石 琳，陳國(guó)慶，王艷榮，雷 晨，張 勇

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是指在妊娠期發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖耐量異常，隨著肥胖的流行和孕產(chǎn)婦年齡的增高，GDM 患病率不斷上升[1]。GDM 可增加巨大兒、難產(chǎn)兒、早產(chǎn)兒、畸形胎兒及死胎的分娩率[2]。研究表明，GDM 時(shí)高糖狀態(tài)可刺激腎組織細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)異常，導(dǎo)致孕婦腎組織糖原累積，從而增加對(duì)葡萄糖的利用，以致產(chǎn)生過(guò)多的中間代謝產(chǎn)物，最終通過(guò)激活多元醇通路、晚期糖基化終末代謝產(chǎn)物、二酰甘油-蛋白激酶C 途徑等進(jìn)一步損害腎臟組織[3]。而GDM腎臟損害的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，血脂異常、高血壓、血管功能障礙及其他心臟代謝異常等因素均與GDM 腎臟損害有關(guān)[4]。近年來(lái)，不斷有研究發(fā)現(xiàn)Notch 信號(hào)通路在腎小管上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用[5-6]。但Notch 信號(hào)通路在GDM 腎臟損害中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)建立GDM 小鼠模型，檢測(cè)小鼠腎組織標(biāo)本中Notch 信號(hào)通路家族成員（Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1）的表達(dá)情況，以觀察Notch 信號(hào)通路是否參與妊娠期糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）腎臟損害過(guò)程，旨在深入分析妊娠期DN 腎臟損害的發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12 只清潔級(jí)別的C57BL/6 小鼠（6～8 周齡）由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，體重18～22g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：[SCXK（京）：2019-0007]。飼養(yǎng)條件：溫度控制在22℃～26℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%，光照條件控制為12h 光處理和12h 暗處理交替循環(huán)，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周。本研究方案通過(guò)單位動(dòng)物倫理學(xué)審查。

1.2 試劑與儀器

①試劑：鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，北京索萊寶科技有限公司），水合氯醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），蛋白酶抑制劑[中科瑞泰（北京）生物科技有限公司]，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），一抗Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1（Thermo Fisher 公司），β-actin 抗體（英國(guó)Abcam 公司），辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗（北京全式金生物技術(shù)有限公司），PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒（日本Takara 公司），LightCycler 480 SYBR Green I Master 試劑盒（Roche 公司），葡萄糖測(cè)定試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），糖化血紅蛋白分析試劑盒（挪威Axis-Shield 公司）。②儀器：石蠟切片機(jī)（德國(guó)SLEE 公司），全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman 公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、蛋白印跡電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與模型的建立

所有小鼠使用普通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，按2:1 的比例將雌鼠與雄鼠合籠，于第2 日清晨檢查小鼠陰道栓或陰道分泌物涂片鏡檢，發(fā)現(xiàn)精子者記為妊娠0 天，標(biāo)記孕鼠開(kāi)始計(jì)算孕期，所有雌鼠孕前血糖水平正常。將孕鼠分為DN 組和對(duì)照組，每組各6 只。DN 組孕鼠腹腔注射2% 的STZ 溶液（55mg/kg），以制備DN 模型，對(duì)照組孕鼠予以腹腔注射等量枸椽酸鹽緩沖液（0.1mmol/L）。1 周后測(cè)定造模小鼠的血糖和尿糖水平，血糖≥16.67mmol/L、尿糖≥3+為造模成功的DN 小鼠，分別于成模后2、4、8 周，收集小鼠血液，檢測(cè)生化指標(biāo)；8 周末，使用10%水合氯醛腹腔注射處死小鼠，取其腎臟組織，使用4%中性甲醛固定用于HE 染色及免疫組織化學(xué)染色；取部分腎臟組織用于提取蛋白和RNA，Western blot 檢測(cè)Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1 蛋白表達(dá)，Real-time PCR 檢測(cè)Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 的表達(dá)。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè)

生化指標(biāo)包括血糖（blood glucose，Glu）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及尿酸（uric acid，UA）水平。采用己糖激酶法檢測(cè)Glu 水平，采用HbA1c 分析試劑盒檢測(cè)HbA1c 水平，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)Scr、BUN、UA 水平。

1.3.3 HE 染色

取兩組小鼠腎組織標(biāo)本，制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木精伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，于光鏡下觀察腎臟組織的病理學(xué)形態(tài)，并拍照。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色

取兩組腎臟組織標(biāo)本，制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，進(jìn)行抗原修復(fù)，加入3%H2O2清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加山羊血清進(jìn)行封閉，滴加一抗[Notch1（1∶300）]，滴加二抗，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，進(jìn)行DAB 顯色，滴加蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。陽(yáng)性結(jié)果：可見(jiàn)棕黃色或棕褐色染色。

1.3.5 Western blot檢測(cè)Notch信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達(dá)水平

取兩組腎臟組織標(biāo)本，加入1mL 蛋白裂解液進(jìn)行組織勻漿，冰上裂解30min，4℃、12 000rpm 離心10min，棄掉上清液，測(cè)定蛋白濃度；取30μg 蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗[Notch1（1∶500）、Jagged1（1∶300）、Hes1（1∶300）、Hey1（1∶500）、β-actin（1∶5 000）]孵育過(guò)夜，二抗（1∶5 000）孵育2h；滴加預(yù)先配制的ECL 化學(xué)發(fā)光混合液，避光靜置5min，置于顯影儀中曝光顯影并拍照，采用Gel 凝膠圖象處理軟件檢測(cè)各樣品蛋白灰度值，并計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平，目的蛋白表達(dá)水平以目的蛋白灰度值和內(nèi)參蛋白灰度值比值表示。

1.3.6 Real-time PCR 檢測(cè)Notch 信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量

取兩組腎臟組織標(biāo)本，加入1mL Trizol 溶液進(jìn)行裂解，按說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA；測(cè)定RNA 濃度，使用PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；以cDNA 為模板進(jìn)行RT-PCR，Jagged1、Notch1、Hes1 和Hey1 作為目的基因，β-actin作為內(nèi)參基因。β-actin 引物序列為：F：5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，R：5′-CCA AGA AGA AGG CTG GAA AA-3′；Notch1 引物序列為：F：5′-GTG GAT GAC CTA GGC AAG TCG-3′，R：5′-GTC TCC TCC TTG TTG TTC TGC A-3′；Jagged1 引物序列為：F：5′-AGA AGT CAG AGT TCA GAG GCG TCC-3′，R：5′-AGT AGA AGG CTG TCA CCA AGC CAA C-3′；Hes1引物序列為：F：5′-CAC GAC ACC GGA CAA ACC A-3′，R：5′-GCC GGG AGC TAT CTT TCT TAA GTG-3′；Hey1 引物序列為：F：5′-AAG ACG GAG AGG CAT CAT CGA G-3′，R：5′-CAG ATC CCT GCT TCT CAA AGG CAC-3′。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，采用2-△△Ct法計(jì)算Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)間對(duì)比采用重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠腎臟組織形態(tài)觀察結(jié)果

8 周時(shí)，HE 染色可見(jiàn)對(duì)照組小鼠腎小管結(jié)構(gòu)清晰且正常，而DN 組小鼠腎小球體積增大，基底膜不規(guī)則增厚，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，見(jiàn)圖1。

圖1 HE 染色觀察小鼠腎組織形態(tài)（×400）Fig.1 Observation of kidney tissue morphology of mice by HE staining(×400)

2.2 兩組小鼠生化指標(biāo)比較

2 周、4 周、8 周時(shí)，DN 組小鼠Glu、HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平均顯著高于對(duì)照組小鼠（P＜0.05），且HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平隨著DN 病程延長(zhǎng)而升高，見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠生化指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators between the two groups (±s)

表1 兩組小鼠生化指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators between the two groups (±s)

注：F1、P1 是DN 組2 周、4 周、8 周的比較；t1、P1 為對(duì)照組與DN 組2 周比較；t2、P2 為對(duì)照組與DN 組4 周比較；t3、P3 為對(duì)照組與DN 組8 周比較。

組別對(duì)照組DN 組2 周4 周8 周F1/P1 t1/P1 t2/P2 t3/P3 Glu（mmol/L）7.75±1.30 HbA1c（%）3.49±0.68 Scr（μmol/L）24.16±4.05 BUN（mmol/L）10.31±2.57 UA（μmol/L）102.05±16.39 128.27±19.03 145.49±21.15 185.72±24.68 11.030/0.001 2.557/0.029 3.977/0.003 6.981/＜0.001 26.83±3.74 27.50±3.09 29.84±4.16 1.101/0.358 11.804/＜0.001 14.431/＜0.001 12.415/＜0.001 6.72±0.81 10.06±1.47 15.37±2.03 49.370/＜0.001 7.481/＜0.001 9.936/＜0.001 13.593/＜0.001 30.35±4.98 37.81±6.33 51.83±7.92 16.778/＜0.001 2.362/0.040 4.449/0.001 7.619/＜0.001 19.10±2.84 24.94±4.16 36.18±6.04 21.931/＜0.001 5.621/＜0.001 7.329/＜0.001 9.654/＜0.001

2.3 免疫組織化學(xué)染色觀察兩組小鼠腎臟組織中Notch1 表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Notch1 陽(yáng)性定位于腎小球固有細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞胞漿，呈黃色或棕黃色，對(duì)照組小鼠腎小球和腎小管上皮細(xì)胞中幾乎不表達(dá)Notch1，DN 組小鼠腎小球中可見(jiàn)少量Notch1表達(dá)，腎小管上皮細(xì)胞Notch1大量表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)染色觀察兩組小鼠腎組織中Notch1 表達(dá)情況（×400）Fig.2 Observation of Notch1 expression in kidney tissue of mice in the two groups by immunohistochemical staining(×400)

2.4 兩組小鼠Notch 信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達(dá)水平比較

DN 組小鼠Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組小鼠（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組小鼠Notch 信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of protein expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

表2 兩組小鼠Notch 信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of protein expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

組別對(duì)照組DN 組tP Notch1 0.14±0.03 0.23±0.05 3.781 0.004 Jagged1 0.42±0.06 0.85±0.09 9.738＜0.001 Hes1 0.38±0.05 0.77±0.06 12.231＜0.001 Hey1 0.17±0.04 0.39±0.07 6.684＜0.001

2.5 兩組小鼠Notch 信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

DN 組小鼠Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組小鼠（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩組小鼠Notch 信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of mRNA relative expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

表3 兩組小鼠Notch 信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of mRNA relative expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

組別對(duì)照組DN 組tP Notch1 1.02±0.07 1.55±0.19 6.411＜0.001 Jagged1 0.98±0.08 1.64±0.15 9.510＜0.001 Hes1 0.95±0.07 2.41±0.22 15.490＜0.001 Hey1 1.03±0.05 1.68±0.16 9.498＜0.001

3 討論

3.1 Notch 信號(hào)通路在腎小球疾病中的作用

在許多慢性腎臟疾病中，Notch 信號(hào)通路成員被認(rèn)為是腎損害的生物標(biāo)志物[7]。Notch 信號(hào)通路可在腎再生、足細(xì)胞凋亡、增殖、成纖維細(xì)胞活化及誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。Yao 等[9]通過(guò)使用血管緊張素Ⅱ刺激小鼠足細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠足細(xì)胞中Notch1、Hes1、Ⅳ型膠原和層粘連蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而干擾Notch 可抑制Ⅳ型膠原和層粘連蛋白表達(dá)，提示Notch 信號(hào)通路在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的足細(xì)胞外基質(zhì)合成中起著重要作用。Nishad 等[10]報(bào)道指出，激活Notch 信號(hào)通路可調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和腎纖維化，抑制Notch 信號(hào)通路可能成為DN 的潛在治療靶點(diǎn)。故Notch 信號(hào)通路可能是糖尿病腎臟損害的原因之一。

3.2 Notch 信號(hào)通路與DN 腎臟損害的關(guān)系

方曉琳等[11]研究表明，通過(guò)抑制Notch 信號(hào)通路可降低高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2 細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡。另外，有研究亦顯示，調(diào)節(jié)活性氧產(chǎn)生和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要蛋白適配器P66shc 在STZ 誘導(dǎo)的DN 小鼠中表達(dá)明顯上調(diào)，培養(yǎng)的MPC5 足細(xì)胞經(jīng)高糖處理后其存活率明顯降低，P66shc 過(guò)表達(dá)進(jìn)一步加速細(xì)胞凋亡，而抑制Notch 信號(hào)通路可下調(diào)P66shc 表達(dá)，提示高糖環(huán)境下P66shc 通過(guò)Notch 信號(hào)通路誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，2 周、4 周、8 周時(shí)，DN 組小鼠Glu、HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平均顯著高于對(duì)照組小鼠，且HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平隨著DN病程延長(zhǎng)而升高，表明DN 小鼠存在明顯的腎損傷，且隨著病程延長(zhǎng)，小鼠腎損傷越嚴(yán)重。本研究中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腎小球和腎小管上皮細(xì)胞中幾乎不表達(dá)Notch1，DN 組小鼠腎小管上皮細(xì)胞Notch1 大量表達(dá)，腎小球中也可見(jiàn)少量Notch1 表達(dá)，提示Notch1 上調(diào)表達(dá)參與了DN 小鼠腎損傷過(guò)程。

本研究通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，DN 組小鼠Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組小鼠，Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量也顯著高于對(duì)照組小鼠，提示Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 均參與了DN 小鼠腎損害過(guò)程。劉興梅等[13]報(bào)道表明，DN 小鼠腎臟組織中Notch1 蛋白表達(dá)明顯增加，自噬和纖維化被明顯抑制，其機(jī)制可能與激活蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白信號(hào)通路有關(guān)。此外，Chen 等[14]研究指出，通過(guò)阻斷Notch 信號(hào)通路能夠抑制腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損傷，從而減輕尿毒癥癥狀。Tian 等[15]亦發(fā)現(xiàn)，抑制Notch 信號(hào)通路可改善DN 小鼠抗氧化反應(yīng)，延緩腎間質(zhì)纖維化，改善糖尿病癥狀。故通過(guò)阻斷Notch 信號(hào)通路可能會(huì)減輕DN 的腎損害程度，改善DN 腎臟預(yù)后，進(jìn)而為DN 臨床治療提供科學(xué)根據(jù)。但Notch 信號(hào)通路在DN 小鼠腎損害中的具體作用機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，DN 小鼠腎臟組織中Notch 信號(hào)通路蛋白表達(dá)明顯增加，Notch 信號(hào)通路可能在DN 腎臟損害發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，深入研究Notch信號(hào)通路在DN 腎臟損害中的具體作用機(jī)制，有助于指導(dǎo)臨床尋找有關(guān)DN 治療的新的分子靶點(diǎn)，具有一定意義。