王 瓊，齊志業(yè)，姚 勤，段 江，鐘慶華，張彩營，梁 琨

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院新生兒遺傳代謝病篩查中心，云南 昆明 650032）

相較于傳統(tǒng)的一種方法只能檢出一種疾病的生化檢測方法，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)運用一個濾紙干血斑標本，1 次實驗可檢測40 多種指標，篩查數(shù)十種氨基酸、有機酸和脂肪酸代謝病，兼具高效性、特異性和敏感性，越來越多的遺傳代謝病通過串聯(lián)質(zhì)譜檢測被診斷。然而正確評估是否患病的主要標準是將檢測結(jié)果與切值（cut-off value）進行比較，因此制定適合自己實驗室的篩查切值尤為重要。國內(nèi)外研究顯示，不同出生胎齡、體重的新生兒氨基酸、肉堿代謝水平存在差異[1-4]，本研究回顧性分析了昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院新生兒遺傳代謝病篩查中心不同出生胎齡新生兒的干血斑中氨基酸、游離肉堿和?；鈮A濃度水平，并分別建立其參考區(qū)間。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013 年1 月至2020 年12 月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院新生兒遺傳代謝病篩查中心做串聯(lián)質(zhì)譜篩查的52 526 例新生兒干血斑標本，根據(jù)出生時胎齡（gestational age，GA）不同，分為早產(chǎn)組（32 周≤胎齡＜37 周）和正常孕周組（37 周≤胎齡≤42 周），分別有5 694 例、46 832 例。本研究獲得家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集

按照新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（2010 版）的要求，于生后3～7d 內(nèi)、充分哺乳6 次后采集新生兒足跟血，滴于whatman 903 號濾紙片，形成直徑≥8mm 的3 個血斑。血片采集后懸空平置，室溫自然干燥成深褐色，塑料袋密封裝好，在5 個工作日內(nèi)送至新生兒遺傳代謝病篩查中心實驗室，放入4℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.3 試劑、儀器和檢測方法

采用美國PerkinElmer 公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿測定試劑盒（neobase non-derivatized MSMS Kit），對濾紙干血斑中的11 種氨基酸、游離肉堿（C0）和31 種酰基肉堿進行檢測，儀器為美國ABI（Applied Biosystems）公司的API3200MDTM 串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，檢測方法按照試劑盒操作說明書進行。

1.4 質(zhì)量控制

每批次實驗均采用PerkinElmer 公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿測定試劑盒內(nèi)的高低兩種水平質(zhì)控品進行檢測，結(jié)果均符合質(zhì)控要求。室間質(zhì)控為每年參加國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心的新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查-氨基酸和?；鈮A的室間質(zhì)量評價，同時參加美國CDC（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的室間質(zhì)量評價體系，成績均合格。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。偏態(tài)分布資料以四分位數(shù)表示。組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。選用第0.5 百分位值與第99.5 百分位值作為切值的上下限[5]。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較

早產(chǎn)組與正常孕周組的性別、采血日齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組新生兒一般情況比較[n（%）,xˉ±s]Table 1 Comparison of general situation of neonates between the two groups[n(%),xˉ±s]

2.2 不同出生胎齡新生兒氨基酸、游離肉堿和?；鈮A參考區(qū)間的建立

采用第0.5 百分位值與第99.5 百分位值（P0.5～P99.5）作為不同出生胎齡新生兒11 種氨基酸、游離肉堿和30 種?；鈮A參考區(qū)間的上下限，見表2。結(jié)果顯示，11 種氨基酸及C0、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C10、C14、C14:2、C16:1、C18:2 的99.5% 上限值：早產(chǎn)組高于正常孕周組；C6DC、C12、C16 的99.5%上限值：早產(chǎn)組低于正常孕周組；C0 的0.5%下限值：早產(chǎn)組高于正常孕周組；瓜氨酸、甲硫氨酸、C16、C18、C18:1 的0.5%下限值：早產(chǎn)組低于正常孕周組。其余酰基肉堿的0.5%下限值與99.5%上限值在兩組間無明顯變化或相差不大。

表2 不同出生胎齡新生兒氨基酸、游離肉堿和?；鈮A參考區(qū)間（μmol/L，P0.5～P99.5）Table 2 Reference ranges of amino acids, free carnitine and acyl carnitine for neonates with different gestational ages（μmol/L,P0.5～P99.5）

2.3 參考區(qū)間重設(shè)定前后部分質(zhì)量指標變化情況

對于之前篩查的陽性結(jié)果及部分篩查質(zhì)量指標，用重新設(shè)定的參考區(qū)間做前后分析，重設(shè)定參考區(qū)間后，假陽性率在早產(chǎn)組和正常孕周組分別由8.17%、4.86% 下降到3.72%、1.48%，陽性預(yù)測值分別由0.56%、1.44%上升到2.17%、3.41%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 參考區(qū)間設(shè)定前后部分質(zhì)量指標對比分析Table 3 Comparison of some quality indexes before and after reference range setting

3 討論

3.1 新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查切值設(shè)置的重要性

遺傳代謝?。╥nherited metabolic diseases，IEM）是由于基因突變引起酶、受體、載體等蛋白活性降低或功能缺陷，導(dǎo)致體內(nèi)生化物質(zhì)在合成、代謝、轉(zhuǎn)運和儲存等方面出現(xiàn)各種異常，造成中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積，或終末代謝產(chǎn)物缺乏，從而導(dǎo)致機體生化代謝紊亂，引起一系列臨床癥狀的一組特殊疾病[6]。串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)的運用，使我們能檢測更多的遺傳代謝病，而不恰當(dāng)、不合理的切值設(shè)定可能導(dǎo)致假陰性或者假陽性，造成臨床判讀的偏差[7-8]。國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心2017 年室間質(zhì)量評價（external quality assessment，EQA）計劃臨床判斷值的調(diào)查結(jié)果顯示，35%的實驗室氨基酸和?；鈮A臨床判斷值與預(yù)期結(jié)果不一致。分析原因發(fā)現(xiàn)，其中68%的實驗室是由于切值設(shè)置不合理造成的[9]。

3.2 早產(chǎn)組和正常孕周組串聯(lián)質(zhì)譜篩查切值分析

早產(chǎn)兒與足月兒體內(nèi)相關(guān)代謝酶成熟度存在差異，血液代謝物水平也有較大差異，檢測結(jié)果可能過高或過低，故切值計算需要考慮胎齡因素，提高篩查特異度，盡量避免假陽性或假陰性[10-11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，11 種氨基酸及C0、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C10、C14、C14:2、C16:1、C18:2 的99.5%上限值，早產(chǎn)組高于正常孕周組。C6DC、C12、C16 的99.5%上限值，早產(chǎn)組低于正常孕周組。因為C0 降低提示原發(fā)性肉堿缺乏癥，而C0 的0.5%下限值早產(chǎn)組高于正常孕周組，C16、C18 和C18:1 降低提示肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ缺乏癥，C16、C18、C18:1 的0.5%下限值早產(chǎn)組低于正常孕周組。瓜氨酸降低提示尿素循環(huán)障礙相關(guān)疾病，甲硫氨酸降低提示甲基丙二酸血癥或同型半胱氨酸血癥，瓜氨酸和甲硫氨酸的0.5%下限值早產(chǎn)組也低于正常孕周組，所以臨床判斷時要考慮胎齡因素，避免假陽性和假陰性。其余酰基肉堿的0.5%下限值與99.5%上限值在兩組間無明顯變化或相差不大。

通過對部分篩查質(zhì)量指標進行參考區(qū)間設(shè)定前后的對比分析，發(fā)現(xiàn)不管是早產(chǎn)組還是正常孕周組，篩查的假陽性率均明顯下降，陽性預(yù)測值均提高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明按照不同胎齡對串聯(lián)質(zhì)譜檢測參考區(qū)間進行設(shè)定，分別進行陽性預(yù)判，能大大提高檢測的特異度，降低假陽性率。

3.3 展望

本研究的早產(chǎn)組數(shù)據(jù)，僅包括32 周≤胎齡＜37周，后續(xù)應(yīng)該對胎齡＜32 周，以及不同出生體重的新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查數(shù)據(jù)進行分析，進一步完善陽性切值。隨著實驗數(shù)據(jù)的不斷增多，也需要定期調(diào)整參考區(qū)間。也建議各實驗室根據(jù)自己區(qū)域人群、地區(qū)差異、實驗方法的不同而建立適合自己實驗室的串聯(lián)質(zhì)譜檢測參考區(qū)間，利用大數(shù)據(jù)建立早產(chǎn)兒獨立的新生兒篩查的切值[12]，降低假陽性率或假陰性率，提高陽性預(yù)測值。