崔磊 李鴻 雷玲

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)(吉林科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

黑皮油松(Pinustabuliformis)是松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物，是東北地區(qū)主要的常綠樹(shù)種，其針葉釋放出的揮發(fā)物(VOCs)具有較強(qiáng)的抑菌能力[1]，可有效抑制空氣中細(xì)菌的數(shù)量并阻止其傳播。關(guān)于黑皮油松松針抑菌方面的研究主要集中在提取抑菌物質(zhì)的技術(shù)優(yōu)化，王得道[2]、張?jiān)妻鹊萚3]利用水蒸餾蒸汽法提取黑皮油松松針精油；李怡錚等[4]、包怡紅等[5]采用超聲波提取技術(shù)優(yōu)化黑皮油松松針黃酮成分的提取，并測(cè)定黑皮油松松針精油的抑菌效果及穩(wěn)定性，對(duì)食品的保鮮、防腐及利用具有重要意義。但關(guān)于黑皮油松針葉揮發(fā)性物質(zhì)在森林與城市生態(tài)效益方面的研究相對(duì)較少，段輝等[6]在研究甘肅地區(qū)的油松林不同季節(jié)針葉揮發(fā)物的相對(duì)百分比變化發(fā)現(xiàn)，油松冠層、郁閉度、枝位對(duì)揮發(fā)物相對(duì)百分比有顯著影響。本研究主要探究城市中黑皮油松針葉揮發(fā)物隨季節(jié)、生境等因素的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為黑皮油松在城市環(huán)境中更好的發(fā)揮生態(tài)效益提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

以長(zhǎng)春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園(農(nóng)大校園)、校園緩沖帶(新城大街農(nóng)大路段)、校園后山林地(農(nóng)大林地)中的黑皮油松為調(diào)查對(duì)象，以冬季(2018年12月20日)、春季(2019年5月20日)、夏季(2019年7月22日)、秋季(2019年10月12日)上午09:00—10:00為采樣時(shí)間[7]，選擇黑皮油松胸徑相似((10.0±0.5)cm)的3個(gè)樣地為采樣地點(diǎn)并計(jì)算不同樣地黑皮油松植物群落多樣性[8]的主要指標(biāo)(表1)。各樣地選取5株黑皮油松，從上、中、下3個(gè)冠層，東、南、西、北4個(gè)方位采集1年生枝的頂部及中部針葉，每株樹(shù)采集針葉約100 g，清洗表面，混合均勻剪成0.5～1.0 cm，備用。

表1 黑皮油松生長(zhǎng)狀況與植物群落多樣性

1.2 室內(nèi)水枝插法抑菌試驗(yàn)

各季節(jié)晴朗天氣時(shí)，采集3個(gè)樣地中黑皮油松1年生枝條，采集時(shí)注意采集植物不同方位及高度的針葉約200 g，采集后迅速裝入自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，用無(wú)菌水洗凈，冰箱4 ℃保存。采用室內(nèi)水插枝法，將各樣地針葉樣品用體積分?jǐn)?shù)4%的次氯酸鈉水溶液浸泡5 min，再用無(wú)菌水快速?zèng)_洗，然后將針葉放入消毒過(guò)的自封袋，在烘箱中30 ℃烘20 min，將針葉快速取出自封袋再加入100 mL無(wú)菌水快速放入標(biāo)準(zhǔn)框(1 m×1 m×1 m)中，保鮮膜密封24 h。對(duì)照組僅加入100 mL無(wú)菌水。24 h后，將3個(gè)盛有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿快速放入標(biāo)準(zhǔn)框中，30 min后取出。將培養(yǎng)基放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，計(jì)算菌落數(shù)，結(jié)合公式算出抑菌率[9]。

1.3 松針揮發(fā)物提取

采用水蒸氣蒸餾法[5]，稱(chēng)取剪好的1年生黑皮油松針葉100 g，放入1 000 mL燒杯中，添加5%鹽酸配制的酸水至1 000 mL。用超聲波清洗器處理1 h后，加入5 g纖維素酶并攪拌5 min，保鮮膜密封靜置3 h，再加入4 g NaCl，用多套500 mL提取器同時(shí)進(jìn)行揮發(fā)物提取。待溶液沸騰后，在微沸狀態(tài)保持4.5 h。將蒸餾出的揮發(fā)物，用無(wú)水硫酸鈉干燥，放入棕色瓶在4 ℃條件下密封保存，再利用揮發(fā)物提取率公式[5]算出不同樣地黑皮油松針葉的揮發(fā)物提取率。

1.4 黑皮油松揮發(fā)物成分鑒定

黑皮油松針葉揮發(fā)物成分鑒定在6890N-5975C GC-MS(安捷倫，美國(guó))上進(jìn)行，色譜柱為HP-5(30 m×250 μm×0.25 μm)。程序升溫：初始溫度為60 ℃，保持3 min后，以10 ℃·min-1上升到280 ℃，保持15 min，共計(jì)用時(shí)40 min；進(jìn)樣器為不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣(高純He)；載氣流量1.0 mL·min-1；分流比50∶1；進(jìn)樣量為1 μL。質(zhì)量掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)為50～550 u；電子倍增器電壓1 964.7 V；電子轟擊離子源(EI)70 eV，離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃。運(yùn)用NIST-2002質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)檢索、解析，確認(rèn)其化學(xué)成分，并在計(jì)算機(jī)檢索的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工識(shí)別和判讀[10]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件及Excel 2007對(duì)不同樣地的黑皮油松針葉揮發(fā)物相對(duì)百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣地黑皮油松抑菌率比較

由表2可知，在不同季節(jié)，黑皮油松在農(nóng)大林地中的抑菌率較高，冬季的平均抑菌率較低，為(40.1±3.4)%，夏季平均抑菌率最高，為(73.4±7.6)%。而農(nóng)大校園、新城大街農(nóng)大路段在冬季的抑菌率較低，平均抑菌率分別為(-40.0±5.2)%、(-28.6±3.9)%，均低于對(duì)照處理。在春季與秋季，農(nóng)大校園的抑菌率明顯高于新城大街農(nóng)大路段的抑菌率，新城大街農(nóng)大路段黑皮油松的平均抑菌率為12.0%～14.3%。夏季，黑皮油松在農(nóng)大校園與新城大街農(nóng)大路段的抑菌率差異不明顯，平均抑菌率均在25.0%左右。

表2 不同季節(jié)3樣地黑皮油松抑菌率

2.2 黑皮油松揮發(fā)物成分提取對(duì)比

由冬季至翌年秋季，不同樣地黑皮油松揮發(fā)物隨季節(jié)變化呈現(xiàn)的變化趨勢(shì)不同(表3)。農(nóng)大校園自冬季至翌年夏季，黑皮油松的揮發(fā)物提取率較平穩(wěn)，提取率在0.20%左右，秋季的揮發(fā)物提取率上升，接近0.30%。新城大街農(nóng)大路段在冬、春2季揮發(fā)物提取率較高，揮發(fā)物提取率分別為(0.350±0.058)%、(0.551±0.037)%。

表3 不同季節(jié)3樣地黑皮油松揮發(fā)物提取率對(duì)比

2.3 黑皮油松揮發(fā)物提取率與影響因子分析

黑皮油松揮發(fā)物提取率與抑菌率、光照強(qiáng)度、濕度、風(fēng)速、郁閉度等因素具有不同程度的相關(guān)性。由表4可知，夏季黑皮油松揮發(fā)物提取率與抑菌率呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明黑皮油松在夏季的光合作用與蒸騰作用強(qiáng)，黑皮油松揮發(fā)物合成速率與釋放量均較高。冬季影響黑皮油松揮發(fā)物提取率的主要因子為濕度、Simpon指數(shù)、Shannon-wiener指數(shù)。春季黑皮油松揮發(fā)物提取率與光照強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)，與風(fēng)速呈極顯著負(fù)相關(guān)。夏季由于溫度高，光照較強(qiáng)，黑皮油松針葉為減少水分的蒸騰作用，導(dǎo)致?lián)]發(fā)物提取率與郁閉度、枝下高均呈極顯著正相關(guān)。夏季，揮發(fā)物提取率與Simpson指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、冠幅呈極顯著負(fù)相關(guān)，原因是夏季植物種類(lèi)豐富，物種之間相互競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)與水分，導(dǎo)致黑皮油松針葉的揮發(fā)物提取率減少。秋季溫度降低，光照減弱，植物群落中的其他闊葉植物處于半休眠或休眠狀態(tài)，與黑皮油松競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和光照的植物種類(lèi)減少，使黑皮油松針葉中的揮發(fā)物積累較多，因此，黑皮油松揮發(fā)物提取率與Simpson指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、冠幅呈極顯著正相關(guān)。

表4 黑皮油松揮發(fā)物提取率與環(huán)境因子的相關(guān)性

2.4 黑皮油松揮發(fā)物成分組成及動(dòng)態(tài)變化

由于農(nóng)大林地中黑皮油松的抑菌率較高，黑皮油松揮發(fā)物提取率較穩(wěn)定，本研究通過(guò)檢測(cè)農(nóng)大林地中黑皮油松1年生枝針葉中的黑皮油松揮發(fā)物成分，其中冬季、春季、夏季、秋季總離子流圖見(jiàn)圖1、圖2、圖3、圖4，黑皮油松揮發(fā)物的主要成分及相對(duì)百分比見(jiàn)表5。黑皮油松針葉中的揮發(fā)物有121種，其中黑皮油松揮發(fā)物中檢測(cè)到相對(duì)百分比超過(guò)0.10%的有機(jī)物，共計(jì)34種。冬、春季節(jié)黑皮油松揮發(fā)物中相對(duì)百分比超過(guò)0.10%的有機(jī)物分別占總量的73.69%、73.22%，夏、秋季節(jié)則分別占89.79%、84.40%。

表5 各季節(jié)黑皮油松揮發(fā)物主要成分

圖1 冬季黑皮油松揮發(fā)物總離子流圖

圖2 春季黑皮油松揮發(fā)物總離子流圖

圖3 夏季黑皮油松揮發(fā)物總離子流圖

圖4 秋季黑皮油松揮發(fā)物總離子流圖

各季節(jié)黑皮油松揮發(fā)物以萜烯類(lèi)物質(zhì)為主，醇類(lèi)與有機(jī)酸類(lèi)較多。冬季，黑皮油松揮發(fā)物中萜烯類(lèi)化合物相對(duì)百分比占總量的51.70%，主要為γ-衣蘭油烯(9.43%)、β-石竹烯(7.38%)、α-蒎烯(4.18%)等；酯類(lèi)占13.67%，主要為乙酸龍腦酯(8.61%)。春季，黑皮油松揮發(fā)物中萜烯類(lèi)化合物百分比占總量的51.95%，其中，β-石竹烯(13.28%)、α-蒎烯(5.88%)百分比升高，β-蒎烯百分比達(dá)12.74%，其他有機(jī)物質(zhì)百分比較少。進(jìn)入夏季，黑皮油松揮發(fā)物中β-石竹烯(14.37%)百分比繼續(xù)升高，α-蒎烯(7.03%)、β-蒎烯(9.88%)、d-檸檬烯(6.90%)、γ-松油烯(6.43%)百分比均較高，石竹素為各季節(jié)最低，為1.45%，有機(jī)酸(7.52%)、醇類(lèi)(15.17%)較低，其中α-松油醇為4.22%，相對(duì)較高。入秋后，黑皮油松揮發(fā)物中β-石竹烯(14.60%)、α-蒎烯(8.48%)百分比持續(xù)升高，γ-衣蘭油烯(6.03%)比春、夏季節(jié)升高明顯，酯類(lèi)百分比升高，為13.34%，其中乙酸龍腦酯百分比較冬季高，為10.17%。不同季節(jié)黑皮油松揮發(fā)物中萜烯類(lèi)物質(zhì)的變化趨勢(shì)由高到低依次為秋季、夏季、春季、冬季；醇類(lèi)物質(zhì)的季節(jié)變化趨勢(shì)由高到低依次變化趨勢(shì)為冬季、夏季、秋季、春季；酯類(lèi)物質(zhì)的季節(jié)變化趨勢(shì)由高到低依次則為春季、秋季、冬季、夏季。

3 結(jié)論與討論

自然沉降法是檢測(cè)樹(shù)木抑菌能力的傳統(tǒng)方法，受環(huán)境影響較大，不能較好的反應(yīng)某一種樹(shù)木抑菌能力。因此，本研究對(duì)長(zhǎng)春市不同生境黑皮油松抑菌率的比較采用室內(nèi)水插枝法[9]，該方法能夠有效的排除油松抑菌能力的外部影響。由表2可知，冬季在農(nóng)大校園與新城大街農(nóng)大路段黑皮油松的抑菌率低于對(duì)照，這是因?yàn)楹谄び退蓳]發(fā)物在這2個(gè)樣地中低百分比的某些醇類(lèi)或脂類(lèi)會(huì)促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)。張麗平等[11]研究發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)4%乙醇和有機(jī)酸促進(jìn)木醋桿菌細(xì)菌纖維素的生成。柴瑞娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)1.5 mg·L-1的水楊酸適宜大腸桿菌的生長(zhǎng)。李洪遠(yuǎn)等[13]、郄光發(fā)等[14]發(fā)現(xiàn)，夏、秋季節(jié)是揮發(fā)物釋放的2個(gè)主要季節(jié)，同時(shí)，不同植物揮發(fā)物的釋放情況在春、夏、秋3季中的任何1個(gè)月都可能成為某種植物揮發(fā)物平均釋放速率最高的1個(gè)時(shí)期。謝小洋[15]、Son et al.[16]研究表明，油松夏季總揮發(fā)物相對(duì)百分比最高，春季次之。本研究表明，夏季，農(nóng)大林地的黑皮油松抑菌率較高，揮發(fā)物提取率較穩(wěn)定，與謝小洋等[15]的研究結(jié)果相似。

相關(guān)研究表明，影響揮發(fā)物釋放的環(huán)境因子主要分為生物因子(如植物的林齡、植物的發(fā)育狀態(tài)、植物的遺傳特性等)和非生物因子(光照、溫度、濕度、風(fēng)力等)，其對(duì)揮發(fā)物的釋放、組分、相對(duì)百分比有明顯的影響[14，17]。溫度、光照是影響揮發(fā)物釋放的2個(gè)主要影響因素[18-19]，較高的溫度有利于與萜烯類(lèi)化合物合成酶的活化，且萜烯類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)釋放可以散失植物體內(nèi)大量熱量，同時(shí)，蒸騰作用也為萜烯類(lèi)化合物擴(kuò)散創(chuàng)造條件。李娟等[20]對(duì)側(cè)柏研究表明，植物揮發(fā)性成分釋放種類(lèi)及相對(duì)百分比隨溫度、濕度、光照的提高，其揮發(fā)性成分的釋放也會(huì)增多。Janson[21]對(duì)歐洲赤松(Pinussylvestris)研究表明，環(huán)境濕度增加可加快揮發(fā)物的釋放，也會(huì)使樹(shù)木釋放的揮發(fā)物組分發(fā)生改變。本研究表明，冬季，黑皮油松揮發(fā)物提取率與濕度呈顯著負(fù)相關(guān)，也說(shuō)明揮發(fā)量與濕度呈正相關(guān)，與Janson[21]的研究結(jié)果相似。春季，黑皮油松的揮發(fā)物提取率與光照強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)。Owen et al.[22]研究表明，光照強(qiáng)度與多種植物的揮發(fā)物提取率之間在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，說(shuō)明郁閉度低的環(huán)境中，植物揮發(fā)物提取率較高。

不同季節(jié)黑皮油松1年生枝葉揮發(fā)物各主要成分均為酯類(lèi)、萜烯類(lèi)、醇類(lèi)化合物，主要成分中萜烯類(lèi)相對(duì)百分比最高，為46.0%～67.8%。張倩等[23]研究發(fā)現(xiàn)，油松在天津地區(qū)是釋放萜烯類(lèi)較高的樹(shù)種，與本研究結(jié)果相似。本研究中，各季節(jié)黑皮油松揮發(fā)物中單萜烯百分比為10.45%～27.87%。郭阿君[24]研究表明，樟子松單萜烯類(lèi)相對(duì)百分比季節(jié)變化趨勢(shì)由大到小依次為秋季、春季、夏季，其中，春、秋2季單萜烯類(lèi)占主導(dǎo)地位，夏季萜類(lèi)化合物百分比降低。夏季針葉樹(shù)種單萜烯百分比降低與樹(shù)勢(shì)有關(guān)，樹(shù)勢(shì)較弱的針葉樹(shù)種單萜烯百分比下降，這是因?yàn)閱屋葡┮讚]發(fā)到環(huán)境中，但樹(shù)本身的生長(zhǎng)勢(shì)較弱，合成單萜烯物質(zhì)的速率下降，而樹(shù)勢(shì)較好的樹(shù)種在夏季合成單萜烯物質(zhì)的速率明顯高于揮發(fā)到環(huán)境的速率，從而形成夏季單萜烯百分比最高的趨勢(shì)，與鄭義等[25]的研究結(jié)果相似。而崔義等[26]檢測(cè)到黑皮油松石竹烯百分比為36.88%，明顯高于本研究結(jié)果，崔義等[26]采用的萃取溶劑是正己烷，而本研究采用水做為萃取溶劑，正己烷的萃取效率較高，由此可知萃取溶劑的選擇對(duì)研究結(jié)果存在明顯的影響。

通過(guò)不同樣地黑皮油松針葉抑菌率可知，各季節(jié)農(nóng)大林地中黑皮油松抑菌率明顯高于其他樣地的抑菌率，春、秋2季，新城大街農(nóng)大路段的黑皮油松抑菌率較低，平均抑菌率分別為14.3%、12.0%。通過(guò)揮發(fā)性成分提取率可知，冬、春季節(jié)新城大街農(nóng)大路段的黑皮油松揮發(fā)物提取率是其他2個(gè)樣地?fù)]發(fā)物提取率的2倍左右；夏、秋季節(jié)，各樣地的黑皮油松揮發(fā)物提取率變化較小。

相關(guān)分析可知，夏季黑皮油松揮發(fā)物提取率與抑菌率呈極顯著正相關(guān)，其他季節(jié)呈現(xiàn)不同程度的負(fù)相關(guān)。黑皮油松揮發(fā)物提取率在冬季的主要影響因子是濕度、Simpon指數(shù)、Shannon-wiener指數(shù)；春季的主要影響因子是光照強(qiáng)度、風(fēng)速。夏季，黑皮油松揮發(fā)物提取率與郁閉度、枝下高呈極顯著正相關(guān)，與Simpson指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、冠幅呈極顯著負(fù)相關(guān)。秋季，黑皮油松揮發(fā)物提取率與郁閉度、枝下高呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Simpson指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、冠幅呈極顯著正相關(guān)。

對(duì)農(nóng)大林地中黑皮油松揮發(fā)物成分鑒定可知，各季節(jié)中揮發(fā)物組成成分為121種，主要包括萜烯類(lèi)、酯類(lèi)、少量醇類(lèi)，主要成分中萜烯類(lèi)相對(duì)百分比最高。各季節(jié)萜烯類(lèi)百分比變化趨勢(shì)由大到小依次為秋季(62.86%)、夏季(62.74%)、春季(51.95%)、冬季(51.70%)，其中單萜烯百分比季節(jié)變化趨勢(shì)由大到小依次為夏季(34.21%)、秋季(24.31%)、春季(18.92%)、冬季(11.30%)。各季節(jié)β-石竹烯各季節(jié)相對(duì)百分比均較高，其中，春季、夏季、秋季β-石竹烯相對(duì)百分比最高；冬季揮發(fā)物相對(duì)百分比最高為γ-衣蘭油烯，占9.43%。