梁英輝 穆丹 宋瑞清

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)(佳木斯大學(xué))(東北林業(yè)大學(xué))

當(dāng)前，保護(hù)生態(tài)環(huán)境已成為公眾共識(shí)，農(nóng)林業(yè)的農(nóng)藥使用追求低毒、低殘留。無(wú)害化、無(wú)農(nóng)藥殘留一直是生化領(lǐng)域?qū)＜业慕K極目標(biāo)，因此生物農(nóng)藥成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)[1-2]。厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)作為主要的線蟲生防菌之一，具有較大的生防潛力和廣闊的開(kāi)發(fā)前景[3]。該菌最顯著的特征是能產(chǎn)生厚垣孢子，厚垣孢子耐受能力很強(qiáng)，易在土壤中存活，雖會(huì)侵染植物根部表皮，但對(duì)其無(wú)致病性[4]。據(jù)報(bào)道，厚垣孢普可尼亞菌可以在白花三葉草(Trifoliumrepens)、紫丁香(Syringaoblata)、黑麥草(Loliumperenne)、亞麻(Linumusitatissimum)及其他植物根際中定殖[5-9]，且其在植物病蟲害防治工作中發(fā)揮重要作用，生防效果獲得普遍認(rèn)同。

目前，厚垣孢普可尼亞菌的生物制劑已被廣泛投入生產(chǎn)和生活，例如以厚垣孢普可尼亞菌為原料的線蟲必克微粒劑及微膠囊的研制[10]。不同厚垣孢普可尼亞菌菌株生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求和環(huán)境條件存在差異[11]，想要廣泛使用厚垣孢普可尼亞菌控制植物寄生線蟲，首先必須解決的問(wèn)題是獲得厚垣孢普可尼亞菌高生物量的不同產(chǎn)物。與分生孢子相比，厚垣孢子的產(chǎn)孢難度較高，相關(guān)的研究也比較少。國(guó)內(nèi)外學(xué)者雖然對(duì)該菌的液體、固體培養(yǎng)有一定的研究，但系統(tǒng)化的培養(yǎng)方法還未見(jiàn)報(bào)道[12]。由于液體發(fā)酵產(chǎn)物(菌絲和厚垣孢子)可以直接用于生物制劑的加工，故從大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的角度出發(fā)，綜合比較認(rèn)為液體發(fā)酵培養(yǎng)是提高厚垣孢普可尼亞菌生物量的最佳方法。

廣泛應(yīng)用厚垣孢普可尼亞菌進(jìn)行生物防治的首要前提是獲得其高生物量產(chǎn)物，摸清其液態(tài)發(fā)酵條件[13]。生防菌株不同，則生長(zhǎng)條件及產(chǎn)孢環(huán)境存在差異[14-17]。本研究探究了培養(yǎng)溫度、初始pH值、供氧量、接菌量對(duì)厚垣孢普可尼亞PC7菌株發(fā)酵液生物量的影響，并以此為基礎(chǔ)，獲得菌株P(guān)C7孢子與菌絲體產(chǎn)生的最佳條件，以期為未來(lái)大批量工業(yè)化培養(yǎng)厚垣孢普可尼亞菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株厚垣孢普可尼亞菌PC7由英國(guó)引進(jìn)，于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基制備

將200.0 g·L-1去皮馬鈴薯汁、20.0 g·L-1葡萄糖、3.0 g·L-1磷酸二氫鉀、1.5 g·L-1硫酸鎂、20.0 g·L-1瓊脂，高壓121 ℃滅菌20 min，室溫貯存[1]，用于制備改良PDA固體培養(yǎng)基。

將200.0 g·L-1去皮馬鈴薯汁、20.0 g·L-1葡萄糖、3.0 g·L-1磷酸二氫鉀、1.5 g·L-1硫酸鎂，高壓121 ℃滅菌20 min，室溫貯存[3]，用于制備改良PD液體培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)與孢子收集

將PC7菌種接種于PDA平板中心，24 ℃培養(yǎng)7 d，產(chǎn)孢后取15 mL雙蒸水洗脫孢子。采用血球計(jì)數(shù)器，每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)10次，將其制備成1×107個(gè)·mL-1的懸浮液，于4 ℃保存[18]。

1.3.2 菌株液態(tài)發(fā)酵條件的篩選

每個(gè)三角瓶(500 mL)中加入200 mL PD培養(yǎng)液，分別接種1 mL孢子懸浮液，不同溫度(20、22、24、26、28、30 ℃)條件下，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，在3、5、7 d進(jìn)行鏡檢、稱質(zhì)量，并確定菌絲干質(zhì)量，3次重復(fù)，以進(jìn)行最適溫度的篩選。

每個(gè)三角瓶(500 mL)中加入200 mL PD培養(yǎng)液，調(diào)配初始pH值為2、4、6、8、10、12、14。各接種1 mL孢子懸浮液，分別在24、30 ℃下，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)7 d。鏡檢、稱質(zhì)量，并確定菌絲干質(zhì)量，重復(fù)3次，以進(jìn)行最適初始pH值的篩選。

每個(gè)三角瓶(500 mL)中加入PD培養(yǎng)液(100、150、200、250、500 mL)，各接種1 mL孢子懸浮液，分別在24、30 ℃下，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，在3、5、7 d進(jìn)行鏡檢、稱質(zhì)量，并確定菌絲干重，重復(fù)3次，以進(jìn)行最適供氧條件的篩選。

每個(gè)三角瓶(500 mL)中加入200 mL PD培養(yǎng)液，分別接入0.05、0.50、1.00、1.50 mL孢子懸浮液，分別在24 ℃、30 ℃下，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，3、5、7 d進(jìn)行鏡檢、稱質(zhì)量，并確定菌絲干質(zhì)量，重復(fù)3次，以進(jìn)行最適初始接菌量的篩選。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Excel 2020和SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，運(yùn)用新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適溫度的篩選

不同溫度(20、22、24、26、28、30 ℃)條件下，菌株P(guān)C7的孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量見(jiàn)表1。隨著溫度的升高，PC7產(chǎn)孢數(shù)量隨之增加，26 ℃培養(yǎng)5 d時(shí)孢子的最高數(shù)量為20.44×105菌落·mL-1。26 ℃培養(yǎng)至7 d，產(chǎn)孢量為15.22×105菌落·mL-1。28、30 ℃條件下，產(chǎn)孢數(shù)量降低，最低時(shí)僅3.55×105菌落·mL-1?？梢?jiàn)，26 ℃是利用液體發(fā)酵獲得PC7孢子的最佳溫度。由表1可知，在溫度為24 ℃情況下培養(yǎng)7 d時(shí)，菌絲最大干質(zhì)量為1.706 3 g。因此，如以產(chǎn)孢數(shù)量為生產(chǎn)目標(biāo)，最適條件為26 ℃培養(yǎng)5 d；以菌絲生產(chǎn)為目標(biāo)，則最適條件為24 ℃培養(yǎng)7 d。

表1 溫度對(duì)產(chǎn)孢量和菌絲產(chǎn)量的影響

2.2 最適初始pH值的篩選

在不同的初始pH條件下，PC7菌株的孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量見(jiàn)表2。由表2可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度分別為24、26 ℃時(shí)，酸性(pH<7)和堿性條件(pH>9)都不利于PC7菌株產(chǎn)生孢子。初始pH值為2時(shí)不產(chǎn)生孢子，隨著初始pH值的增加，孢子數(shù)量開(kāi)始上升，在初始pH值升至8時(shí)達(dá)到最大值，24、26 ℃時(shí)孢子數(shù)量分別為117.0×105、188.0×105菌落·mL-1。因此，24、26 ℃溫度條件下，利用液體發(fā)酵獲得PC7孢子，最佳的初始pH值均為8，但26 ℃時(shí)產(chǎn)孢量遠(yuǎn)大于24 ℃的產(chǎn)孢量。該試驗(yàn)的最適溫度與26 ℃溫度條件是利用液體發(fā)酵獲得PC7孢子的最佳溫度結(jié)果一致。由此可知，溫度26 ℃、初始pH值為8時(shí)，可以提高孢子產(chǎn)量，是最適培養(yǎng)條件。

表2 初始pH值對(duì)產(chǎn)孢量和菌絲產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)溫度分別為24、26 ℃時(shí)，菌絲的生物量較為一致。菌絲干質(zhì)量在初始pH值為8時(shí)達(dá)到最大，分別為1.575 8、1.852 8 g。因此，以菌絲生產(chǎn)為目標(biāo)，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，菌絲生物量受初始pH值影響，最適初始pH值為8。

2.3 最適供氧條件的篩選

在不同的氧氣條件(裝瓶量)，PC7菌株分別在24、26 ℃培養(yǎng)3、5、7 d，其產(chǎn)孢量和菌絲干質(zhì)量見(jiàn)表3。由表3可知，在24 ℃下500 mL三角瓶裝瓶量150 mL，培養(yǎng)至5 d時(shí)，產(chǎn)孢量最大，為104.0×105菌落·mL-1。在26 ℃下500 mL三角瓶裝瓶量200 mL，培養(yǎng)至3 d時(shí)，產(chǎn)孢量為135.0×105菌落·mL-1；相同條件下培養(yǎng)5 d，達(dá)最大產(chǎn)孢量，為232.0×105菌落·mL-1?？梢?jiàn)，26 ℃時(shí)的孢子產(chǎn)量比24 ℃時(shí)的孢子產(chǎn)量大得多。結(jié)果表明，PC7菌株培養(yǎng)液在培養(yǎng)溫度為26 ℃、500 mL三角瓶裝瓶量200 mL條件下，培養(yǎng)5 d時(shí)，孢子產(chǎn)量達(dá)最大值，為最適氧氣條件。

表3 供氧條件對(duì)產(chǎn)孢量和菌絲產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)溫度分別為24、26 ℃時(shí)，菌絲的生物量較為一致，裝瓶量增多后，菌絲干質(zhì)量持續(xù)加大。24、26 ℃下，500 mL三角瓶裝瓶量150 mL，菌絲干質(zhì)量在培養(yǎng)7 d時(shí)達(dá)到最大，分別為1.946 2、1.601 2 g。研究還發(fā)現(xiàn)，裝瓶量為200、250 mL培養(yǎng)3、5、7 d時(shí)，培養(yǎng)溫度為26 ℃時(shí)的菌絲干質(zhì)量低于培養(yǎng)溫度為24 ℃時(shí)。由此可知，較低的培養(yǎng)溫度促進(jìn)菌絲生物量的累積。該試驗(yàn)的最適溫度與24 ℃溫度條件是利用液體發(fā)酵獲得PC7菌絲的最佳溫度結(jié)果一致。以菌絲生產(chǎn)為目標(biāo)，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，初始裝瓶量影響菌絲生物量，初始裝瓶量增多則產(chǎn)量增高。

2.4 最適接菌量的篩選

不同接菌量條件時(shí)，分別在24、26 ℃培養(yǎng)3、5、7 d，PC7菌株的產(chǎn)孢量和菌絲干質(zhì)量見(jiàn)表4。當(dāng)培養(yǎng)溫度為24 ℃、初始接菌量0.5 mL，培養(yǎng)5 d，產(chǎn)孢量最大，為12.50×105菌落·mL-1。當(dāng)培養(yǎng)溫度為26 ℃、初始接菌量0.5 mL，培養(yǎng)7 d，產(chǎn)孢量最大，為40.75×105菌落·mL-1；初始接菌量1.0 mL，相同溫度下培養(yǎng)至7 d，產(chǎn)孢量為26.25×105菌落·mL-1。可以看出，初始接菌量為0.5 mL時(shí)，有利于提高孢子產(chǎn)量，是最適培養(yǎng)條件。

表4 初始接菌量對(duì)產(chǎn)孢量和菌絲產(chǎn)量的影響

在培養(yǎng)溫度為24、26 ℃，接菌量1.0 mL時(shí)，菌絲干質(zhì)量在培養(yǎng)5 d時(shí)達(dá)到最大，分別為1.897 5、1.686 3 g。研究還發(fā)現(xiàn)，接菌量為0.05、0.50、1.00、1.50 mL時(shí)，培養(yǎng)3、5、7 d，培養(yǎng)溫度24 ℃時(shí)的菌絲干質(zhì)量高于培養(yǎng)溫度為26 ℃時(shí)。因此，以菌絲生產(chǎn)為目標(biāo)，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，菌絲生物量受培養(yǎng)溫度影響，24 ℃為最適溫度。該試驗(yàn)的最適溫度與24 ℃溫度條件是利用液體發(fā)酵獲得PC7菌絲的最佳溫度結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

厚垣孢普可尼亞菌在土壤生物防治劑中較為常見(jiàn)，大部分以活性孢子制劑形式投入生產(chǎn)。因此，實(shí)現(xiàn)厚垣孢普可尼亞菌孢子的大量生產(chǎn)對(duì)防治植物病害具有重要意義。為達(dá)到厚垣孢普可尼亞菌孢子發(fā)酵的高產(chǎn)量、低成本、工業(yè)化、大規(guī)模等生產(chǎn)目的，試驗(yàn)通過(guò)在不同溫度、初始pH值、供氧量、接種量等條件對(duì)真菌孢子進(jìn)行液體發(fā)酵，篩選真菌產(chǎn)孢量與菌絲生物量的最適培養(yǎng)條件。研究表明，隨著溫度的升高，PC7產(chǎn)孢數(shù)量隨之增加，PC7孢子可以在20～30 ℃生長(zhǎng)，26 ℃是利用液體發(fā)酵獲得PC7孢子的最佳溫度。在以往的報(bào)道中，過(guò)于酸性或堿性環(huán)境會(huì)抑制厚垣孢普可尼亞菌的孢子產(chǎn)量[12]。本試驗(yàn)中，PC7菌株在pH<6時(shí)產(chǎn)孢量較少，當(dāng)pH=6時(shí)產(chǎn)孢量上升，pH=8時(shí)的產(chǎn)孢量達(dá)到最大值，之后隨pH值升高孢子的產(chǎn)量開(kāi)始下降。這與厚垣孢普可尼亞PC152菌株[13]在pH值為5、長(zhǎng)枝木霉T05菌株[18]在pH值為12時(shí)產(chǎn)孢量最大的結(jié)果不同，可能是由于不同菌株形成孢子的特定條件存在差異。

供氧條件是影響PC7菌株液體發(fā)酵產(chǎn)孢的因素之一，裝瓶量不同，供氧狀態(tài)產(chǎn)生差異。PC7菌株培養(yǎng)液在培養(yǎng)溫度為26 ℃、500 mL三角瓶裝瓶量200 mL，培養(yǎng)5 d時(shí)，孢子產(chǎn)量達(dá)最大值，為最適供氧條件。統(tǒng)一規(guī)格的三角瓶?jī)?nèi)，裝瓶量不同，液體發(fā)酵過(guò)程中的通氣量與溶氧量產(chǎn)生變化，僅在最適供氧條件下，可達(dá)最大產(chǎn)孢量。不同接菌量條件的PC7菌株的產(chǎn)孢量存在差異。接菌量為0.5 mL，26 ℃下培養(yǎng)7 d，PC7菌株產(chǎn)孢量最大。較高的溫度有利于PC7菌株到達(dá)產(chǎn)孢量峰值。溫度升高，PC7菌株的孢子產(chǎn)生速率加快，氧氣消耗量增大。同一培養(yǎng)溫度時(shí)，裝瓶量和接菌量過(guò)大，產(chǎn)孢量下降，會(huì)提升生產(chǎn)成本，造成浪費(fèi)。故為達(dá)到理想的產(chǎn)孢量，需綜合分析溫度、裝瓶量、接菌量等因素對(duì)于孢子產(chǎn)量的影響。

以菌絲生產(chǎn)為目標(biāo)，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，溫度、初始pH值、初始裝瓶量、接菌量影響菌絲生物量。較低的培養(yǎng)溫度利于菌絲生物量的累積。溫度24 ℃、初始pH值為8時(shí)，有利于提高菌絲產(chǎn)量，是最適培養(yǎng)條件。初始裝瓶量和接菌量的最適條件為500 mL三角瓶裝瓶量150 mL、初始接菌量1.0 mL，培養(yǎng)5 d時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大。接菌量繼續(xù)加大，菌絲干質(zhì)量逐漸降低。因此，以菌絲生產(chǎn)為目標(biāo)，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，菌絲干質(zhì)量受到培養(yǎng)條件的綜合影響。

厚垣孢普可尼亞菌的液態(tài)發(fā)酵需綜合多個(gè)影響因素，除培養(yǎng)溫度、初始pH值、供氧條件、接菌量之外，還受光照、含水量、營(yíng)養(yǎng)條件、碳氮比、碳氮源、透氣性、水活度等因素的影響[19-21]。雖僅為實(shí)驗(yàn)室的小規(guī)模試驗(yàn)，但本研究對(duì)于指導(dǎo)厚垣孢普可尼亞菌劑的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用具有一定的意義，為大規(guī)模的厚垣孢普可尼亞菌制劑的液體發(fā)酵生產(chǎn)、應(yīng)用提供了1個(gè)新的方法及途徑。

本研究在不同溫度、初始pH值、供氧量、接種量等條件下對(duì)PC7進(jìn)行液體發(fā)酵，篩選并獲得其產(chǎn)孢量與菌絲生物量的最佳液態(tài)發(fā)酵條件。結(jié)果表明，PC7菌株培養(yǎng)液在培養(yǎng)溫度為26 ℃、初始pH值為8、500 mL三角瓶裝瓶量200 mL時(shí)，以0.5 mL為初始接菌量，產(chǎn)孢量在培養(yǎng)5～7 d時(shí)達(dá)到最大，是最適產(chǎn)孢條件。以菌絲生產(chǎn)為目標(biāo)，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，溫度24 ℃、初始pH值為8、500 mL三角瓶裝瓶量150 mL，初始接菌量1.0 mL時(shí)，培養(yǎng)5 d，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大，有利于提高菌絲產(chǎn)量，是最適培養(yǎng)條件。