牛彥波，安 琦，原 韜，曹亞彬

(黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010)

玉米是黑龍江省的主要農(nóng)作物，其產(chǎn)量居于全省第一。年種植玉米面積近667萬(wàn)hm2[1]，因此每年玉米秸稈的產(chǎn)量較大。玉米秸稈在自然狀態(tài)下?tīng)I(yíng)養(yǎng)價(jià)值很低，粗纖維含量高，消化率低，適口性差，作為牲畜的粗飼料品質(zhì)不佳，飼喂?fàn)I養(yǎng)價(jià)值較低，動(dòng)物對(duì)秸稈采食量低。然而，玉米秸稈黃貯能夠降低粗纖維的含量，改善其適口性，從而促進(jìn)動(dòng)物采食，提高秸稈飼料化的利用率。研究表明，黃貯可以保留秸稈中85%的養(yǎng)分，令秸稈多汁，柔軟，適口性更佳。黃貯秸稈比干秸稈更能刺激反芻動(dòng)物的食欲，促進(jìn)其消化腺分泌，令反芻動(dòng)物飼料采食速度和采食量分別提高43%、20%[2]。玉米秸稈黃貯添加酶制劑是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。纖維素酶能將植物中的纖維素降解，變?yōu)楦菀妆粍?dòng)物消化的單糖物質(zhì)，從而提高粗飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因而纖維素酶的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。添加纖維素酶后，植物細(xì)胞壁被分解，產(chǎn)生的碳水化合物給乳酸菌發(fā)酵提供底物，產(chǎn)生乳酸，不斷促進(jìn)秸稈發(fā)酵。1993年，趙長(zhǎng)友等[3]研究發(fā)現(xiàn)，添加纖維素酶可以改善黃貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，提高營(yíng)養(yǎng)成分，抑制霉菌生長(zhǎng)，防止腐敗，提高窖貯的完好率。薛艷林等[4]報(bào)道，纖維素酶制劑處理黃貯小麥，可以顯著降低黃貯飼料的pH值及ADF、NDF、氨態(tài)氮含量，還顯著提高了LA、揮發(fā)性脂肪酸和CP的含量。但是，目前關(guān)于黃貯玉米秸稈中添加纖維素酶的效果結(jié)果并不一致，原因可能有多種，如玉米秸稈種類的差異、酶種類的差異、酶活標(biāo)記不準(zhǔn)確、黃貯時(shí)間及方式不統(tǒng)一等。酶制劑的應(yīng)用也受到了應(yīng)用條件的制約，其中溫度的影響至關(guān)重要。低溫條件下，酶解效果會(huì)受到嚴(yán)重影響，所以在應(yīng)用上存在問(wèn)題。利用纖維素酶降解玉米秸稈中的粗纖維水平，通過(guò)測(cè)定不同黃貯階段NDF、ADF和乳酸菌的變化來(lái)驗(yàn)證纖維素酶在玉米秸稈降解中的作用。

1 材料

酶制劑：諾維信液體酶制劑，酶活10 000 U/g。玉米秸稈：由市場(chǎng)購(gòu)買。MRS固體培養(yǎng)基配方：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉 4.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂 0.2 g、檸檬酸三銨 2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、瓊脂粉18 g、水1 000 ml ，pH 6.2±0.2，121℃20 min滅菌。

2 試驗(yàn)方法與內(nèi)容

2.1 試驗(yàn)方法

玉米秸稈的處理方法：在自然風(fēng)干后碾碎，用鍘刀將其切短到 2～4 cm ，再用粉碎機(jī)粉碎至1～0.5 cm。玉米秸稈黃貯時(shí)使用2～4 cm的干秸稈。干秸稈的水分含量小于10%。

酶液的處理：取原酶液10 mL，加入到90 mL純凈水中，為含酶量10%的稀釋酶液，混勻備用。

測(cè)定方法：活菌數(shù)的測(cè)定采用稀釋平板法；中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)依照Van Soest等方法進(jìn)行測(cè)定。

數(shù)據(jù)分析：采用Excel97-2003和SPSS Statistics 17.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2.2 試驗(yàn)內(nèi)容

2.2.1 溫度對(duì)纖維素酶水解玉米秸稈的影響

采用減重法，將溫度設(shè)定為15℃、30℃、45℃，振蕩，pH自然，天數(shù)設(shè)定為5 d。將經(jīng)過(guò)處理的干秸稈裝入濾袋中，每袋加入秸稈1 g左右，用塑封機(jī)封口，編號(hào)，待用。每克秸稈樣品中加入稀釋后的酶液0 uL、0.5 uL、2 uL、4 uL。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。將各處理樣品裝入不同的燒杯中，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同的酶液，補(bǔ)充水分至100 mL，放置于不同的環(huán)境中進(jìn)行處理，5 d后將各樣品停止處理，用純凈水清洗，直至水無(wú)色為止，傾去純凈水，置于80℃烘箱中烘干至恒重。

2.2.2 不同黃貯時(shí)間及不同纖維素酶添加量對(duì)樣品NDF、ADF及乳酸菌的影響

每個(gè)處理秤取玉米秸稈500 g，按照酶的添加量共設(shè)計(jì)6組，每克干秸稈中加入0 ug、0.5 ug、5 ug、50 ug、500 ug的夏盛全組分纖維素酶，添加1 000 mL純凈水，混拌均勻，分裝于5個(gè)抽真空密封袋中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。溫度設(shè)定為常溫25℃～30℃，每15 d、30 d、45 d、60 d取樣測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 溫度與纖維素酶添加量對(duì)玉米秸稈的影響

從表1溫度對(duì)纖維素酶水解玉米秸稈的試驗(yàn)與數(shù)據(jù)分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，低溫不利于纖維素酶的作用，與其他溫度條件下對(duì)比，在P<0.05水平，具有顯著性的差異；溫度并不是越高越能促進(jìn)纖維素酶的酶解，45℃與30℃的秸稈失重率之間差異不顯著；研究發(fā)現(xiàn)在15℃的低溫條件下酶解的時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，但與對(duì)照之間仍存在著較顯著的差異，秸稈粗纖維的降解率提高了0.5%以上，30℃和45℃與對(duì)照比存在著顯著的差異，30℃時(shí)秸稈粗纖維的降解率提高了3.3%以上，45℃時(shí)秸稈粗纖維的降解率提高了5.4%以上；但在水解試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，酶量增加并不與降解率呈現(xiàn)正相關(guān)性，數(shù)據(jù)分析顯示，酶量的多少對(duì)于玉米秸稈的粗纖維降解并沒(méi)有顯著的差異。在添加纖維素酶4.0 uL組，30℃時(shí)酶水解能力反而高于45℃時(shí)酶水解玉米秸稈的失重率，說(shuō)明酶解并沒(méi)有隨著溫度的升高與酶量的增加而提高，反而表現(xiàn)出抑制反作用，所以用纖維素酶處理秸稈僅需要適量的酶量和必要的溫度，而無(wú)須高酶量和相對(duì)高溫條件。

表1 溫度、酶量對(duì)玉米秸稈粗纖維的影響Tab.1 Effect of temperature and cellulaseon on crude fiber of corn stalk

3.2 黃貯天數(shù)與纖維素酶不同添加量對(duì)NDF、ADF、乳酸菌活數(shù)的影響

表2的結(jié)果顯示了玉米秸稈在不同黃貯天數(shù)、不同纖維素酶添加酶量條件下，對(duì)NDF、ADF、與乳酸菌活菌數(shù)量的影響關(guān)系。

表2 纖維素酶不同添加量與秸稈黃貯天數(shù)對(duì)NDF、ADF與乳酸菌的影響Tab.2 Effect of cellulase of different additive amounts and yellow corn straw storage days on NDF, ADF and lactic acid bacteria

從數(shù)據(jù)分析結(jié)果來(lái)看，添加纖維素酶與不添加纖維素酶，玉米秸稈NDF與ADF有顯著性的差異，添加纖維素酶后，玉米秸稈NDF與ADF在各個(gè)處理組中均有明顯的降低。在第30 d的結(jié)果中，添加量達(dá)到5 ug/g、50 ug/g、500 ug/g的處理組，NDF均值分別從82.27%下降了4.87%、9.77%、26.30%，第45 d的時(shí)候，分別從81.93%下降了6.67%、11.67%、21.47%，第60 d時(shí)分別從82%下降了6.03%、10.40%、26.87%，隨著添加量的增加，降解率增加。從天數(shù)來(lái)看，最初的30 d，降幅明顯，第60 d時(shí)降幅變化不大，說(shuō)明纖維素酶的作用與時(shí)間并不是正相關(guān)性的，它的作用是有時(shí)效性的，ADF的結(jié)果分析與NDF纖維素酶的作用能力基本一致；從不同天數(shù)與不同纖維素酶添加量對(duì)樣品中的乳酸菌影響來(lái)看，酶量的增加與時(shí)間對(duì)乳酸菌的數(shù)量均有顯著性差異，500 ug/g的處理組中，乳酸菌的活菌數(shù)量最高，第45 d以后活菌的數(shù)量達(dá)到了1.4×108cfu/g以上，超過(guò)同溫度下其他組別1～3個(gè)數(shù)量級(jí)。說(shuō)明纖維素酶的添加有效地將秸稈中的大分子物質(zhì)進(jìn)行了降解，小分子糖類物質(zhì)的增加促進(jìn)了厭氧條件下乳酸菌的活性，在開(kāi)袋時(shí)聞到了比對(duì)照更大的酸香味，從側(cè)面驗(yàn)證了加入適量纖維素酶促進(jìn)了秸稈發(fā)酵中產(chǎn)酸微生物群落的繁殖。

天數(shù)數(shù)據(jù)采用LSD 分析方法，在P<0.05時(shí)，*表示差異顯著。

4 討論

通過(guò)以上研究可以確定，在玉米秸稈黃貯過(guò)程中，添加纖維素酶能夠促進(jìn)秸稈中粗纖維的降解，有利于產(chǎn)酸微生物乳酸菌的生長(zhǎng)。隨著酶量的增加，NDF與ADF的下降幅度也在增加，但這種降幅與對(duì)照相比并不具有正相關(guān)性，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在45 d以后基本會(huì)處于穩(wěn)定期，這應(yīng)該與秸稈中營(yíng)養(yǎng)成分的消耗有關(guān)系。如果隨著黃貯時(shí)間的再延長(zhǎng)，同等條件下，添加纖維素的組別與不添加纖維素的組別之間的差距會(huì)縮小，但縮小的幅度還需進(jìn)一步的驗(yàn)考證。乳酸菌的數(shù)量隨著酶量增加呈遞增趨勢(shì)，與對(duì)照相比差距極顯著，數(shù)量增加了3個(gè)數(shù)量級(jí)。隨著黃貯的時(shí)間延長(zhǎng)，在同酶量水平下變化不顯著，僅是同一數(shù)量級(jí)內(nèi)的少量增加，這也符合微生物的生長(zhǎng)曲線，在一定的階段處于穩(wěn)定。但纖維素酶的添加對(duì)玉米秸稈黃貯過(guò)程中產(chǎn)酸微生物群落的貢獻(xiàn)是巨大的。干黃秸稈由于水分含量低，粗纖維含量高，微生物很難利用。在自然的黃貯狀態(tài)下，各類微生物需要漫長(zhǎng)的過(guò)程進(jìn)行代謝降解，黃貯時(shí)間長(zhǎng)，降解效能低，加入纖維素酶之后，可以很快提高大分子物質(zhì)的降解，促進(jìn)微生物對(duì)小分子物質(zhì)的利用，使其中的微生物快速繁殖，大大縮短了秸稈黃貯的時(shí)間，對(duì)秸稈的飼料化應(yīng)用具有促進(jìn)作用。