林艾佳 吳奇 倪瑞蓮 陳恒 衛(wèi)冕 李成云 王一

摘要 稻瘟病嚴重威脅全球水稻的產量，鈣離子信號通路參與了稻瘟菌生長、發(fā)育和致病，了解這些過程中菌株細胞質中鈣離子濃度的變化對稻瘟病的防治具有重要意義。GCaMP6s作為一種細胞質鈣離子感受蛋白在動物和植物中已有大量應用。本研究利用不同稻瘟菌菌株構建了GCaMP6s基因的異源表達菌株，在0.01 g/mL鈣離子處理下，GCaMP6s在稻瘟菌菌絲和分生孢子中穩(wěn)定表達。此外，GCaMP6s異源表達菌株與野生型菌株的菌落直徑和產孢量沒有差異，表明GCaMP6s基因的異源表達不影響稻瘟菌的菌絲生長和產孢。本研究獲得了GCaMP6s異源表達的稻瘟菌菌株，為后續(xù)研究稻瘟菌細胞質中鈣離子濃度變化與菌株生長發(fā)育和脅迫響應提供研究材料。

關鍵詞 稻瘟菌; 異源表達; GCaMP6s

中圖分類號： S435.111.41

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021023

Abstract Rice blast caused by Magnaporthe oryzae is a serious threat to the global rice production. Calcium signaling pathway is involved in the growth， development and pathogenicity of M.oryzae. Understanding the changes of Ca2+ concentration in the cytoplasm of M.oryzae at three different stages is of great significance for control of rice blast. As a cytoplasmic Ca2+ sensor protein， GCaMP6s has been widely used in animals and plants. In this study， heterologous expression strains containing GCaMP6s were constructed using M.oryzae YN153 and YN157 strains. Under 0.01 g/mL Ca2+ treatment， GCaMP6s was stably expressed in the mycelia and conidia of M.oryzae. In addition， by comparing the colony diameter and sporulation between the heterologous expression strains of GCaMP6s and the wild type strains， we found that there was no difference between the two strains， indicating that the heterologous expression of GCaMP6s gene did not affect the mycelial growth and sporulation of M.oryzae. In this study， we obtained the heterologous expression of GCaMP6s in M.oryzae， which can provide research materials for further study on the changes of calcium ion concentration in the cytoplasm， and the growth， development and stress response of M.oryzae.

Key words Magnaporthe oryzae; heterologous expression; GCaMP6s

細胞內游離鈣是重要的第二信使，在生物體生長發(fā)育、轉錄調控、細胞代謝等方面具有重要作用[1]。近年來有關鈣離子的報道在動植物和微生物免疫研究方面較多。在真核微生物中，鈣離子鈣調蛋白鈣調磷酸酶（calcium-calmodulin-calcineurin）級聯(lián)通路對病原真菌生長發(fā)育，特別是其毒力和侵染能力具有重要影響[2]，與病原真菌鈣離子穩(wěn)態(tài)、脅迫響應、細胞壁完整性等關系密切。例如，在鏈格孢Alternaria alternata中，鈣調磷酸酶基因Cna1影響菌絲形態(tài)和分生孢子成熟[3];在大麗輪枝菌Verticillium dahliae中鈣調磷酸酶基因Crz1與菌核形成相關[4]。此外，在玉米黑粉菌Ustilago maydis和核盤菌Sclerotinia sclerotiorum中細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1， Cdk1）通過調控鈣離子的濃度控制菌株有絲分裂，最終影響了菌株的有性生殖能力[56]。在對寄主侵染能力的研究方面，鈣調磷酸酶基因Crz1調控稻瘟菌Magnaporthe oryzae和灰葡萄孢Botrytis cinerea附著胞形成，該基因缺失后造成菌株侵染能力顯著降低[78]。由于稻瘟菌在生長發(fā)育和侵染機制等方面有許多植物病原真菌所共有的特點，且較易開展遺傳分析，因此，稻瘟菌可作為研究絲狀真菌生長發(fā)育和侵染、致病機制的模式生物[9]。隨著稻瘟菌基因組測序的完成，鈣離子信號相關基因得到鑒定，推動了稻瘟菌中鈣離子信號通路的研究。MoCCH1和MoMID1是鈣離子信號傳遞中的關鍵基因，張弘敲除這兩個基因后發(fā)現(xiàn)菌絲生長緩慢，產孢量下降，并且表現(xiàn)為對酸敏感[10];MoCMK1基因編碼一個推定的鈣離子/鈣調蛋白依賴性激酶，該基因的缺失導致菌株致病力降低[11];He等研究了MoCMKK2基因，發(fā)現(xiàn)基因缺失突變體與野生型相比，分生孢子的產孢量明顯增加，但是營養(yǎng)生長、分生孢子的萌發(fā)、附著胞的形成以及對水稻的致病性等均無明顯變化[12]。gzslib202204041218

近年來，鈣離子指示蛋白（genetically encoded Ca2+ indicator， GECIs）成為應用最廣泛的鈣離子細胞成像工具之一，在研究生物體不同組織、系統(tǒng)的生理功能和發(fā)育機制方面做出了重要貢獻[13]。但仍存在一些問題，例如其響應速度較慢，對鈣離子濃度響應范圍有限等。Nakai等于2001年構建了一種鈣離子指示蛋白GCaMPs，相較于早期的GECIs，這種蛋白具有不易降解，熒光強度高，鈣離子濃度響應范圍大等優(yōu)點[14]。隨后GCaMP2～GCaMP5相繼出現(xiàn)，在黑腹果蠅Drosophila melanogaster和哺乳動物神經細胞中成功應用。目前，鈣離子響應蛋白已經發(fā)展到GCaMP6，并在斑馬魚Danio rerio、果蠅和小鼠Mus musculus體內成功表達用于觀察鈣離子介導的神經元活性[15]。GCaMPs系列蛋白主要由3部分構成，包括圓環(huán)排列的綠色熒光蛋白cpGFP（circularly permuted green fluorescent protein）、鈣調蛋白CaM（calmodulin）和與鈣調蛋白互作的M13肽段組成。發(fā)光基團包裹在cpGFP中，而CaM-M13復合體位于發(fā)光基團一側。當細胞中鈣離子與鈣調蛋白結合后，CaM-M13復合體構象發(fā)生變化，進而使發(fā)光基團外露綠色熒光增強。因此對各個亞基氨基酸的改造，增強對鈣離子結合的靈敏度和提高熒光亮度一直是GCaMPs系列蛋白的改進方向[16]。

稻瘟菌作為重要的植物病原菌嚴重影響了水稻生產，稻瘟菌中鈣離子相關基因影響菌株發(fā)育和致病力已有報道，但是稻瘟菌在侵染過程中其細胞質中鈣離子動態(tài)變化仍不清楚。因此本研究通過構建鈣離子響應蛋白GCaMP6s稻瘟菌異源表達菌株，將鈣信號可視化，為進一步研究稻瘟菌在生長發(fā)育和侵染過程中細胞質中鈣離子變化，侵染機制和防治方法提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試劑

稻瘟菌YN153和YN157、大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株、稻瘟菌表達載體pYF11、酵母菌株EGY48均由本實驗室保存，稻瘟菌的培養(yǎng)、保存及基因組提取參照Talbot等的方法[17]。Taq酶、高保真酶購于南京諾唯贊生物技術有限公司;限制性內切酶Xho Ⅰ購于TaKaRa公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和大腸桿菌質粒小量提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;酵母質粒小量提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司;細胞壁裂解酶購自Sigma-Aldrich公司;博來霉素購自Solarbio公司。YEPD液體培養(yǎng)基（20 g葡萄糖，20 g蛋白胨，10 g酵母粉，定容至1 L）用于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的培養(yǎng);液體CM培養(yǎng)基（3 g酸水解酪蛋白，3 g酶水解干酪素，6 g酵母粉，10 g蔗糖，定容至1 L）用于真菌菌絲生長;TB3培養(yǎng)基（3 g酵母粉，3 g酸水解干酪素，20%蔗糖，0.7%低熔點瓊脂糖，定容至1 L）用于原生質體的再生培養(yǎng);色氨酸缺陷型培養(yǎng)基（山梨醇182.2 g，不含氨基酸的基礎培養(yǎng)基6.7 g，缺失色氨酸的培養(yǎng)基0.74 g，葡萄糖20 g，定容至1 L）用于酵母轉化子的篩選。試驗所用引物由筆者設計（表1），引物的合成均由昆明擎科生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 GCaMP6s基因的克隆

以質粒pGP-CMV-GCaMP6s為模板，使用高保真核酸聚合酶和引物對GCaMP6s-F/GCaMP6s-R（表1）對GCaMP6s編碼區(qū)擴增，擴增片段長度為1 356 bp。產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對片段大小正確的條帶切膠回收純化。

1.2.2 RP27pro∶GCaMP6s表達載體的構建

本研究利用稻瘟菌中啟動27號核糖體蛋白基因表達的啟動子RP27作為GCaMP6s在稻瘟菌中表達的啟動子。使用限制性內切酶XhoⅠ處理穿梭質粒pYF11成線性化載體，將經膠回收純化的目的片段和pYF11共轉化到色氨酸合成缺失的酵母菌株EGY48感受態(tài)細胞中，并將其均勻涂在色氨酸缺陷型培養(yǎng)基上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落，加到5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中30℃ 120 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，使用酵母質粒提取試劑盒提取質粒RP27pro∶GCaMP6s。將提取的質粒RP27pro∶GCaMP6s轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，并將其均勻涂布在含有50 μg/mL氨芐青霉素（Amp）的LB平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過夜。以引物對pYF11-NP-SEQ-F/GCaMP6s-R（表1）對挑取的單菌落進行PCR驗證，擴增片段長度為2 145 bp，挑取5個陽性菌株送昆明擎科生物技術有限公司測序。通過DNAMAN軟件分析測序結果，驗證正確后，提取質粒備用。

1.2.3 PEG介導的稻瘟菌原生質體轉化

PEG介導的稻瘟菌原生質體轉化方法參照文獻[18]。

將燕麥固體培養(yǎng)基上的稻瘟菌YN153和YN157切成小塊，置于液體CM培養(yǎng)基中，28℃ 150 r/min培養(yǎng)3 d;過濾收集菌絲后轉移至細胞裂解酶溶液中，28℃ 80 r/min裂解2～3 h，鏡檢原生質體裂解情況，10倍鏡下原生質體的數(shù)量達到1×106個可進行后續(xù)試驗。用1×STC溶液重懸原生質體，并將濃度調整為1×108個/mL。將200 μL原生質體與30 μL質粒混合，28℃黑暗孵育20 min，加入1.5 mL含有40% PEG的STC溶液，共同孵育20 min后加入TB3液體培養(yǎng)基，28℃ 80 r/min過夜復蘇12 h。將復蘇后的菌株涂布于含有150 μg/mL博來霉素的TB3固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.4 重組表達菌株的篩選gzslib202204041218

在復蘇后第5天，挑取在含150 μg/mL博來霉素的TB3培養(yǎng)基上能夠正常生長的單菌落轉移至含有博來霉素的PDA上擴大培養(yǎng)，提取菌絲DNA，以引物對GCaMP6s-F/GCaMP6s-R進行PCR驗證，陽性菌株轉化子送昆明擎科生物技術有限公司測序。使用DNAMAN軟件對測序結果進行分析，驗證正確后將菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 重組表達菌株的熒光觀察

挑取鑒定成功的轉化子菌絲分別加到含有20 μL超純水和0.01 g/mL CaCl2溶液的載玻片上，在0 h和2 h分別通過熒光顯微鏡觀察GCaMP6s基因在重組表達菌株中的表達情況。對綠色熒光較強的轉化子進行單孢培養(yǎng)，將熒光蛋白穩(wěn)定表達的轉化子用滅菌紙片干燥保存。

1.2.6 重組表達菌株的表型觀察

1.2.6.1 重組表達菌株的菌落形態(tài)觀察

將野生型菌株及篩選成功的轉化子分別接種到PDA平板上，28℃黑暗培養(yǎng)，7 d后觀察測量野生型和重組表達菌株菌落形態(tài)和大小。每個菌株分別接種3個PDA平板，試驗重復3次。

1.2.6.2 重組表達菌株分生孢子的產孢量測定

使用燕麥培養(yǎng)基作為產孢培養(yǎng)基，每個菌株分別接種3個平板，28℃黑暗培養(yǎng)4 d，光照培養(yǎng)10 d，向平板中加入5 mL無菌水將分生孢子洗下，在血球計數(shù)板上計數(shù)并統(tǒng)計產孢量，試驗重復3次。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 23中的student t 測驗分析數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 RP27pro∶GCaMP6s表達載體的構建及PCR鑒定

使用引物對GCaMP6s-F/GCaMP6s-R以含有GCaMP6s（片段大小為1 356 bp）的質粒為模板，獲得了用于連接pYF11載體的目的基因，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小正確（圖1）。利用酵母重組將目的基因與pYF11連接并轉入稻瘟菌YN153與YN157中。使用引物對pYF11-NP-SEQ-F/GCaMP6s-R進行菌落PCR鑒定（條帶大小為2 145 bp），陽性率達到89%（圖2）。從PCR陽性菌株中隨機挑選5個樣品送到昆

明擎科生物技術有限公司測序，測序結果同目的片段一致，表明GCaMP6s正確連接到pYF11上（圖3）。

2.2 重組表達菌株的遺傳轉化及篩選

提取轉化的稻瘟菌株菌絲DNA后，使用引物對pYF11-NP-SEQ-F/GCaMP6s-R進行PCR鑒定（條帶大小為2 145 bp），結果表明，8個菌株DNA中均擴增到GCaMP6s片段（圖4）。

2.3 重組表達菌株的熒光觀察

對轉化并篩選成功的重組表達菌株YN153-RP27pro∶GCaMP6s和YN157-RP27pro∶GCaMP6s進行熒光顯微鏡觀察，通過滴加0.01 g/mL CaCl2溶液和超純水的對比處理，發(fā)現(xiàn)加0.01 g/mL CaCl2溶液的營養(yǎng)菌絲及孢子細胞中均能觀察到較強的綠色熒光，連續(xù)培養(yǎng)3代后，其綠色熒光依然保持良好（圖5），說明該基因已在稻瘟菌中穩(wěn)定表達，并且參與了稻瘟菌對鈣離子的響應。

2.4 重組表達菌株的生長及產孢量的測定

為了進一步分析GCaMP6s基因的轉入是否影響稻瘟菌營養(yǎng)生長及產孢，將兩個野生型菌株和兩個重組表達菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基以及燕麥培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后在PDA培養(yǎng)基上測量菌落直徑并拍照;培養(yǎng)14 d后計數(shù)燕麥培養(yǎng)基上的產孢量，發(fā)現(xiàn)重組表達菌株與野生型菌株的菌絲生長和產孢量均沒有顯著差異（圖6），結果表明GCaMP6s基因的轉入不影響稻瘟菌的菌絲生長和產孢。

3 討論

由于鈣離子在細胞生命活動過程中發(fā)揮重要作用，因此鈣離子細胞成像已成為現(xiàn)代生物學的前沿課題。細胞游離鈣的檢測方法主要有鈣離子選擇性微電極法、同位素示蹤法、核磁共振法、熒光指示劑法等。其中，鈣離子選擇性微電極法反應速度較慢，可能會損害質膜引起滲漏;同位素示蹤法對靜息狀態(tài)Ca2+不敏感，試劑有一定的放射性;核磁共振法成本太高，不能普遍適用[19]。而熒光指示劑法有很多優(yōu)點：比如熒光探針易導入細胞，對細胞無損傷;反應速度快;能與其他多種先進技術聯(lián)合應用等[20]。較早用于鈣離子成像的是一種單分子熒光指示劑fura-2和Oregon Green BAPTA-1，但是這種染料對成像背景要求高，為了避免背景因素的干擾，只能對單個細胞進行染色觀察[21]。

鈣離子指示蛋白GCaMP6s作為一種人工合成蛋白對細胞內鈣離子濃度變化敏感，并將鈣信號可視化，極大地推動了鈣離子信號傳導研究，并在動物、植物和微生物中大量應用。稻瘟菌中鈣離子信號通路的研究主要涉及菌株生長發(fā)育和致病性，但是在鈣離子可視化方面未見報道。由于GCaMP6s屬于外源基因，選用合適的啟動子對于基因的異源表達十分重要，植物基因工程中應用的異源組成型啟動子主要有CaMV 35S啟動子，它是花椰菜花葉病毒侵染時啟動35S RNA合成基因的啟動子，在基因功能研究中應用廣泛;常用的還有來自農桿菌的Nos和Ocs啟動子。在絲狀真菌中，3-磷酸甘油脫氫酶編碼的基因gpdA在構巢曲霉Aspergillus nidulans中能夠驅動異源基因的轉錄;里氏木霉Trichoderma reesei pki1是編碼丙酮酸激酶組成型表達的基因，常用于表達一些篩選標記基因和報告基因[22];RP27啟動子屬于稻瘟菌中核糖體蛋白家族基因的啟動子，具有啟動能力強，表達穩(wěn)定的特點，因此本研究選用具有RP27啟動子的pYF11載體進行研究，并成功構建了YN153-RP27pro∶GCaMP6s和YN157-RP27pro∶GCaMP6s異源表達菌株，熒光顯微鏡觀察表明，GCaMP6s基因接收到鈣離子信號后，能夠在菌絲和分生孢子中穩(wěn)定表達，而且不影響菌株的生物學特性。本研究可為后續(xù)稻瘟菌細胞質中鈣離子濃度變化與菌株生長發(fā)育和侵染之間關系的研究提供材料。gzslib202204041218

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