胡小寧，李 甜，郭 芹，李寧陽(yáng)，張 雨，屈 陽(yáng)，王新萍,4，唐曉珍,*，王 強(qiáng),*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

白藜蘆醇（resveratrol，Res）又稱芪三酚，是一種存在于虎杖、花生、葡萄等植物中的非黃酮類多酚化合物，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用，但存在熔點(diǎn)高、脂溶性差、靶點(diǎn)多、生物利用度低等問題，限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。為了解決以上問題，Res酯化改性近年來備受關(guān)注；酰氯法、Steglich法、酶法等成功用于Res芳香酯、Res長(zhǎng)鏈脂肪酸酯、Res中鏈脂肪酸酯和Res長(zhǎng)鏈脂肪酸酯的合成，并利用硅膠柱層析法、制備液相和重結(jié)晶法進(jìn)行純化，薄層層析法、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectra，F(xiàn)TIR）法、核磁共振及高效液相色譜法對(duì)Res酯進(jìn)行表征，取得了重要的研究進(jìn)展，但鮮見相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)綜述。本文重點(diǎn)綜述了國(guó)內(nèi)外Res酯的性質(zhì)、Res酯化改性方法、分離純化技術(shù)及表征方法的研究現(xiàn)狀和最新進(jìn)展，以期為Res酯的定向合成及應(yīng)用提供方法和技術(shù)支撐。

1 Res酯的性質(zhì)與作用

1.1 Res性質(zhì)

Res化學(xué)名稱為3,4’,5-三羥基二苯乙烯，分子式為C14H12O3，相對(duì)分子質(zhì)量為228.25[1-2]。常溫下為白色針狀晶體，難溶于水和油，見光易分解，易溶于多數(shù)有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、氯仿等）[3]。在自然界中以順式、反式Res和順式、反式Res苷4 種形式存在，熔點(diǎn)為256～257 ℃，當(dāng)溫度高于280 ℃時(shí)開始熱分解成苯酚和間二苯酚，超過425 ℃時(shí)氧化和熱解生成一氧化碳和二氧化碳[4]?，F(xiàn)有研究已證明Res在植物中主要以反式構(gòu)象存在，反式Res的活性遠(yuǎn)高于順式Res[5]，且反式Res中4’-OH的活性＞3-OH的活性＞5-OH的活性，4’-OH為主要活性位點(diǎn)，由于4’-OH的鍵長(zhǎng)最長(zhǎng)，容易斷裂，反應(yīng)活性最好，即發(fā)生酯化反應(yīng)時(shí)4’-OH最先參與反應(yīng)[6]。這些活性的—OH在不同的條件下會(huì)與FeCl3（暗綠色）、氨水（紅色）、醋酸鎂的甲醇溶液（粉紅色）等發(fā)生顯色反應(yīng)[7]。

1.2 Res酯的性質(zhì)

Res的3 個(gè)羥基在一定條件下與羧酸、酰氯或酸酐等發(fā)生酯化反應(yīng)生成單酯、二酯和三酯（圖1），根據(jù)不同的原料比例和反應(yīng)條件會(huì)生成不同的酯化產(chǎn)物。經(jīng)過酯化的Res難溶于水，但其脂溶性大大提高，并且脂溶性隨著脂肪酸鏈的延長(zhǎng)而增加，隨著脂肪酸不飽和度的增加而降低[8]。目前，酯化改性的Res主要是Res三酯，如Res芳香酯、Res長(zhǎng)鏈脂肪酸酯、Res中鏈脂肪酸酯及Res短鏈脂肪酸酯，其中Res芳香酯比例最大?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Res磺酸酯與乙酰阿魏酸酯為黃色固體，其余Res芳香酯為白色固體；Res長(zhǎng)鏈、中鏈與短鏈脂肪酸酯大部分為黃色固體，脂肪酸烷基數(shù)目越多，與羥基發(fā)生反應(yīng)的能壘就越高，酯化越困難，經(jīng)過酯化后的Res由于部分羥基被長(zhǎng)鏈烷烴取代，其分子間氫鍵作用力減小，熔點(diǎn)降低，且隨著取代基團(tuán)數(shù)量的增多而逐漸降低[9]。盡管Res酯化后活性的羥基被取代，但仍表現(xiàn)出良好的抗氧化活性[10]和穩(wěn)定性。當(dāng)改性變成Res三酯時(shí)，由于其結(jié)構(gòu)中無酚羥基，故不能發(fā)生顯色反應(yīng)（圖1）。

圖1 白藜蘆醇和白藜蘆醇酯分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Molecular structures of resveratrol and resveratrol esters

Res酯化改性既提高了Res的脂溶性和穩(wěn)定性，也降低了不飽和脂肪酸的氧化速率，對(duì)Res的高效利用具有重要實(shí)際意義，但對(duì)不同結(jié)構(gòu)（單酯、二酯和三酯）、不同種類（芳香酯、脂肪酸酯等）Res酯的物理和化學(xué)性質(zhì)研究較少，亟待系統(tǒng)地研究從而進(jìn)一步拓展其應(yīng)用范圍。

1.3 Res酯的作用

關(guān)于Res的作用已有較多研究報(bào)道，且Res被證實(shí)具有抗炎[11-13]、降脂[14]、抗氧化[15-17]、抗腫瘤[18-20]和保肝[21-22]等作用。黃鵬等[23]研究發(fā)現(xiàn)Res煙酸酯對(duì)10%蛋清誘導(dǎo)大鼠足腫脹和二甲苯誘導(dǎo)大鼠耳腫脹的抑制作用優(yōu)于Res，并且還可明顯降低75%蛋黃液引起的高脂血癥模型血清中甘油三酯和血清總膽固醇濃度升高。Res磺酸酯也具有較好的抗氧化作用，能夠有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基，同時(shí)還能顯著抑制人體肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)，起到抗腫瘤作用，且其作用效果優(yōu)于Res[24]?，F(xiàn)有研究也發(fā)現(xiàn)Res桂皮酸酯能顯著降低CCl4引起的小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量，從而起到保肝作用[25]。Res酯化后抗氧化活性隨著取代數(shù)目增加而降低，依次為Res＞Res-3-c（單酯）＞Res-4’-c（單酯）＞Res-3,4’-c（二酯）＞Res-3,4’,5（三酯），三酯因?yàn)椴缓u基所以幾乎沒有任何抗氧化活性，其中4’-OH是決定Res抗氧化性最重要的基團(tuán)[8]。

從以上研究分析可知，Res酯化后生物利用度顯著提高，且不同種類、不同結(jié)構(gòu)的Res酯具有不同的活性和作用，且其在抗炎、抗腫瘤等方面的作用優(yōu)于Res，但有關(guān)Res酯的作用研究主要集中在不同種類的活性對(duì)比上，體內(nèi)的作用機(jī)制尚不清楚。此外，相關(guān)研究多集中于Res三酯，尤其缺乏對(duì)Res單酯和Res二酯的研究，且酯化取代位置、數(shù)量和羧酸種類的不同對(duì)其功效有何影響仍不清楚，不同酯化產(chǎn)物是否具有協(xié)同或者拮抗作用也亟待研究。

2 Res的酯化改性方法

Res含有3 個(gè)酚羥基，具有較高的生物活性，但其具有熔點(diǎn)高、脂溶性和水溶性差等特性導(dǎo)致生物利用度低，直接應(yīng)用到食品中易結(jié)晶析出，特別是在Res含量高的體系中，嚴(yán)重影響食品品質(zhì)。因此，為了增加Res的穩(wěn)定性和脂溶性，降低熔點(diǎn)，提高其生物利用度，Res的酯化改性越來越受到國(guó)內(nèi)外研究者和企業(yè)的高度關(guān)注。目前Res的酯化改性方法有化學(xué)改性法和酶催化法（表1）[26]。

2.1 化學(xué)改性法

2.1.1 酰氯酯化法

酰氯酯化法是將位阻大、難以直接酯化的羧酸先制成酰氯，再與Res發(fā)生酯化反應(yīng)的一種方法，也是目前最常用的方法，酰氯的酯化能力比相應(yīng)的羧酸和酸酐都強(qiáng)，但是改性路線復(fù)雜冗長(zhǎng)，副產(chǎn)物較多。目前使用的酰氯試劑有氯化亞砜、草酰氯、五氯化磷和三氯化磷等，最常用的是氯化亞砜，但其在反應(yīng)過程中會(huì)釋放出氯化氫和二氧化硫等酸性氣體，易對(duì)環(huán)境造成一定的污染。近年來，由于草酰氯更綠色環(huán)保，其逐步開始替代氯化亞砜[31]。由于Res難溶于水，為了增加其溶解度，常用丙酮、二氯甲烷（dichloromethane，DCM）和乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行Res的酯化改性，其中丙酮的使用較多。此外，催化劑也是酯化改性Res的關(guān)鍵因素，現(xiàn)有文獻(xiàn)已報(bào)道三乙胺、DMAP和吡啶等有機(jī)堿被用作酰氯酯化法的催化劑，為了達(dá)到最佳酯化率，應(yīng)根據(jù)羧酸的不同選擇合適的催化劑，雖然使用較多的是三乙胺，但是吡啶類催化劑可以解決反應(yīng)結(jié)束時(shí)體系容易變黑色黏稠狀的問題[25]。

酰氯酯化法的優(yōu)化反應(yīng)條件：反應(yīng)物（Res、酰氯）的物質(zhì)的量比1∶2～1∶3.5、反應(yīng)溫度25～65 ℃、反應(yīng)時(shí)間2～5 h，產(chǎn)率可達(dá)78%～92%，但收率只有10%～35%。劉耀武等[29]在用三乙胺作催化劑的基礎(chǔ)上優(yōu)化了采用DMAP催化制備Res煙酸酯的工藝，將反應(yīng)時(shí)間由4～6 h縮短至1.5～2.0 h[39]。有研究以草酰氯作為?；噭?，三乙胺為催化劑，DCM為溶劑，在冰浴下制備了Res乙酰水楊酸酯和Res肉桂酸酯、Res亞麻酸酯、Res花生四烯酸酯和Res DHA酯，收率分別達(dá)到了16.0%、16.0%、10.0%、12.6%和10.2%[40]。最近一項(xiàng)研究采用三乙胺為催化劑，丙酮為溶劑，在室溫下將Res和丙烯酰氯（物質(zhì)的量比為1∶3.5）反應(yīng)4 h，制備了一種新型Res丙烯酸酯，收率達(dá)30.2%[27]。

表1 白藜蘆醇的酯化改性方法Table 1 Esterification modification methods of resveratrol

通過以上分析可知，催化劑在酰氯酯化法中至關(guān)重要，催化劑活性低或不添加催化劑很難得到酯化產(chǎn)物；同時(shí)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)物的種類起關(guān)鍵作用，但僅通過調(diào)控反應(yīng)條件無法實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定向酯化。酰氯酯化法的機(jī)理是先利用羧酸與氯化亞砜或草酰氯反應(yīng)生成相應(yīng)的鹽，再脫去二氧化硫或一氧化碳和二氧化碳生成相應(yīng)的酰氯，接著與Res在DMAP、三乙胺等催化劑的作用下生成Res酯（圖2）。可見，要實(shí)現(xiàn)Res的定向酯化可利用溴化芐和三異丙基硅基三氟甲磺酸酯（trifluoromethanesulfonic acid triisopropylsilyl ester，TIPS-OTF）等基團(tuán)選擇性保護(hù)酚羥基，待酯化結(jié)束后脫去保護(hù)基團(tuán)即可實(shí)現(xiàn)定向酯化，但相關(guān)研究還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.1.2 Steglich酯化法

Steglich酯化法是以DCC或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC）為偶聯(lián)試劑的酯化方法，該方法具有反應(yīng)條件溫和且改性路線相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但反應(yīng)時(shí)間比酰氯法長(zhǎng)，且催化劑價(jià)格昂貴。已有的研究采用丙酮、DCM、三氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）作為溶劑，DCC與EDC作為良好的酯化縮合劑（活化羧酸），脫水促使反應(yīng)正向進(jìn)行。其中，應(yīng)用最多的縮合劑是DCC，DCC具有價(jià)格低廉、無需保護(hù)Res酚羥基等優(yōu)勢(shì)，但反應(yīng)之后會(huì)生成N,N’-二環(huán)乙基脲（N,N’-dicyclohexylurea，DCU），難以去除干凈（圖3）[35]。研究發(fā)現(xiàn)以Res和生物素（VH）為原料，DCC為縮合劑，DCM和DMF（9∶1，V∶V）作為溶劑，在低溫（4 ℃）下制備Res生物素單酯，得率達(dá)31%[35]。王鑫等[34]以丙酮為溶劑，采用DCC與EDC作為縮合劑由DMAP催化Res與2-喹啉羧酸制備Res喹啉酸酯，產(chǎn)率最高可達(dá)84.1%和72.3%。Peng Wei等[41]以乙酸酐和TIPS-OTF作為保護(hù)劑，EDC-DMAP為縮合劑，以較高收率（51%～63%）定向酯化得到4’-Res布洛芬酯。

圖2 酰氯酯化改性法機(jī)理Fig. 2 Reaction routes for acid chloride esterification modification method

圖3 Steglich酯化法機(jī)理[35]Fig. 3 Reaction routes for Steglich esterification method[35]

Steglich酯化法機(jī)理與酰氯法類似，都是先用DCC或EDC將位阻大的羧酸活化為活性酯，接著與Res在DMAP的催化作用下生成Res酯（圖3）。早期的Steglich酯化法僅用DCC作縮合劑，經(jīng)過改進(jìn)后采用EDC作縮合劑，反應(yīng)后副產(chǎn)物僅需酸性和堿性溶液洗滌即可除去，得到純酯產(chǎn)物，省去了色譜純化。采用Steglich酯化法最關(guān)鍵的是無水體系，有水會(huì)造成反應(yīng)不充分。目前Steglich酯化法可實(shí)現(xiàn)定向酯化（圖3），但是相關(guān)理論研究較為匱乏。

2.1.3 其他方法

為了提高酯化率，微反應(yīng)器酯化法也用于Res的酯化改性。李萬梅等[42]將Res的氫氧化鈉溶液與乙酸酐以1∶3～1∶6的物質(zhì)的量比混合后置于微反應(yīng)器中反應(yīng)1～10 min（20～40 ℃），連續(xù)化制備Res三乙酸酯，產(chǎn)率達(dá)45%～95%（圖4）。與酰氯酯化法和Steglich酯化法相比，該方法避免了使用大量吡啶和三乙胺等催化劑產(chǎn)生的三廢，不僅減少了環(huán)境污染，還降低了反應(yīng)溫度并縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了產(chǎn)品收率和純度，但這種改性方法設(shè)備相對(duì)昂貴。在該反應(yīng)中，若將乙酸酐置于二氯甲烷、二氯乙烷和正己烷等有機(jī)溶劑中可進(jìn)一步提高Res酯的產(chǎn)率，但相關(guān)研究仍待加強(qiáng)。本課題組采用N,N’-羰基二咪唑（N,N’-carbonyldiimidazole，CDI）活化共軛亞油酸，成功制備Res共軛亞油酸酯，酯化率達(dá)96.87%（圖5），CDI活化羧酸后副產(chǎn)物咪唑易溶于水，僅需水洗就可得到高純度的Res酯，且無有毒有害氣體產(chǎn)生，酯化效果優(yōu)于EDC，極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.2 酶催化法

酶作為生物催化劑，與化學(xué)催化劑相比，作用條件溫和，具有更好的選擇性、能控制酯化的位置和數(shù)量、副反應(yīng)少、產(chǎn)物易分離、純化步驟相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。常用的酶有諾維信脂肪酶435、脂肪酶TL IM、RM IM和PLG等，但存在成本過高、難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等問題，當(dāng)前Res酶法酯化還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段[43]，溶劑一般選用甲基叔丁基醚和離子液體。傳統(tǒng)的酶法是在水介質(zhì)中催化反應(yīng)，近年來非水介質(zhì)催化無論在理論上還是在應(yīng)用上都取得較大進(jìn)展，為酶法提供了更加廣闊的發(fā)展前景[43]。

圖5 CDI催化酯化改性法機(jī)理Fig. 5 Reaction routes for CDI-catalyzed esterification modification method

酶法的一般反應(yīng)條件：反應(yīng)物的物質(zhì)的量比（n（Res）∶n（羧酸））1∶6～1∶12，溶劑與Res體積-物質(zhì)的量比1∶0.026～1∶0.044（L/mol），脂肪酶與Res質(zhì)量-物質(zhì)的量比100∶1～150∶1（g/mol），反應(yīng)溫度20～60 ℃、反應(yīng)時(shí)間24～96 h下，酯化率達(dá)37.6%～41.7%，純度80.3%～87.8%。周大勇等[36]將Res與二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，EPA）溶于甲基叔丁基醚中，利用南極假絲酵母脂肪酶催化制備了Res EPA酯。Marian[37]首先采用酰氯法制備了Res異丁酸三酯與Res己酸三酯，然后在南極假絲酵母脂肪酶的作用下，經(jīng)過40 ℃、24 h反應(yīng)后得到了Res異丁酸二酯與Res己酸二酯，產(chǎn)率可達(dá)到25%和41%。不同脂肪酶對(duì)Res不同位置羥基酯化選擇性不同，其中諾維信脂肪酶435酯化位點(diǎn)在4’-OH，脂肪酶QLG酯化位點(diǎn)在3-OH，脂肪酶PLG在3-OH與4’-OH選擇性相同，脂肪酶TL IM在3-OH選擇性大于4’-OH，脂肪酶RM IM在4’-OH選擇性大于3-OH[44]。

綜上所述，酶法的最大優(yōu)點(diǎn)是能實(shí)現(xiàn)定向酯化，但其反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)且產(chǎn)率較低；酶的活性在酶法酯化反應(yīng)過程中也至關(guān)重要，酶的活性低或失活會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)難以進(jìn)行，因此需要控制反應(yīng)體系的溫度、pH值等使酶處于最適酶活下，才能達(dá)到最佳酯化率；酶菌種的篩選及反應(yīng)條件的優(yōu)化還有待進(jìn)一步研究。酶法酯化改性機(jī)理如圖6所示。

圖6 酶法酯化改性機(jī)理Fig. 6 Reaction routes for enzymatic esterification modification

3 Res酯的純化方法

Res酯化改性得到的粗產(chǎn)物一般純度低，還混有少量的Res和脂肪酸，而藥品、食品等行業(yè)所需的是高純度Res酯，因此需進(jìn)一步分離純化以提高其價(jià)值。到目前為止，Res酯純化的主要方法有硅膠柱層析法、制備液相色譜法和重結(jié)晶法，為了獲得更好的純化效果，往往需要多種純化方法復(fù)配使用。

3.1 硅膠柱層析法

硅膠柱層析法具有綠色環(huán)保、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在Res酯的分離純化中有很高的應(yīng)用價(jià)值。酯化改性的Res粗產(chǎn)物中常常含有游離的Res、Res單酯、二酯、三酯和過量羧酸，硅膠柱層析法可將其分離，但其分離效率低且耗時(shí)長(zhǎng)，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)，而且整個(gè)過程還需要薄層色譜法進(jìn)行輔助檢測(cè)。其常用的洗脫液為正己烷-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯和正己烷-乙酸乙酯-甲酸等。Hu Xiaopei等[30]以正己烷和乙酸乙酯（15∶1～3∶1，V/V）為洗脫液分離得到了Res辛酸單酯、二酯和三酯。馮海燕[9]以正己烷-乙酸乙酯（5∶4，V/V）為洗脫溶劑，分離得到了Res月桂酸酯。

不同的Res酯需要的洗脫溶劑類型和體積比不同，其洗脫條件應(yīng)根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，但由于硅膠柱層析法粒徑（200～300 目）相比高效液相色譜柱粒徑（3～10 μm）大上百倍，有時(shí)無法將Res酯的5 種結(jié)構(gòu)完全分離，若要獲得單一目標(biāo)物，需考慮分離效率更高的方法。

3.2 制備與半制備型液相色譜法

液相色譜法根據(jù)應(yīng)用方向分為分析型、制備和半制備液相色譜法[45]。制備與半制備液相色譜法相比于其他純化方法分辨率和成本高，常用于樣品純化的最后階段。制備與半制備液相色譜由于柱長(zhǎng)（前者20～70 cm，后者15～50 cm）、柱內(nèi)徑（前者高于20 mm，后者低于10 mm）和流速不同，兩者上樣量不同，制備型上樣量更大（0.1～100.0 g），但是沒有半制備型（＜100 mg）靈敏[46]。在Res酯的純化中，無論是制備液相色譜法還是半制備液相色譜法常用的色譜柱都為C18。常用的流動(dòng)相為乙腈-水和甲醇-水[47]。以丙酮-水作為流動(dòng)相（60∶40或55∶45，V/V）可有效分離Res月桂酸單酯與二酯[9]。Hu Xiaopei等[30]以甲醇-水為流動(dòng)相，在306 nm紫外波長(zhǎng)下，采用制備高效液相色譜法分離純化得到了Res辛酸單酯和二酯。制備和半制備液相色譜法是目前最成熟的一種純化方法，經(jīng)純化后樣品純度可達(dá)95%以上，但是其缺點(diǎn)也很明顯，如設(shè)備昂貴、運(yùn)行費(fèi)用較高、溶劑消耗大、無法避免有毒溶劑的使用等。在現(xiàn)有研究中，制備和半制備液相色譜法還無法將Res單酯、二酯和三酯完全分離，在色譜柱選擇和分離條件方面還有待優(yōu)化。

3.3 重結(jié)晶法

重結(jié)晶法是利用結(jié)晶過程中不同物質(zhì)溶解度不同而將混合物分離提純的方法。當(dāng)Res酯純度較高時(shí)（雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%）宜采用重結(jié)晶法。重結(jié)晶法操作簡(jiǎn)單、純度高、適合工業(yè)化生產(chǎn)，結(jié)晶溶劑的選擇也尤為重要。常用的結(jié)晶溶劑有甲醇、石油醚-乙酸乙酯、無水丙酮和氯仿-乙醇，結(jié)晶溶劑從毒性極大的氯仿逐步向毒性低的丙酮和甲醇轉(zhuǎn)變?，F(xiàn)有研究以氯仿-乙醇作為結(jié)晶溶劑，采用重結(jié)晶法純化Res煙酸酯，得到白色固體[29]。最新研究將Res月桂酸酯經(jīng)硅膠柱層析和半制備液相色譜分離，再以甲醇重結(jié)晶制得高純度的Res煙酸酯，純度可達(dá)99.3%[33]。

由于羧酸的種類和結(jié)構(gòu)不同，酯化改性后Res的物理化學(xué)性質(zhì)有較大差異，在進(jìn)行分離純化時(shí)，要依據(jù)酯化產(chǎn)物溶解度、純度要求以及不同改性方法引入副產(chǎn)物種類的不同來選擇合適的純化方法。

4 Res酯的表征方法

將Res酯分離純化之后，需要對(duì)其進(jìn)行表征來分析產(chǎn)物類型、純度、分子質(zhì)量和分子式等。常用的表征方法有薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）、FTIR、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrum，HPLC-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等。

4.1 薄層色譜法

TLC是利用同一吸附劑（通常選硅膠）對(duì)不同物質(zhì)的吸附能力不同，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中不同組分的有效分離，根據(jù)展開后比移值（Rf）和斑點(diǎn)數(shù)目判斷是否有新物質(zhì)生成。酯化改性的Res一般包括5 種取代產(chǎn)物，需要經(jīng)TLC分析，來判斷產(chǎn)物類別，監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程[9]。Res含有3 個(gè)－OH，極性較大，酯化改性后極性減小，并隨著取代基數(shù)量的增多而減?。≧f隨取代基數(shù)量的增多而增加）。目前，常用的展開劑組合有石油醚-乙酸乙酯和正己烷-乙酸乙酯，通常會(huì)加入少量甲酸或乙酸防止斑點(diǎn)拖尾，其中最常用的是石油醚-乙酸乙酯?，F(xiàn)有報(bào)道采用TLC分離Res月桂酸酯，比較了以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-乙酸和正己烷-乙酸乙酯-乙酸作為展開劑的分離效果，后者分離效果明顯優(yōu)于前者，當(dāng)以正己烷-乙酸乙酯-乙酸（10∶7∶1，V/V）作為展開劑時(shí)分離效果最好[8]。Oh等[10]改性得到Res DHA酯，在薄層色譜板上顯示出兩種單酯、一種二酯和一種三酯，但是從HPLC-MS譜圖看出有兩種單酯和兩種二酯，并未檢測(cè)到三酯，說明僅僅采用一種檢測(cè)方法無法準(zhǔn)確判斷出產(chǎn)物類別，要多種檢測(cè)方法共同分析。

該方法雖然簡(jiǎn)單，但是選擇合適的展開劑和比例使酯化改性后的粗產(chǎn)物全部分離是該方法的難點(diǎn)，即使產(chǎn)物與雜質(zhì)完全分離，也無法達(dá)到將已分離產(chǎn)物大量回收的目的。本課題組以正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸按10∶8∶0.1（V∶V∶V）的比例作為展開劑，采用TLC分析制備的Res共軛亞油酸酯，可將Res、Res單酯、共軛亞油酸、Res二酯和Res三酯完全分離（圖7）。

圖7 白藜蘆醇共軛亞油酸酯的TLC圖Fig. 7 Thin layer chromatogram of resveratrol conjugated linoleic acid ester

4.2 傅里葉變換紅外光譜法

紅外光譜在食品領(lǐng)域已經(jīng)應(yīng)用了幾十年，直到20世紀(jì)70年代，隨著科技的進(jìn)步，F(xiàn)TIR再次激起研究者的興趣，它可以提供化學(xué)鍵和官能團(tuán)的特征頻率，F(xiàn)TIR與傳統(tǒng)紅外光譜相比提高了譜圖分辨率，降低了譜峰寬度，大大提高了儀器靈敏度和準(zhǔn)確性，具有樣品用量少、檢測(cè)迅速、準(zhǔn)確度高和無需樣品前處理等優(yōu)勢(shì)[48]。利用FTIR可根據(jù)吸收峰來快速判斷是否有Res酯生成，掃描范圍一般在4 000～600 cm－1。對(duì)于Res，在3 500～3 000 cm－1有明顯的羥基吸收峰，如果有Res酯生成，其羥基吸收峰強(qiáng)度會(huì)明顯減小，并且會(huì)在1 740 cm－1和1 170 cm－1附近產(chǎn)生明顯的酯基（分別為C＝O和C－O）吸收峰，但無法確定具體是Res分子哪個(gè)羥基參與酯化反應(yīng)，如果在3 000 cm－1以上沒有強(qiáng)峰，說明Res 3 個(gè)羥基都參與反應(yīng)[40]。利用FTIR只能判斷酯化反應(yīng)是否發(fā)生，要想準(zhǔn)確判斷酯化位置，需借助核磁進(jìn)一步分析。

4.3 核磁共振法

NMR波譜法研究原子核對(duì)射頻輻射的吸收，是對(duì)物質(zhì)定性分析最強(qiáng)有力的工具之一，NMR近年來被廣泛應(yīng)用于Res和Res酯的相關(guān)分析，利用核磁可以判斷Res分子哪個(gè)羥基發(fā)生反應(yīng)。Res的H NMR化學(xué)位移在δ6.1～9.5[49]，C NMR化學(xué)位移在δ100～160[50]。常用的檢測(cè)溶劑有氚代二甲基亞砜、氚代氯仿（CDCl3）、氚代乙腈（CD3CN）、氚代丙酮和氚代甲醇（CD4O）。儀器兆赫數(shù)從之前的400 MHz逐漸升級(jí)為600 MHz，大大提高了譜圖的分辨率。Res的核磁氫譜從低位移到高位移特征吸收峰依次是4’位、35位、2’6’位、CH＝CH、3’5’位、26位、4位[51]。目前Res碳譜的相關(guān)研究較少。當(dāng)酯化改性后，取代位置處－OH的吸收峰會(huì)消失，其他位置的吸收峰會(huì)發(fā)生微小的偏移，可準(zhǔn)確判斷酯化位點(diǎn)。但是所檢測(cè)的樣品需要把單酯、二酯和三酯分離，純度要盡可能高，否則譜圖雜峰過多，不利于解析。

4.4 高效液相色譜法

HPLC是檢測(cè)Res及Res酯常用的方法，在低溫下即可將Res與Res酯分離，可用來監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程[52]。常用的色譜柱為C18，常用的流動(dòng)相有乙腈-水、甲醇-乙腈-水，近年來開始用更環(huán)保的甲醇-水、丙酮-水來代替乙腈，常加入醋酸、甲酸等酸性改性劑來調(diào)整峰型，獲得最大分離度。檢測(cè)波長(zhǎng)一般在306 nm，常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器（ultraviolet detector，UV）和二極管陣列檢測(cè)器（photo-diode array，PDA），UV只能獲得單一波長(zhǎng)的色譜圖，而PDA可得到某一波長(zhǎng)范圍內(nèi)所有波長(zhǎng)色譜圖，但是其靈敏度比UV低一個(gè)數(shù)量級(jí)。利用HPLC可計(jì)算Res酯的純度和酯化率，并且可以判斷產(chǎn)物類型。Res極性大，保留時(shí)間較短，如果制備單酯、二酯和三酯，保留時(shí)間依次延長(zhǎng)?，F(xiàn)有研究以丙酮-水作為流動(dòng)相、UV檢測(cè)器，采用HPLC依據(jù)峰數(shù)目來判斷所制備Res月桂酸酯的類別，分離效果良好[9]。最新報(bào)道以乙腈-水作為流動(dòng)相，采用PDA檢測(cè)器來檢測(cè)3 種Res辛酸酯在口腔、胃相和腸道的變化情況，研究了不同消化條件對(duì)酯鍵的影響[30]。HPLC-MS是在液相色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，與HPLC相比選擇性更好、靈敏度和準(zhǔn)確度更高，既能檢測(cè)單一成分，又能檢測(cè)混合物，既能定性，又能定量，其效果明顯優(yōu)于PDA和紫外檢測(cè)器，最重要的是質(zhì)譜具有強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)鑒定能力，可以根據(jù)分子質(zhì)量將未知峰準(zhǔn)確判斷出來[53]。馮磊等[35]采用HPLC-MS，以甲醇-水-1%乙酸為流動(dòng)相，檢測(cè)得到Res生物素酯的純度＞90%，相對(duì)分子質(zhì)量為454.2。在分離Res酯時(shí)，往往會(huì)遇到單酯或二酯無法完全分離。為了更好地分離Res單酯、二酯和三酯，往往需要加大流動(dòng)相中水相的比例，因?yàn)橛袡C(jī)相的比例過高會(huì)導(dǎo)致Res酯難以停留在柱中。

5 結(jié) 語

雖然我國(guó)對(duì)Res酯的相關(guān)研究較少、起步較晚，但近年來研究數(shù)量逐漸增加，尤其是定向制備不同結(jié)構(gòu)的單酯、二酯和三酯已成為未來研究的方向和攻克的技術(shù)難點(diǎn)。傳統(tǒng)化學(xué)法雖然技術(shù)成熟、產(chǎn)率高，但存在產(chǎn)物復(fù)雜、純化困難和環(huán)境污染等問題；酶法雖然環(huán)保、副產(chǎn)物少、能耗較低，但酶價(jià)格過高且活性較難保持。由于Res的酚羥基易受芳環(huán)影響，親核性降低，發(fā)生酯化反應(yīng)比醇困難，因此酯化改性工藝亟待在以下3 個(gè)方面進(jìn)行深入的研究：1）尋找綠色高效的催化劑；2）研發(fā)低成本且對(duì)環(huán)境要求低的酶制劑；3）將微波、超聲等技術(shù)應(yīng)用于Res的酯化改性。從分離純化角度看，需進(jìn)一步探索高速逆流色譜、超臨界反溶劑萃取、分子蒸餾等現(xiàn)代分離技術(shù)以實(shí)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)Res酯的高效純化。在表征方面應(yīng)根據(jù)不同結(jié)構(gòu)Res酯的性質(zhì)來選擇適合的檢測(cè)方法，單一的檢測(cè)方法很難滿足深入研究的需要，兩種及以上方法的組合、聯(lián)用是未來研究趨勢(shì)；超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）和UPLC-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜等新的結(jié)構(gòu)表征方法由于分離度好、靈敏度高、分析時(shí)間短，也可用于Res酯的分析?？傊?，隨著改性、純化、檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的先進(jìn)儀器和創(chuàng)新技術(shù)將會(huì)應(yīng)用到Res酯的研究，以期開發(fā)出低成本、高純度的Res酯產(chǎn)品，不僅能實(shí)現(xiàn)Res酯的高值化利用，同時(shí)還能滿足市場(chǎng)需求。