靳貴林，邊 洋，，3，邵士俊，楊扶德

1 西藏藏醫(yī)藥大學(xué)藏醫(yī)藥基礎(chǔ)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，西藏 拉薩 850000；2 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所；3 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

紋黨來源于桔梗科植物素花黨參Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta（Nannf.）L.T.Shen干燥根，主產(chǎn)于年平均氣溫15℃、年平均降雨量445 mm，平均海拔1500～2500 m，地處西秦嶺山脈、南秦嶺山帶的甘肅文縣中寨，質(zhì)量優(yōu)異遠(yuǎn)銷海外。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)具有抗癌、抗氧化、抗炎、保肝、抗血栓形成、舒張血管、抗病毒、抗菌和抗過敏等多種藥理活性［1-2］。黃愛玲［3］研究發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)有降血脂、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫力的作用。黃酮類化合物可以有效抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸釋放，從而保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)［4］。黃酮類化合物異甘草素通過改善腦能量代謝和抗氧化作用有效保護(hù)大腦以防腦損傷［5］。龔金炎［6］從神經(jīng)遞質(zhì)說、神經(jīng)可塑性假說和內(nèi)分泌系統(tǒng)功能改變方面研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物有抗抑郁癥作用。現(xiàn)代研究［7-8］發(fā)現(xiàn)黨參黃酮類可促進(jìn)大鼠小腸上皮細(xì)胞遷移。汪建紅［9］研究發(fā)現(xiàn)野生新疆黨參總黃酮能增強(qiáng)小鼠血清和肝臟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，延長小鼠負(fù)重游泳時間，提高肝糖原、肌糖原儲備量，降低小鼠運(yùn)動后血清尿素氮含量?？梢姡S酮類化合物有重要的藥理藥效作用，而紋黨品質(zhì)形成研究中黃酮類化合物的研究成為不可或缺的一部分。

1 材料

1.1 儀器超聲儀器（江蘇昆聲市超聲儀器有限公司；220v、100W，Q/320583GSFY008-2006）；紫外分光光度計（perkin Elmer lambda 35）；錐形瓶（50 mL）；容量瓶（100、50、25 mL）；燒杯（50mL、100、250、500 mL）。

1.2 藥材試劑紋黨和白條黨經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為正品；乙醇（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號：20150706）；蘆?。ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號：100080-201409）；亞硝酸鈉（上海山浦化工有限公司，批號：20110412）；氫氧化鈉（利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司，批號：20100312）；硝酸鋁（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20150202）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備精密稱取過40 目篩60℃下干燥2 h的紋黨2.0 g置于50 mL錐形瓶中，加75%乙醇40 mL，超聲提取90 min 后過濾，濾液置于50 mL 容量瓶，用75%乙醇定容于50 mL 容量瓶，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取蘆丁10 mg，置于250 mL 燒杯中加75%乙醇30 mL 超聲使蘆丁溶解，溶解液置于50 mL 容量瓶，用75%乙醇洗滌燒杯并轉(zhuǎn)移洗滌液入50 mL 容量瓶，加入75%乙醇定容，即得0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（對照品溶液）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密取0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1、2、3、4、5 mL分別置于25 mL容量瓶，各容量瓶加入1 mL 新配5%亞硝酸鈉溶液，混合均勻后靜置6 min；加入1 mL 新配10%硝酸鋁溶液，混合均勻后靜置6 min；加入10mL 新配5%氫氧化鈉溶液，搖勻后用75%乙醇定容，靜置20 min。以75%乙醇為空白組，在510 nm處測定吸光度（見表1），以體積（mg/mL）為橫坐標(biāo)X，吸光度（A）為縱坐標(biāo)Y軸，建立直線方程得Y=2.75908X-0.00602，r=0.9994，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值

圖1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度實(shí)驗取0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL加入到25 mL容量瓶中，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。結(jié)果RSD值小于2%，精密度較好。見表2。

表2 精密度考察結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗3 支25 mL 容量瓶中分別精密加0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。分別于30 min及1、2、4、8、10、12 h，510 nm 處測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中含蘆丁質(zhì)量（mg）。結(jié)果表明0～10 h 內(nèi)RSD=3.9，在0～2 h 內(nèi)其值較穩(wěn)定。見表3。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.6 重復(fù)性實(shí)驗精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2 h 的紋黨2.0 g 置于50 mL 錐形瓶中，平行5次，按“1.3.1”項下制備，取供試品2 mL于25 mL容量瓶，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度，計算出供試品溶液中蘆丁質(zhì)量。結(jié)果表明RSD值小于2%，重現(xiàn)性較好。見表4。

表4 重現(xiàn)性考察結(jié)果

2.7 加樣回收實(shí)驗精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2 h 的紋黨1.0 g 置于100 mL 錐形瓶中，平行5 次，按“1.3.1”項下方法制備后定容于50 mL容量瓶，為供試品溶液。5 個25 mL 容量瓶中分別加入供試品溶液2 mL，加入0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度，計算總黃酮含量（以蘆丁計）。結(jié)果顯示平均回收率為96.06%，回收率較為穩(wěn)定可靠。見表5。

表5 加樣回收考察結(jié)果

2.8 條件優(yōu)化

2.8.1 條件選擇 本實(shí)驗選用2015 版《中華人民共和國藥典》槐花項下總黃酮測定方法，加入新配5%亞硝酸鈉1 mL，混合均勻后靜置6 min；加入新配10%硝酸鋁1 mL，混合均勻后靜置6 min；加入新配5%氫氧化鈉10 mL，靜置15 min，顯色。超聲提取總黃酮是一種高效簡便不破壞化學(xué)成分的提取方法［10-12］。葛亮［13］研究發(fā)現(xiàn)用超聲提取黃酮類化合物，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色測定總黃酮含量是一種簡便可靠易行的方法。而黃酮類化合物回流提取時有所損失故而本實(shí)驗采取超聲提取方法，由于亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色較穩(wěn)定可靠因而采取該顯色方法測定總黃酮含量。

2.8.2 提取溶劑選擇 精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2 h的紋黨5份，每份2.0 g，1份加50 mL甲醇，1 份加75%乙醇50 mL，超聲提取90 min，平行試驗3 次，將濾液定容于50 mL 容量瓶作為供試品溶液待用。取供試品溶液2 mL 置于25 mL 容量按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。計算總黃酮含量（以蘆丁計）。結(jié)果顯示甲醇提取效率更高，選擇甲醇為提取溶劑。見表6。

表6 提取溶劑考察結(jié)果

2.8.3 超聲提取時間選擇 精密稱取6份過40目篩，60℃下干燥2 h 的11 月份紋黨2.0 g 并編號，各加入75%乙醇40 mL，1 號超聲30 min、2 號超聲45 min、3號超聲60 min、4號超聲75 min、5號超聲90 min、6號超聲120 min，平行試驗3次，濾液定容于50 mL容量瓶作為供試品溶液，待用。精密量取供試品溶液2 mL 置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。計算總黃酮含量（以蘆丁計）。結(jié)果顯示超聲提取120 min含量最大，但75、90、120 min所含總黃酮含量做曲線可知90～120 min趨于平衡狀態(tài)，綜合考慮選取90 min。見表7。

表7 提取時間考察結(jié)果

2.9 供試品黃酮含量測定

2.9.1 紋黨參黃酮含量測定 精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2 h的供試藥材各5份，每份2.00 g，加入75%乙醇40 mL，超聲提取90 min，過濾，濾液定容于50 mL 容量瓶為供試品溶液待用。精密量取供試品溶液2 mL 置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。在510 nm處測定吸光度，計算總黃酮含量。見表8。

表8 紋黨總黃酮含量測定結(jié)果 mg/g

2.9.2 白條黨總黃酮含量測定 精密稱取過40目篩，60℃下干燥2 h 的白條黨各5 份，每份2.00 g，加入75%乙醇40 mL，超聲提取90 min，過濾，濾液定容于50 mL容量瓶為供試品溶液，待用。精密量取供試品溶液2 mL 置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。計算總黃酮含量（以蘆丁計）。見表9。

表9 白條黨總黃酮含量測定結(jié)果 mg/g

2.10 數(shù)據(jù)分析分析不同月份采收的紋黨所含總黃酮與白條黨參所含總黃酮；紋黨在春季尚未萌發(fā)時其總黃酮含量由于尚未損耗，是全年紋黨黃酮含量的最高時期，也就是說紋黨總黃酮在大地解封之前含量高達(dá)2.937 mg/g；隨季節(jié)變遷溫度上升，5 月份紋黨開始發(fā)芽破土而出，其總黃酮含量下降到1.705 mg/g；隨著光合作用的加強(qiáng)和溫度上升，紋黨的生理活性在不斷增強(qiáng)，6月份總黃酮含量較5 月份的1.705 mg/g 上升到1.950 mg/g；7～8 月份紋黨生長最為旺盛，7 月份總黃酮含量達(dá)2.091 mg/g，8月份達(dá)2.001 mg/g；9月溫度開始下降紋黨總黃酮含量也開始下降，9 月份紋黨總黃酮含量由8月份2.001 mg/g下降到1.941 mg/g，10～11月份呈整體下降趨勢，11月紋黨總黃酮含量降到了全年最低1.575 mg/g；12月份后大地凍結(jié)紋黨采集困難。紋黨全年總黃酮含量平均值為2.002 mg/g，高于白條黨參（采收于9 月）的1.631 mg/g。從單一總黃酮含量講紋黨質(zhì)量較好。紋黨總黃酮含量全年呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。見圖2。

圖2 紋黨和白條黨參總黃酮含量比較

3 小結(jié)

從紋黨生長過程看，總黃酮含量出現(xiàn)了先下降后上升最后下降的趨勢。紋黨總黃酮含量7、8月最高，是紋黨生長較為旺盛的季節(jié)?？傸S酮含量的多少隨季節(jié)變遷而變化，春季紋黨尚未萌發(fā)時總黃酮含量最高，證明紋黨藥材“初春發(fā)芽前采收”的合理性。從黃酮含量角度分析，紋黨黃酮含量高于白條黨參，紋黨質(zhì)量較白條黨好。