彭 景，徐蘭真

圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知紊亂(perioperative neurocognitive disorder，PND)是圍術(shù)期發(fā)生的以學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能下降為主要表現(xiàn)的神經(jīng)精神并發(fā)癥，發(fā)生率約為10%。老年患者術(shù)后1周PND發(fā)病率可達(dá)25.80%，約為青年患者10倍以上。PND發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。越來(lái)越多證據(jù)顯示，麻醉應(yīng)激反應(yīng)是PND的重要誘因。異氟醚具有血/氣分布系數(shù)小、麻醉誘導(dǎo)平穩(wěn)、迅速且舒適、肝臟代謝率低等優(yōu)點(diǎn)，為目前臨床常用的吸入性全身麻醉藥物。但近年臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，異氟醚可通過(guò)抑制突觸前膜對(duì)興奮性遞質(zhì)谷氨酸釋放，增加突觸后膜對(duì)谷氨酸攝取，改變N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸受體亞基構(gòu)成，進(jìn)而影響相關(guān)記憶形成過(guò)程。星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)分布最廣泛的腦細(xì)胞，亦是體積最大的膠質(zhì)細(xì)胞。既往研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)調(diào)節(jié)突觸可塑性，與神經(jīng)元形成代謝偶聯(lián)，維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與PND發(fā)生密切相關(guān)。本研究旨在探討異氟醚是否通過(guò)調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞活化對(duì)圍術(shù)期小鼠神經(jīng)認(rèn)知功能影響，為防治PND提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠 80只，SPF級(jí)，雄性，16月齡，平均體質(zhì)量(44.69±1.32)g，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2019-0004。分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，環(huán)境溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照/黑暗各12 h，自由飲食和飲水。

1.1.2 試劑與儀器 異氟醚(國(guó)藥準(zhǔn)字X19990127)：美國(guó)Abbott Laboratories公司。RIPA裂解液(貨號(hào)XG-R95815)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)XG-X6561)：上海西格生物科技有限公司。Triton X-100溶液(貨號(hào)R00284)：北京雷根生物技術(shù)有限公司。小鼠BCA蛋白ELISA試劑盒(貨號(hào)YT14144)、山羊血清(貨號(hào)YT2517)：北京伊塔生物科技有限公司。小鼠抗TNF-α單克隆抗體(貨號(hào)ab1793)、小鼠抗IL-6單克隆抗體(貨號(hào)ab9324)、小鼠抗Caspase-3單克隆抗體(貨號(hào)ab208161)、兔抗β-actin多克隆抗體(貨號(hào)ab8227)、小鼠抗GFAP單克隆抗體(貨號(hào)ab279290)、山羊抗小鼠IgG H&L二抗(貨號(hào)ab96879)：美國(guó)Abcam公司。DAPI染液(貨號(hào)EY19202)：上海一研生物科技有限公司。小鼠IgG-ECL顯色試劑盒(貨號(hào)SW2010)：北京索萊寶科技有限公司。水迷宮：上海玉研儀器公司，內(nèi)徑120 cm，高50 cm，站臺(tái)直徑6～9 cm。激光共聚焦顯微鏡(型號(hào)SP8 X)：北京德利卡生物技術(shù)有限公司。全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(型號(hào)ZF-288)：上海金鵬分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、2%異氟醚組、手術(shù)組、2%異氟醚+手術(shù)組，每組20只。對(duì)照組小鼠以4%水合氯醛，腹腔注射，0.2 ml/20 g，吸入30% O-空氣2 h，假手術(shù)。2%異氟醚組小鼠以4%水合氯醛，腹腔注射，0.2 ml/20 g，吸入30% O-空氣和2%異氟醚2 h，假手術(shù)。手術(shù)組小鼠以4%水合氯醛，腹腔注射，0.2 ml/20 g，吸入30% O-空氣2 h，行脛骨骨折切開(kāi)復(fù)位固定術(shù)。2%異氟醚+手術(shù)組小鼠以4%水合氯醛，腹腔注射，0.2 ml/20 g，吸入30% O-空氣和2%異氟醚2 h，行脛骨骨折切開(kāi)復(fù)位固定術(shù)。

1.2.2 術(shù)后認(rèn)知功能 通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠術(shù)后1、3、7 d認(rèn)知功能。水池內(nèi)注入25 ℃溫水，水深25 cm，平臺(tái)低于水面1 cm以上；將小鼠置于隨機(jī)象限，術(shù)前1 d訓(xùn)練小鼠站臺(tái)，隨后記錄術(shù)后1、3、7 d小鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間，即為逃避潛伏期，以及小鼠在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間，即為目標(biāo)象限停留時(shí)間；實(shí)驗(yàn)期間保持環(huán)境安靜，避免干擾其活動(dòng)。

1.2.3 標(biāo)本采集 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，4%水合氯醛，腹腔注射，麻醉后斷頸處死小鼠，取完整腦組織；冰上分離雙側(cè)海馬組織，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 蛋白免疫印跡法 取海馬組織，RIPA溶液裂解組織，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量；取40 μg蛋白樣品，SDS-PAGE電泳后，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h；分別滴加TNF-α、IL-6和Caspase-3抗體，1∶2000，內(nèi)參為β-actin，1∶45 000，4 ℃過(guò)夜孵育；TBST洗膜2次，每次5 min；ECL法顯影，凝膠成像系統(tǒng)觀察，Image J軟件定量分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 免疫熒光染色 取海馬組織，4%多聚甲醛固定48 h，0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液漂洗30 min；常規(guī)制備石蠟切片，厚度5 μm；二甲苯脫蠟，乙醇溶液梯度水化，擦拭切片周?chē)后w；免疫組化筆距離組織2 mm處畫(huà)圈；置于0.4%Triton X-100溶液中，室溫孵育10 min，PBS溶液沖洗3次，每次5 min；修復(fù)抗原，高壓鍋加熱至限壓閥冒氣90 s，冷水降壓，自然冷卻后，PBS溶液沖洗3次，每次5 min；滴加5%山羊血清，37 ℃封閉10 min；滴加小鼠GFAP單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜孵育；滴加山羊抗小鼠IgG H&L二抗，37 ℃避光孵育1～2 h；棄去抗體反應(yīng)液，置于脫色搖床上，PBS溶液沖洗3次，每次5 min；阻水圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光孵育5 min；PBS溶液沖洗3次，每次5 min；90%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡(400×)下觀察GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并拍照。

1.2.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取海馬組織石蠟切片，依次脫蠟、水化；置于蛋白酶K工作液，室溫反應(yīng)15～30 min；滴加TUNEL反應(yīng)液，室溫避光孵育60 min；PBS溶液沖洗3次，每次5 min；熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠術(shù)后認(rèn)知功能比較 術(shù)后1、3、7 d，與對(duì)照組比較，2%異氟醚組和手術(shù)組小鼠逃避潛伏期顯著增加，目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著縮短(<0.05)；術(shù)后1、3、7 d，與2%異氟醚組和手術(shù)組比較，2%異氟醚+手術(shù)組小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著減少(<0.05，表1)。

2.2 小鼠術(shù)后海馬組織炎性反應(yīng)和凋亡相關(guān)因子水平比較 術(shù)后1、3、7 d，與對(duì)照組比較，2%異氟醚組和手術(shù)組小鼠海馬組織TNF-α、IL-6和Caspase-3表達(dá)水平顯著升高(<0.05)；術(shù)后1、3、7 d，與2%異氟醚組和手術(shù)組比較，2%異氟醚+手術(shù)組小鼠海馬組織TNF-α、IL-6和Caspase-3表達(dá)水平均顯著升高(<0.05，表2)。

2.3 小鼠術(shù)后海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況比較 術(shù)后1、3、7 d，與對(duì)照組比較，2%異氟醚組和手術(shù)組小鼠海馬組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(<0.05)；術(shù)后1、3、7 d，與2%異氟醚組和手術(shù)組比較，2%異氟醚+手術(shù)組小鼠海馬組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(<0.05，表3，圖1)。

2.4 小鼠術(shù)后海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比較 術(shù)后1、3、7 d，與對(duì)照組比較，2%異氟醚組和手術(shù)組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著增高(<0.05)；術(shù)后1、3、7 d，與2%異氟醚組和手術(shù)組比較，2%異氟醚+手術(shù)組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著增高(<0.05，表4)。

3 討 論

PND是麻醉手術(shù)后常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶、注意力等認(rèn)知功能下降。大多學(xué)者認(rèn)為，神經(jīng)炎性反應(yīng)和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化是PND發(fā)生以及進(jìn)展的重要原因。異氟醚是一種臨床常用的吸入性麻醉藥物，其麻醉效能介于氟烷和安氟醚間，安全性和可控性相對(duì)較高。但研究發(fā)現(xiàn)，異氟醚吸入麻醉過(guò)程中，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用，且抑制程度與吸入濃度呈顯著正相關(guān)。馮海妹等發(fā)現(xiàn)，異氟醚麻醉可通過(guò)激活糖原合成酶激酶-3β活性，誘發(fā)老齡大鼠認(rèn)知功能障礙和炎性反應(yīng)。Miao等亦發(fā)現(xiàn)，異氟醚和手術(shù)可降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸后密度-95、突觸素和三磷酸腺苷水平，增加Barnes迷宮探針試驗(yàn)的逃逸潛伏期和逃逸距離，導(dǎo)致小鼠大腦能量不足進(jìn)而引發(fā)認(rèn)知障礙。

馬斌等分析了不同濃度和作用時(shí)間異氟醚對(duì)幼年小鼠神經(jīng)功能影響發(fā)現(xiàn)，相較于1.5%異氟醚，2%異氟醚吸入麻醉2 h可顯著引起小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)認(rèn)知功能損傷。故本研究采用2%異氟醚作為實(shí)驗(yàn)劑量，進(jìn)一步分析異氟醚對(duì)圍術(shù)期小鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是研究空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)功能的方法。秦起等發(fā)現(xiàn)，麻醉手術(shù)可引起大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間顯著縮短。本研究中，術(shù)后1、3、7 d，與對(duì)照組比較，2%異氟醚組和手術(shù)組小鼠逃避潛伏期顯著增加，目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著減少，符合以往研究結(jié)果，提示麻醉和手術(shù)應(yīng)激可引起圍術(shù)期小鼠認(rèn)知功能下降；而與2%異氟醚組和手術(shù)組比較，2%異氟醚+手術(shù)組小鼠術(shù)后1、3、7 d逃避潛伏期進(jìn)一步增加，目標(biāo)象限停留時(shí)間進(jìn)一步減少，提示異氟醚吸入麻醉具有加重小鼠認(rèn)知功能下降作用。

麻醉藥物對(duì)機(jī)體代謝具有一定影響，可誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)。文獻(xiàn)[16]報(bào)道，異氟醚麻醉下行肝部分切除術(shù)可導(dǎo)致老年大鼠海馬炎性反應(yīng)。有研究報(bào)道，異氟醚麻醉下行肝部分切除術(shù)可導(dǎo)致老年大鼠海馬炎性反應(yīng)。Miles等發(fā)現(xiàn)，異氟醚吸入麻醉可導(dǎo)致顱內(nèi)手術(shù)患者腦脊液TNF-α和IL-6等炎性因子水平顯著升高，并在術(shù)后神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1、3、7 d，與對(duì)照組比較，2%異氟醚組和手術(shù)組小鼠海馬組織TNF-α、IL-6和Caspase-3表達(dá)水平和海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著升高，符合以往研究結(jié)果，提示麻醉和手術(shù)應(yīng)激可誘發(fā)機(jī)體炎性反應(yīng)及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡；而與2%異氟醚組和手術(shù)組比較，2%異氟醚+手術(shù)組小鼠術(shù)后1、3、7 d海馬組織TNF-α、IL-6和Caspase-3表達(dá)水平和海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，且海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞減少，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，表明異氟醚吸入麻醉可加重圍術(shù)期小鼠神經(jīng)炎性反應(yīng)及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡水平，機(jī)制可能與促進(jìn)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。

綜上所述，異氟醚吸入麻醉可引起圍術(shù)期小鼠認(rèn)知功能下降，其機(jī)制可能與促進(jìn)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，加重神經(jīng)炎性反應(yīng)水平有關(guān)。線粒體是細(xì)胞物質(zhì)和能量代謝的中心，線粒體能量代謝紊亂亦是導(dǎo)致PND發(fā)生的重要因素。本研究未驗(yàn)證和探討異氟醚對(duì)線粒體能量代謝的影響及其機(jī)制，擬在今后研究中進(jìn)一步分析。