孫浩男，鄭 妍，李明陽(yáng)，劉冬云，王 鑫，田 琳

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000)

柳葉菜科(Onagraceae)月見(jiàn)草屬(OenotheraL.)植物多為一、二年生或多年生草本，原產(chǎn)美洲溫帶至亞熱帶地區(qū)，全屬約150多種，我國(guó)各省均有栽培引種，部分淪為逸生。月見(jiàn)草屬植物適應(yīng)性強(qiáng)，部分種類(lèi)如長(zhǎng)果月見(jiàn)草(O.marcrocarpa)、美麗月見(jiàn)草(O.speciosa)等具有花大色香、花量豐富、花期長(zhǎng)的特點(diǎn)，觀(guān)賞價(jià)值極高，是出色的地被植物，常用于園林綠化。在我國(guó)東北地區(qū)，常大面積栽培夜來(lái)香(O.biennes)作為油用植物，經(jīng)過(guò)常年的選育，已從野生種及野生轉(zhuǎn)栽培種中篩選出一批含油量較高的品系，其種子油中富含的γ-亞麻酸具有一定抗炎、降血脂的功效，具有一定藥用價(jià)值。除此，月見(jiàn)草屬植物也具蜜源、釀酒、纖維和香精等用途[1-3]。

核型參數(shù)是植物分類(lèi)、鑒定的重要指標(biāo)之一，通過(guò)核型分析，能從細(xì)胞學(xué)方面研究植物的遺傳多樣性[4]。目前，核型分析已成功在菊花[5]、百合[6]和蝴蝶蘭[7]等觀(guān)賞花卉上得到應(yīng)用。從現(xiàn)有報(bào)道來(lái)看，我國(guó)月見(jiàn)草屬植物資源的質(zhì)量參差不齊，更是存在同種異名的現(xiàn)象[8]，極大地影響了我國(guó)月見(jiàn)草屬植物進(jìn)一步的研究和應(yīng)用。目前，月見(jiàn)草屬的植物雖然已有細(xì)胞學(xué)標(biāo)記方面的研究，但其主要集中在其染色體環(huán)、染色體連接現(xiàn)象，及其染色體的異位突變性[8-10]等，而有關(guān)染色體核型的極少，更是缺乏同屬間物種染色體核型的比較，截至目前，國(guó)內(nèi)僅有夜來(lái)香和小花山桃草(O.parviflora)2個(gè)種的核型進(jìn)行了報(bào)道[2,11-12]。如今，隨著月見(jiàn)草屬植物在我國(guó)不斷歸化，對(duì)我國(guó)常見(jiàn)的月見(jiàn)草屬植物進(jìn)行細(xì)胞學(xué)方面的研究，并明確其染色體形態(tài)及核型特征具有十分重要的意義。因此，采用常規(guī)壓片法，對(duì)國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的10個(gè)月見(jiàn)草屬植物的染色體數(shù)目及核型等參數(shù)進(jìn)行了研究，旨在為其資源鑒定、利用和細(xì)胞學(xué)研究等方面提供更多理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為10種月見(jiàn)草屬植物的成熟種子，A-H采自河北綠地花卉景觀(guān)研創(chuàng)中心引種圃，I和J分別引自英國(guó)Thompson&Morgan和Plant Word Seeds園藝公司，其他信息詳見(jiàn)表1。

表1 供試月見(jiàn)草材料的基本信息

1.2 方法

使用墊有潤(rùn)濕濾紙的干凈培養(yǎng)皿在光照培養(yǎng)箱中對(duì)種子進(jìn)行催芽生根，其余方法參考孔令月等[4]的研究方法，并進(jìn)行改良：切取根尖先端1～3 cm置于冰水混合物中預(yù)處理24 h；隨后使用卡諾氏固定液浸泡20～24 h；用蒸餾水沖洗3～5次；使用1 mol/L的稀鹽酸在60 ℃水浴鍋中進(jìn)行解離，解離時(shí)間依據(jù)根尖大小進(jìn)行調(diào)整；再次用蒸餾水沖洗3～5次，吸取多余水分后置于載玻片上，用鑷子挑取根尖先端1～5 mm，搗碎后滴入2～3滴改良卡寶品紅染色10～30 min；蓋上蓋玻片，使用帶有橡皮頭的鉛筆輕敲促使細(xì)胞分散，至根尖整體呈云霧狀；使用Leica DM4000熒光顯微鏡觀(guān)察制片，對(duì)染色體分散良好且處于中期分裂相的細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)察拍照。

核型數(shù)據(jù)測(cè)量和處理等參考戴小紅等[13]的研究，觀(guān)察和統(tǒng)計(jì)至少30個(gè)有絲分裂中期相細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，參考李懋學(xué)等[14-15]對(duì)5個(gè)分散良好且數(shù)目清晰的中期分裂相進(jìn)行核型分析，染色體類(lèi)型按照A.Levan等[16]的標(biāo)準(zhǔn)，核型類(lèi)型分析參照G.L.Stebbins等[17]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)按照Arano[18]的方法計(jì)算。參考孫桂芳等[19]的方法，以平均臂比和核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)制作核型坐標(biāo)圖。參考秦丹等[20]的方法制作染色體核型聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目與倍性

根據(jù)圖1和表2中的染色體形態(tài)與染色體參數(shù)進(jìn)行同源染色體配對(duì)，其中，H細(xì)胞中的28條染色體可配成7對(duì)，為四倍體，其余9種月見(jiàn)草的14條染色體均可配成7對(duì)，為二倍體，染色體基數(shù)均為x=7。

2.2 染色體核型分析

由表2和表3可知，10種月見(jiàn)草的染色體組成類(lèi)型單一，僅含有m和sm 2種類(lèi)型，A和E全部由m型染色體組成，其余由m型和sm型2種染色體組成。染色體相對(duì)長(zhǎng)度相差不大，分別為A(12.99%～15.67%)、B(11.79%～20.01%)、C(12.07%～17.65%)、D(11.17%～20.21%)、E(12.96%～16.03%)、F(11.77%～16.16%)、G(11.99%～18.09%)、H(12.98%～15.33%)、I(12.28%～16.77%)、J(12.22%～16.19%)。除A外，在其余9種月見(jiàn)草中發(fā)現(xiàn)隨體，均處于染色體的短臂上，隨體數(shù)量上存在一定差別，4個(gè)(C、G、I、J)為1條，2個(gè)(D、H)為2條，3個(gè)(B、F、G)為3條，隨體所在的染色體序號(hào)也存在差別，分別為B(4號(hào),6號(hào),7號(hào))、C(7號(hào))、D(4號(hào),7號(hào))、E(5號(hào))、F(4號(hào),5號(hào),6號(hào))、G(1號(hào),4號(hào),7號(hào))、H(1號(hào),7號(hào))、I(4號(hào))、J(7號(hào))。在H中發(fā)現(xiàn)1條B染色體，其余材料中則未發(fā)現(xiàn)B染色體。核型類(lèi)型存在3種，A和E為1A型，I為3A型，其余均為2A型。核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)介于56.79%～65.43%，整體較為對(duì)稱(chēng)，由小到大可排序?yàn)椋篈、E、C、J、H、D、B、G、F、I。平均臂比為1.33～1.92，最長(zhǎng)染色體/最短染色體值介于1.21～1.81，臂比大于2的染色體占染色體總數(shù)的百分比為0%～57.14%。

2.3 染色體進(jìn)化趨勢(shì)及聚類(lèi)分析

依據(jù)核型坐標(biāo)圖(圖2)可知，I處于坐標(biāo)圖的最右上角，最為進(jìn)化，而A和E處于左下角，較為原始。根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果，在遺傳距離為1.0時(shí)，10種月見(jiàn)草被劃分為4類(lèi):A、C、E為一類(lèi)；D、H、J為一類(lèi)，F(xiàn)、G、I為一類(lèi)；而B(niǎo)為單獨(dú)一類(lèi)。當(dāng)遺傳距離為2.0時(shí)，B與F、G、I聚為一類(lèi)；當(dāng)遺傳距離為3.0時(shí)，10種月見(jiàn)草明顯劃分為2大類(lèi)，其中B、F、G、I為一類(lèi)，其余6種月見(jiàn)草聚為一類(lèi)；當(dāng)遺傳距離為25.0時(shí)，所有月見(jiàn)草聚為一類(lèi)。sect.Oenothera的4個(gè)材料(在坐標(biāo)圖與聚類(lèi)圖中的位置較為分散，平均臂比和核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)上A

3 結(jié)論與討論

有關(guān)核型試驗(yàn)細(xì)胞的最佳解離時(shí)間，因植物物種本身和取材部位等而不同[4-5,19-20]。本試驗(yàn)解離部位為月見(jiàn)草種子萌發(fā)后的根尖部位，在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，不同種類(lèi)的月見(jiàn)草在最佳解離時(shí)間上存在一定差異。如坤沙月見(jiàn)草和美麗月見(jiàn)草等一些種子極小的材料(直徑1 mm)，解離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致根尖部位難以分辨甚至解離過(guò)度，將其解離時(shí)間保持在4～5 min，得到的壓片細(xì)胞分散情況極好；而無(wú)莖月見(jiàn)草(直徑2 mm)和長(zhǎng)果月見(jiàn)草(直徑3～5 mm)等在6～8 min較為合適，這與周俊英[11]的研究方法不同。

月見(jiàn)草屬染色體多倍化發(fā)生較少，但18個(gè)組中有10個(gè)組存在這個(gè)現(xiàn)象[21]。從現(xiàn)有報(bào)道來(lái)看，月見(jiàn)草屬染色體基數(shù)為x=7，月見(jiàn)草屬植物的染色體存在2n=14,28,42,56[22]。本試驗(yàn)有9種材料的染色體為2n=2x=14，H美麗月見(jiàn)草為2n=4x=28，與L.L.Wolin等[23]報(bào)道的(2n=2x=14，2n=4x=28，2n=6x=42)部分一致，未發(fā)現(xiàn)其他倍性的多倍體、非整倍體及混倍體。B染色體對(duì)于增強(qiáng)植物的抗逆性有一定作用[24-25]，美麗月見(jiàn)草具有適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)旺盛的特點(diǎn)，大量地應(yīng)用到了我國(guó)城市綠化中，B染色體可能增強(qiáng)了其對(duì)環(huán)境的強(qiáng)適應(yīng)性，但在加拿大一枝黃花(Solidagocanadensis)[26]、薇甘菊(Mikaniamicrantha)[27]的報(bào)道中，B染色體的出現(xiàn)頻率也與強(qiáng)入侵性相關(guān)。

一般認(rèn)為，核型的進(jìn)化趨勢(shì)為染色體的對(duì)稱(chēng)程度和倍性的提高，依據(jù)核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)可初步分析物種間的進(jìn)化趨勢(shì)[28]。在柳葉菜族(Tribeonagreae)中，地?zé)熁▽?Gayophytum)和月見(jiàn)草屬的所有7對(duì)染色體是在減數(shù)分裂中交換臂形成，并作為一個(gè)單位進(jìn)行分離，這可能是造成月見(jiàn)草屬植物核型較為對(duì)稱(chēng)的主要原因[29]。從先前報(bào)道過(guò)的月見(jiàn)草屬的夜來(lái)香和小花山桃草[12]來(lái)看，兩者核型均為1A型，屬于極為原始的類(lèi)型。而本試驗(yàn)的10種月見(jiàn)草材料核型也多為1A型和2A型，A夜來(lái)香的核型與周俊英[11]所得出的1A型一致，核型公式也相同，但在核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)等核型參數(shù)及隨體方面存在一定差距。在核型方面上看，美麗月見(jiàn)草的2A型雖為原始，但染色體倍性方面較為進(jìn)化。月見(jiàn)草屬植物具有極強(qiáng)的染色體的異位突變性，永久易位雜交品系的同源重組和染色體的自由分離會(huì)受到抑制而不易產(chǎn)生后代[8]，而待宵草 ‘檸檬日落’的核型為3A型，其在品種選育中可能發(fā)生了其他類(lèi)型染色體變異。

根據(jù)POWO(plants of the world online)上最新登錄的國(guó)際月見(jiàn)草屬植物名單，密蘇里月見(jiàn)草已修訂并為長(zhǎng)果月見(jiàn)草。本試驗(yàn)中，F(xiàn)長(zhǎng)果月見(jiàn)草和G密蘇里月見(jiàn)草在核型類(lèi)型、核型公式、平均臂比及不對(duì)稱(chēng)系數(shù)等核型參數(shù)上均相差無(wú)幾，結(jié)合核型散點(diǎn)圖和聚類(lèi)分析圖的結(jié)果，兩者在細(xì)胞學(xué)方面具有極為緊密的親緣關(guān)系。我國(guó)月見(jiàn)草屬植物種類(lèi)眾多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至2006年，我國(guó)引入的月見(jiàn)草約20種[3]，而后十幾年內(nèi)名錄并無(wú)更新。此次供試的月見(jiàn)草屬植物種類(lèi)有限，但在各核型參數(shù)上存在差別，染色體的異位突變性可能是該屬植物核型多樣性的主要原因，染色體整體上較為對(duì)稱(chēng)，核型屬于較為原始的類(lèi)型。除夜來(lái)香外，其余9種月見(jiàn)草的核型均為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。這些數(shù)據(jù)從細(xì)胞學(xué)標(biāo)記方面為我國(guó)月見(jiàn)草屬植物的鑒定和分類(lèi)提供了一定理論基礎(chǔ)。但是不同產(chǎn)地的材料也可能存在不同的核型特征，這需要收集更廣泛的資源來(lái)進(jìn)行對(duì)比探討。