和臟器重量，計算臟器指數(shù)(臟器濕重/體重×100%)，分裝置于液氮中冷凍保存。

2.3 HE染色法觀察肝臟組織病理形態(tài)變化

取同一部位的新鮮肝臟樣本用4%多聚甲醛溶液固定，并采用常規(guī)石蠟技術(shù)進(jìn)行加工。切下4 μm厚的切片，常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理觀察并拍照。

2.4 微板法檢測血清ALT和AST水平

AST、ALT常用于反映肝細(xì)胞損傷程度，可作為評價肝細(xì)胞壞死的重要指標(biāo)。取血液樣本于室溫(25 ℃)靜置2 h后，1 500 r/min離心10 min，分取血清，按試劑盒說明書檢測ALT、AST酶學(xué)水平，實驗采用3個生物重復(fù)，取平均值，最終數(shù)據(jù)以U/L表示。

2.5 檢測MDA、T-SOD水平

MDA和SOD是評估人體抗氧化狀態(tài)的重要指標(biāo)，兩者活力水平反映抗氧化能力和抵御自由基損傷的能力。采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測MDA水平，微板法檢測T-SOD水平。取各組大鼠新鮮相同部位肝臟標(biāo)本，在液氮中制備制成10%的勻漿。勻漿以3 500 r/min低溫(4 ℃)離心10 min后取上清液，蛋白定量后，按試劑盒說明書檢測肝臟組織中MDA和T-SOD水平，實驗采用3個生物重復(fù)，取平均值，最終數(shù)據(jù)表示為nmol/mg蛋白和U/mg蛋白。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19. 0軟件進(jìn)行分析，當(dāng)數(shù)據(jù)方差一致時，進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小柴胡湯對大鼠肝臟指數(shù)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)均明顯增大；與模型組比較，小柴胡湯實驗組大鼠肝臟指數(shù)均顯著減小，上述差異均有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

單因素方差分析，與空白對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01

3.2 小柴胡湯對大鼠肝組織病理學(xué)的影響

空白對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰且完整，肝索排列較為正常，中央靜脈內(nèi)皮完整，中央靜脈周圍的肝細(xì)胞排列成索狀，形態(tài)正常，未見明顯變性壞死，肝竇結(jié)構(gòu)正常，未見明顯淤血擴張及炎癥細(xì)胞浸潤，見圖2(A)。模型組大鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝索斷裂，肝細(xì)胞點狀壞死，見胞核固縮、崩解，胞質(zhì)溶解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，并伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤，以核呈圓形深染的淋巴細(xì)胞和核呈桿狀的中性粒細(xì)胞為主，肝竇內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，見圖2(B)。小柴胡湯實驗組大鼠肝臟病變范圍與嚴(yán)重程度較模型組有明顯改善，見圖2(C)。小柴胡湯陰性對照組大鼠肝細(xì)胞排列較整齊，肝細(xì)胞形態(tài)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)較為完整，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤及變性壞死，見圖2(D)。

A.空白對照組；B.模型組；C.小柴胡湯實驗組；D.小柴胡湯陰性對照組；實線箭頭指點狀壞死，虛線箭頭指炎癥細(xì)胞浸潤

3.3 小柴胡湯對大鼠血清 ALT、AST水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST水平明顯升高，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重；與模型組比較，小柴胡湯實驗組大鼠血清ALT、AST水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

3.4 小柴胡湯對大鼠肝組織 MDA、T-SOD水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織MDA、T-SOD水平明顯升高；與模型組比較，小柴胡湯實驗組大鼠肝組織MDA、T-SOD水平明顯降低，上述差異均有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

A.MDA；B.T-SOD；單因素方差分析，與空白對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01

4 討論

地方性氟中毒是由于長期暴露于無機氟化物引起的，尋找對地方性氟中毒有效的防治藥物意義重大。研究結(jié)果表明，氧化應(yīng)激是在內(nèi)源性、外源性條件刺激下產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，損害肝細(xì)胞，氧化應(yīng)激參與多種肝病的發(fā)生和發(fā)展，與氟中毒所致肝損傷密切相關(guān)[14]。小柴胡湯為臨床常用方劑，可在對抗氧化應(yīng)激所致肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用[15]。然而，小柴胡湯是否能對氟中毒所致肝損傷起到緩解作用，目前還未見相關(guān)報道。本研究旨在探討小柴胡湯能否緩解氟中毒所致肝損傷，為其預(yù)防和治療地方性氟中毒的臨床應(yīng)用提供重要的理論基礎(chǔ)。

ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，肝損傷后，肝細(xì)胞膜的通透性增加以及細(xì)胞裂解后內(nèi)容物的流出，均可導(dǎo)致血清AST、ALT水平升高[16-17]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組大鼠血清ALT、AST水平顯著升高，說明慢性氟中毒能引起肝細(xì)胞損傷。景書壇[18]在沙棘多糖預(yù)防飲水型氟中毒肝損傷機制的研究中發(fā)現(xiàn)，在氟中毒狀態(tài)下AST、ALT水平顯著升高，與本研究結(jié)果一致。經(jīng)小柴胡湯干預(yù)，可使大鼠AST、ALT水平降低，表明小柴胡湯對慢性氟中毒所致肝細(xì)胞損傷具有緩解作用。李晶晶等[11]在小柴胡湯及其拆方的抗肝細(xì)胞損傷效果的研究中發(fā)現(xiàn)，小柴胡湯可有效緩解CCl4所致肝細(xì)胞損傷，顯著降低AST和ALT水平，與本研究結(jié)果相符。此外，本研究組織病理學(xué)觀察結(jié)果也顯示，慢性氟中毒可引起大鼠肝損傷，而小柴胡湯可在一定程度上減輕肝損傷，這與ALT和AST水平變化結(jié)果也一致。

MDA為自由基攻擊體內(nèi)脂質(zhì)所生成的產(chǎn)物，是脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)，可間接反映氧自由基含量的變化。SOD是人體內(nèi)最重要的抗氧化酶，能有效清除氧自由基，減少細(xì)胞的氧化損傷[19-20]。因此，SOD和MDA活力水平反映機體抗氧化能力和抵御氧自由基損傷的能力。本研究中，與對照組相比，模型組大鼠的SOD水平和MDA含量顯著升高，說明在氧化應(yīng)激狀態(tài)下大鼠機體的抗氧化平衡可能被打破，大量自由基攻擊體內(nèi)脂質(zhì)所生成的產(chǎn)物MDA大量堆積，在大量自由基刺激下機體SOD水平升高，但仍不能及時清除體內(nèi)自由基，造成大鼠肝臟氧化損傷。薛宏慧[21]在3-硝基丙酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下小鼠抗氧化酶含量變化的研究中發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，MDA含量和SOD水平均呈顯著升高，與本研究結(jié)果一致。當(dāng)給予小柴胡湯干預(yù)后，大鼠MDA含量、SOD水平降低，表明小柴胡湯可能是通過抑制體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，增強清除自由基的能力，從而使得肝臟氧化應(yīng)激損傷得到緩解。

綜上所述，本研究結(jié)果證實了慢性氟中毒可引起肝損傷，小柴胡湯對慢性氟中毒所致肝損傷具有一定的緩解作用。小柴胡湯對慢性氟中毒所致肝損傷的保護(hù)作用機制可能是通過抑制氧化應(yīng)激途徑，提高機體消除自由基的能力，減少MDA的生成，從而減輕氧化應(yīng)激所致肝細(xì)胞損傷，起到保護(hù)肝臟的作用。