卜曉婷 喬孝祿 徐曉華 徐志標 翟金庭 李淑嫻

(南京林業(yè)大學，南京，210037)(六安市金安區(qū)林業(yè)發(fā)展中心)(鹽城林蠶站)(鹽城林場)(南京林業(yè)大學)

納塔櫟(Quercusnuttallii)為殼斗科櫟屬落葉喬木，原產(chǎn)于美國佛羅里達州西部至德克薩斯州東南部沿海平原低洼地。納塔櫟根深葉茂，樹形優(yōu)美，每年11月初葉片轉(zhuǎn)紅，呈亮紅色或紅棕色，掛葉期可至第2年1月份，極具觀賞價值。納塔櫟耐寒、耐旱、耐水濕，具有較強的抗污染能力及環(huán)境適應能力，是優(yōu)良的園林綠化樹種[1]。其木材為白色或淺棕色，堅實沉重，紋理美觀，是高檔家具及裝飾用材[2]，具有廣闊的應用前景。

納塔櫟以種子繁殖為主，但其種子具有明顯的休眠特性，這給播種育苗生產(chǎn)帶來了一定困難。扦插繁殖具有保持母株優(yōu)良特性、繁殖系數(shù)高、材料易得、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應用于林業(yè)生產(chǎn)中[3]。但國內(nèi)外目前對納塔櫟扦插繁殖的研究還不多，且扦插生根率普遍不高。劉博等[2]研究了基質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑處理對納塔櫟嫩枝扦插的影響，結(jié)果表明，V(泥炭)∶V(珍珠巖)∶V(蛭石)=1∶1∶1的混合基質(zhì)扦插效果最好，將插穗在質(zhì)量濃度為500 mg·L-1的ABT6溶液中浸泡2 h，其生根率最高，達39.4%；陳晨等[4]同樣對納塔櫟嫩枝扦插進行了研究，他們發(fā)現(xiàn)用質(zhì)量分數(shù)為200 mg·kg-1的ABT溶液對插穗處理2 h后，扦插生根率為33.3%。但這些學者并未對納塔櫟扦插生根率低的原因進行研究。黃利斌等[5]認為造成櫟類樹種難生根的主要原因是插穗體內(nèi)存在酚類、單寧等抑制物質(zhì)。但同一科屬不同樹種中影響扦插的抑制物的種類不盡相同，因此納塔櫟插穗中抑制物質(zhì)的種類還不清楚。本研究擬用吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、間苯三酚(THB)的混合激素處理納塔櫟插穗，三者的質(zhì)量濃度分別為500、250、50 mg·L-1，以期研究不同母樹年齡、不同采穗時期對納塔櫟生根的影響，同時探討納塔櫟生根過程中內(nèi)源抑制物質(zhì)的種類及相對百分比的變化，旨在深入了解納塔櫟的扦插特性，為納塔櫟扦插育苗生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 扦插床的制備

試驗地位于南京市溧水區(qū)白馬鎮(zhèn)南京林業(yè)大學白馬教學科研基地的扦插池內(nèi)。扦插池南北走向，規(guī)格為1.2 m×12 m，扦插池中間每隔1 m設置1個高度為30 cm的插噴。扦插池底層鋪15 cm厚的珍珠巖，上層基質(zhì)由V(泥炭)∶V(珍珠巖)=2∶1混合而成，厚約20 cm。在扦插池上方使用透明塑料薄膜搭建小拱棚進行保濕。于扦插前1周，用500倍多菌靈溶液澆透基質(zhì)消毒殺菌。

1.2 插穗的剪制與處理

分別于2017年8月14日、9月14日、11月14日，從1年生母樹(2017年春天播種)和苗齡為4年生的母樹上剪取生長健壯、無病蟲害的當年新抽嫩枝作插條，二者均為實生苗。將采集的插條剪成長度為10～12 cm的插穗，插穗上端平切，下端斜切，切口保持平滑無破裂。每根插穗保留2個葉片，每個葉片剪去1/2。每30根插穗為1捆，將插穗基部置于IBA、NAA、THB質(zhì)量濃度分別為500、250、50 mg·L-1的混合溶液中浸泡1 h(預試驗表明，采用該混合激素處理，1年生納塔櫟苗的扦插生根率達88.8%)，對照為清水處理相同時間，每個處理3次重復，每重復30根插穗。扦插株行距5 cm×7 cm，深度2～3 cm。扦插后，每7 d噴施1次500倍多菌靈溶液[6]。扦插池內(nèi)溫度過高時需在拱棚外澆水或搭遮陽網(wǎng)以降低棚內(nèi)溫度。

1.3 生根情況統(tǒng)計

于扦插50 d后統(tǒng)計各處理的愈傷率、生根率、一級根數(shù)、平均根長。愈傷率為各處理形成愈傷組織的插穗數(shù)占總插穗數(shù)的百分比；生根率為各處理生根的插穗數(shù)占總插穗數(shù)的百分比。

1.4 GC-MS法確定納塔櫟生根抑制物的種類

2017年8月14日以1年生納塔櫟實生苗為材料進行扦插，分別在生根的前期(8月14日)、中期(9月4日)、后期(9月24日)取樣，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測定插穗中內(nèi)源抑制物的種類及其相對百分比(相對百分比為待測物質(zhì)中某一物質(zhì)的峰面積占總峰面積的比例)。

插穗抑制物的提取和分離：取插穗基部(下切口往上3 cm)韌皮部2 g，在研缽中加入液氮磨碎后，轉(zhuǎn)入25 mL離心管中，再加入20 mL體積分數(shù)為99.6%甲醇溶液，在密閉條件下浸提24 h。然后將浸提液放入離心機中以8 000 r·min-1的速度離心30 min，取上清液。將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-3000)上進行濃縮蒸餾，最后將溶液定容至5 mL，備用。

插穗提取液GC-MS鑒定：采用GC-MS測定內(nèi)源抑制物的種類及其相對百分比，儀器型號為島津QP2010ultraGC-MS；氣相色譜條件為Rtx-5MS毛細管柱(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，流速為1 mL·min-1；色譜條件為進樣口溫度250 ℃，分流比為20；升溫程序為35 ℃保持3 min，以6 ℃·min-1漲至300 ℃保持30 min；離子源溫度為220 ℃，接口溫度為260 ℃；離子掃描范圍為45～500，進樣量為1 μL。由計算機控制的庫存信號檢查質(zhì)譜圖并與標準圖庫普圖核對。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件以及SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素處理對不同年齡插穗生根的影響

由表1可知，用混合激素處理不同年齡苗木的插穗，處理組的愈傷率、生根率均高于對照清水處理組。其中，1年生材料處理組的愈傷率是對照組的2倍，生根率是對照組的8.6倍，平均一級根數(shù)也顯著多于對照組，但二者的平均根長沒有顯著差異。從4年生母樹上剪取的插穗，處理組的愈傷率是對照組的1.7倍；對照組插穗的生根率為0，而處理組的生根率遠高于對照組。因此該激素處理方法對納塔櫟扦插生根具有明顯的促進效果。

表1 不同處理對納塔櫟扦插生根的影響

從表中還可以看出，從1年生、4年生母樹上剪取的插穗，對照組中二者的愈傷率無明顯差異；處理組中，1年生材料的愈傷率比4年生母樹顯著增加11.6%。對照組4年生母樹插穗的生根率為0，而1年生生母樹插穗的生根率為10.3%，顯著高于4年生母樹；處理組1年生材料的生根率比4年生母樹顯著增加了25.9%。1年生母樹插穗處理組的一級根數(shù)、平均根長均高于4年生母樹插穗的。上述結(jié)果均說明，在相同的處理情況下，1年生材料的扦插效果好于4年生母樹。

對處理方法及采穗母樹年齡對生根指標的影響進行雙因素分析，結(jié)果見表2。除母樹年齡與處理方法的交互作用與一級根數(shù)之間存在顯著性差異，其余指標與母樹年齡、處理方法及其交互作用均存在極顯著差異。對于生根率、一級根數(shù)2個指標，影響效果由大到小依次為處理方法、母樹年齡、母樹年齡×處理方法。由此可見，不同處理方法是影響納塔櫟扦插生根的重要因素。

表2 不同處理和母樹年齡對插穗生根指標影響的雙因素分析

2.2 不同采穗時期對插穗生根的影響

用IBA、NAA、THB混合溶液處理不同采穗時間的插穗，結(jié)果見表3。從1年生母樹剪取的插穗，8、9月份扦插的愈傷率都在98.5%以上，生根率均在85.0%以上，且2個月份扦插的插穗愈傷率、生根率均無顯著差異；但11月份扦插的插穗愈傷率顯著下降至85.5%，生根率顯著下降至20.2%。一級根數(shù)11月份最小，為2.5條。各月份扦插的插穗平均根長差異顯著，8月份扦插的最長，為7.3 cm；11月份最小，為5.1 cm。從4年生母樹剪取的插穗，11月份扦插，愈傷率達89.2%，比8、9月份扦插的插穗愈傷率(分別為87.2%、84.2%)稍高，但3個時期扦插的插穗愈傷率無顯著差異。3個采穗時期扦插的插穗生根率有較大差異，8月份的生根率最高，達62.9%；9月份的生根率顯著下降為50.3%；而11月份的則完全不能生根。8、9月份扦插的插穗一級根數(shù)、平均根長均無顯著差異。上述結(jié)果表明，木質(zhì)化程度對插穗生根有一定的影響，木質(zhì)化程度越高，插穗越難生根。

表3的結(jié)果再次說明，母樹年齡對扦插生根有一定影響。8月份扦插時，從1年生母樹剪取的插穗，其愈傷率(98.8%)比4年生母樹(87.2%)高出12.6%；1年生材料的生根率為88.8%，顯著高于4年生母樹的生根率(62.9%)；同時，4年生母樹的插穗，其一級根數(shù)、平均根長這2個指標也均較1年生材料的相應指標要低。9月份采穗時，1年生母樹插穗與4年生的各項指標均表現(xiàn)出與8月份相同的變化規(guī)律。11月份采穗時，1年生、4年生母樹插穗的愈傷率無顯著差異，但4年生母樹插穗的生根率為0，與1年生的差異顯著。

表3 不同采穗時期對不同年齡納塔櫟插穗生根的影響

從采穗日期和母樹年齡的雙因素分析表可以看出(表4)，二者交互作用時，一級根數(shù)不存在差異性；而經(jīng)激素處理后不同采穗日期、母樹年齡的插穗，其愈傷率、生根率、一級根數(shù)、平均根長均存在極顯著差異。采穗日期對生根率、平均根長的影響大于母樹年齡對二者的影響，而母樹年齡對插穗的愈傷率、一級根數(shù)的影響較大。由此可以看出，采穗日期與母樹年齡的交互作用影響納塔櫟的扦插生根，采穗日期對生根率的影響更大。

表4 不同采穗日期和母樹年齡對生根指標影響的雙因素分析

2.3 生根過程中插穗內(nèi)抑制物的GC-MS鑒定

在納塔櫟生根前期(扦插當天)、中期(扦插后21 d)、后期(扦插后31 d)，分別對插穗甲醇提取物進行GC-MS分析，得到總離子流色譜圖(圖1、圖2、圖3)。通過質(zhì)譜系統(tǒng)檢索并與標準圖譜進行核對，選擇總離子流色譜圖中峰面積較大且與計算機檢索譜庫圖吻合性較好的有機化合物(表5)。

圖1 扦插前期納塔櫟插穗甲醇提取物總離子流色譜圖

圖2 扦插中期納塔櫟插穗甲醇提取物總離子流色譜圖

圖3 扦插后期納塔櫟插穗甲醇提取物總離子流色譜圖

扦插前期，在納塔櫟韌皮部甲醇提取物中共鑒定出16個峰，其中峰面積較大、相似度較高的化合物主要有8種(見表5)，包括酚酸醇類物質(zhì)4種，分別是鄰苯三酚(13.40%)、對羥基苯乙醇(4.81%)、正癸酸(50.40%)、γ-谷甾醇(14.20%)，另外還含有維生素E(2.30%)、樺木腦(3.72%)。

表5 納塔櫟插穗甲醇提取物中有機化合物種類及相對百分比

扦插中期，出現(xiàn)了一種新的化合物棕櫚酸，其相對百分比為1.21%。與扦插前期相比，鄰苯三酚、正癸酸的相對百分比有所減少，而對羥基苯乙醇、棕櫚酸、γ-谷甾醇、樺木腦的相對百分比上升。其中，鄰苯三酚相對百分比下降了3.41%；正癸酸相對百分比下降的幅度最大，由最初的50.4%下降至28.5%，下降了21.9%；對羥基苯乙醇、樺木腦的相對百分比分別上升了2.05%、1.63%；γ-谷甾醇相對百分比上升幅度最大，由14.2%上升至30.4%，上升了16.2%。

在扦插后期，未檢測到對羥基苯乙醇、正癸酸2種物質(zhì)。鄰苯三酚相對百分比較中期上升了1.31%，為11.3%；棕櫚酸相對百分比較中期下降了0.16%；γ-谷甾醇相對百分比較中期上升了21.8%，且其占比最高，為55.26%；樺木腦的相對百分比較中期上升了1.85%。

總的來說，在整個生根過程中，鄰苯三酚相對百分比呈先下降后上升的趨勢；對羥基苯乙醇、棕櫚酸相對百分比呈先上升后下降的變化趨勢；γ-谷甾醇、樺木腦的相對百分比均呈上升趨勢；正癸酸的相對百分比則呈現(xiàn)下降趨勢。

3 結(jié)論與討論

3.1 母樹年齡對納塔櫟插穗生根的影響

有研究表明，很多樹種扦插時的生根率會隨母樹年齡的增加而降低[7]。母樹年齡越小，其細胞分裂能力越強，生理活動越活躍，插穗越容易生根[8]。本研究中，處理組、對照組1年生納塔櫟插穗的生根率均高于4年生母樹的插穗，且其他指標也優(yōu)于后者，這與秦愛麗等[9]對崖柏(Thujasutchuenensis)嫩枝扦插、李俊南等[10]對薄殼山核桃(Caryaillinoensis)扦插的研究結(jié)果一致。對照組4年生母樹插穗的生根率為0，而1年生納塔櫟插穗的生根率可達10.3%，說明母樹年齡對納塔櫟扦插生根有很大影響，樹齡越小，越容易生根。雙因素分析表明，母樹年齡、處理方法及二者的交互作用都與納塔櫟插穗生根存在顯著或極顯著關系。其中，激素處理對納塔櫟插穗生根的影響效果較母樹年齡更大。

3.2 采穗時期對納塔櫟生根的影響

采穗時期不同，插穗中的營養(yǎng)物質(zhì)、木質(zhì)化程度及外界環(huán)境不相同，因而扦插生根率也會有差異。幼嫩插穗組織分生能力強，易產(chǎn)生愈傷組織，容易經(jīng)過脫分化成形成根原基，因而扦插生根率較高[11]。施浩威等[12]研究了插穗木質(zhì)化程度對紅翅槭(Acerfabri)扦插生根的影響并發(fā)現(xiàn)半木質(zhì)化嫩梢的扦插效果最好。納塔櫟的年生長周期為4～8月[13]，本研究采用半木質(zhì)化(8月、9月)、木質(zhì)化(11月)的插穗進行扦插，研究發(fā)現(xiàn)，4年生母樹充分木質(zhì)化的插穗完全不能生根，即使從1年生苗木剪取的插穗，其生根率也只有20.2%；而8月、9月采用半木質(zhì)化的插穗進行扦插，其生根率均高于11月木質(zhì)化插穗，其原因是木質(zhì)化插穗雖有一定的營養(yǎng)基礎，但組織內(nèi)的生理活動不強烈，且隨著木質(zhì)化程度的加深，生根抑制物的含量也會逐漸增加，最終影響插穗的生根率。因此，納塔櫟扦插時可以選擇當年新抽生的半木質(zhì)化枝條作插穗。

同為半木質(zhì)化的插穗，在8、9月2個采穗時期進行扦插，納塔櫟的生根效果也不盡相同。1年生母樹，8月份扦插的生根率(88.8%)較9月份(85.3%)略高，但二者之間差異不顯著；4年生母樹，8月份扦插的生根率(62.9%)顯著高于9月份(50.3%)，原因可能是夏季植物生長旺盛，植物體內(nèi)誘導生根的相關酶活性、內(nèi)源激素水平高[14]。納塔櫟在4月初開始抽枝展葉，本研究未能剪取春天剛萌動的嫩枝進行扦插試驗，今后有必要更系統(tǒng)的研究其他采穗時期對納塔櫟生根的影響，找到更多適宜納塔櫟扦插的時期，以提高繁殖系數(shù)。采穗日期、母樹年齡的雙因素分析結(jié)果顯示，除一級根數(shù)在二者的交互作用中不存在差異性，其余各相關指標均存在極顯著差異，說明采穗日期、母樹年齡均為影響納塔櫟扦插的重要因素。這與王小蓉等[15]對日本晚櫻(Cerasusserrulata)扦插中得出的插穗生理成熟度過高，不利于不定根發(fā)生的結(jié)論一致。

3.3 激素處理對納塔櫟插穗生根的影響

利用外源激素處理插穗，可優(yōu)化插穗內(nèi)有關不定根形成的物質(zhì)，如內(nèi)源激素水平、營養(yǎng)物質(zhì)分配等[16]。但激素質(zhì)量濃度過高會傷害插穗，反而抑制其生根[17]。對于難生根的樹種，使用適宜種類、質(zhì)量濃度的外源激素處理插穗，可有效提高扦插生根率，且很多樹種混合激素溶液處理比單一激素處理的生根效果更好[18-19]。本研究在預試驗的基礎上，采用IBA、NAA、THB的混合溶液處理插穗，1年生、4年生母樹的插穗生根率均高于未處理插穗，一級根數(shù)、平均根長指標也優(yōu)于對照組，且完全木質(zhì)化的1年生母樹的枝條經(jīng)過處理后也有20.2%的生根率，說明混合激素處理可有效調(diào)節(jié)插穗內(nèi)物質(zhì)的分配水平，促進扦插生根。這與高林等[20]對石生茶藨子(RibesSaxatilePall.)、李夢怡等[21]對紅花槭(Acerrubrum)的研究結(jié)果一致。

3.4 抑制物對納塔櫟生根的影響

以往的研究表明，酚類、酸類、黃酮類物質(zhì)是主要的生根抑制物質(zhì)[22-23]。朱鵬等[24]采用GC-MS技術，在鄧恩桉(Eucalyptusdunnii)插穗中鑒定出了醇類及其衍生物，該研究認為難生根的樹種韌皮部存在抑制生根的物質(zhì)。王改萍等[25]采用GC-MS技術，研究了楸樹(Catalpabungei)生根過程中插穗內(nèi)抑制物質(zhì)的種類、含量變化，根據(jù)扦插過程中植物甾醇相對百分比上升，槲皮素、亞油酸、棕櫚酸的相對百分比下降，推斷植物甾醇為楸樹生根促進物質(zhì)，槲皮素、亞油酸、棕櫚酸為生根抑制物質(zhì)。本研究采用GC-MS技術，以1年生苗木的半木質(zhì)化插穗為材料，測定了納塔櫟生根前、中、后期3個不同階段有機物的種類及其相對百分比的變化，從中鑒定出了鄰苯三酚、樺木腦、正癸酸、維生素E、γ-谷甾醇等物質(zhì)。納塔櫟插穗整個生根過程中，γ-谷甾醇、樺木腦的相對百分比均呈上升趨勢，且分別升高了38.04%、3.48%。有研究表明，樺木腦是一種參與生物體多功能調(diào)節(jié)的生物活性物質(zhì)[26]。徐程楊等[27]指出某些酚醇類物質(zhì)可能是內(nèi)源生長素的增效劑。8月份扦插的插穗中γ-谷甾醇、樺木腦相對百分比高，推斷是其生根率較高的原因之一。因此初步推斷，γ-谷甾醇、樺木腦是具有促進生根活性的化合物。梁小春等[28]在鄧恩桉插穗生根抑制物的研究中發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)是影響其扦插生根的物質(zhì)；而Rout[29]對茶樹(Camelliasinensis)扦插生根的研究發(fā)現(xiàn)，多酚類物質(zhì)可以促進茶樹生根。本研究中，鄰苯三酚的相對百分比在生根過程中呈先下降后上升的變化趨勢，因此鄰苯三酚在納塔櫟生根過程中的作用比較復雜，不能判斷其具體的作用。在生根過程中，正癸酸的相對百分比一直呈下降趨勢，生根后期則基本檢測不到正癸酸，因此初步推斷正癸酸是納塔櫟扦插生根的主要抑制物質(zhì)，今后有必要進一步驗證上述物質(zhì)對納塔櫟生根的影響。王艷晶[30]在對國槐(Sophorajaponica)扦插研究中發(fā)現(xiàn)，國槐嫩枝存在抑制物質(zhì)，且在不同生長時期抑制物的含量有所差異。因此，不同采穗時期的抑制物研究也是今后要做的主要工作之一。

植物扦插生根是1個復雜的過程，受多重因素的影響。本研究從母樹年齡、采穗時期、生根抑制物質(zhì)3個角度出發(fā)，闡明了影響納塔櫟扦插生根的因素，但對于生根抑制物，本研究僅依據(jù)納塔櫟生根進程中相關物質(zhì)的變化趨勢，初步推斷了這些物質(zhì)對其生根進程的影響，后續(xù)研究中仍需進一步驗證這些物質(zhì)在納塔櫟生根過程中的具體作用機理。此外，影響插穗生根的因素還有很多，如插穗內(nèi)部的激素水平、營養(yǎng)基礎及相關酶活性的高低等，而外界環(huán)境因素、扦插基質(zhì)的不同也會影響插穗生根率[31]。今后有必要進一步研究更多因素對納塔櫟扦插的影響，為難生根樹種的扦插繁殖提供參考。