劉建華，曾倩華，徐霞，丁玉庭*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)2(浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州，310014)3(國(guó)家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州)，浙江 杭州，310014)4(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連，116034)

魚類富含大量?jī)?yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)，是現(xiàn)代健康飲食的首選產(chǎn)品之一。但是，由于魚體組織肌肉柔軟、蛋白質(zhì)含量高以及體內(nèi)微生物作用等原因，魚體極易發(fā)生腐敗變質(zhì)。因此，對(duì)魚體的新鮮度進(jìn)行快速有效的監(jiān)控具有重要的研究意義，有利于鮮魚產(chǎn)品的物流監(jiān)管，減少不必要的產(chǎn)品浪費(fèi)。

傳統(tǒng)的魚體新鮮度檢測(cè)方法主要包括感官評(píng)價(jià)法、物理評(píng)價(jià)法、化學(xué)評(píng)價(jià)法和微生物評(píng)價(jià)法，其檢測(cè)原理和優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示。然而，傳統(tǒng)的魚體新鮮度檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、耗力且具有破壞性。近幾年來(lái)，消費(fèi)者對(duì)于魚體新鮮度新型檢測(cè)技術(shù)的需求顯著增加。目前，盡管已經(jīng)報(bào)道了部分魚體新鮮度新型檢測(cè)技術(shù)，但是對(duì)現(xiàn)存的其他魚體新鮮度新型檢測(cè)技術(shù)，例如氣味指紋技術(shù)、新鮮度指示型智能包裝技術(shù)、蛋白組學(xué)分析技術(shù)、生物傳感器技術(shù)和光譜技術(shù)尚未進(jìn)行過(guò)大量系統(tǒng)的闡述。本綜述對(duì)這幾種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了論述和比較，并概述了當(dāng)前研究中存在的問(wèn)題和發(fā)展趨勢(shì)，為魚體新鮮度評(píng)價(jià)規(guī)范的制定提供一定的理論依據(jù)，為拓寬魚體新鮮度新型檢測(cè)方法的思路提供更多的理論支撐。

表1 魚體新鮮度傳統(tǒng)檢測(cè)方法的主要特點(diǎn)與檢測(cè)方式Table 1 The main characteristics of traditional detection methods of fish freshness

1 氣味指紋技術(shù)

氣味指紋技術(shù)是指通過(guò)使用氣相色譜、質(zhì)譜、氣體傳感器等分析手段與多元的統(tǒng)計(jì)方法相結(jié)合，分析食品中的各種揮發(fā)性芳香化合物[1]。常用于魚體新鮮度檢測(cè)的氣味指紋技術(shù)包括：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、電子鼻和電子舌等。

1.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)是一種將色譜和質(zhì)譜結(jié)合的在線檢測(cè)技術(shù)，它具有色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高定性能力，適用于復(fù)雜揮發(fā)性成分的有效分析[2]。目前，為全面高效地分析魚體中揮發(fā)性成分進(jìn)而判斷魚體品質(zhì)，研究者通常將其與其他檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合使用，如朱丹實(shí)等[3]利用電子鼻結(jié)合頂空固相微萃取和GC-MS技術(shù)分析了貯藏于0 ℃下真鯛魚肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化情況，該研究共檢測(cè)出36種揮發(fā)性物質(zhì)，其中右旋檸檬烯、十七烷、姥鮫烷、對(duì)二甲苯和萘含量與貯藏時(shí)間顯著相關(guān)，可用作真鯛冷藏期間鮮度的揮發(fā)性指示物。相似的是，徐永霞等[4]和李婷婷等[5]采用相同的方法分別對(duì)貯藏于4 ℃下的大菱鲆魚肉和三文魚片中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了鑒定與分析，該研究分別發(fā)現(xiàn)，大菱鲆中己醛、庚醛、(E-E)-2，4-庚二烯醛、1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇等物質(zhì)在新鮮魚肉中的含量明顯高于腐敗魚肉，這些物質(zhì)可以作為表征魚肉新鮮度的揮發(fā)性指示物；三文魚片新鮮度變化的拐點(diǎn)是第6天、第12天和第15天，此時(shí)間揮發(fā)性成分變化較大，可進(jìn)行新鮮度評(píng)價(jià)。

采用GC-MS技術(shù)聯(lián)合其他檢測(cè)技術(shù)評(píng)價(jià)魚體新鮮度是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)，比如氣相色譜-嗅聞技術(shù)、GC-MS-嗅覺(jué)技術(shù)等，它可以彌補(bǔ)單一技術(shù)對(duì)魚類產(chǎn)品中揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定不全面的不足。但是在研究過(guò)程中，需要克服漁獲物的貨架期短、采用多種技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果復(fù)雜等問(wèn)題，以期全面、快速且無(wú)損地獲得更多魚體新鮮度的揮發(fā)性指示物，實(shí)現(xiàn)魚體的鮮度鑒別和貨架期預(yù)測(cè)與差異評(píng)價(jià)。

1.2 電子鼻

電子鼻通過(guò)氣體傳感器對(duì)被測(cè)氣體具有不同的靈敏度，實(shí)現(xiàn)對(duì)魚體新鮮度評(píng)估，這些被測(cè)氣體主要是微生物生長(zhǎng)和生化反應(yīng)產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物(如醛、酮、酯、硫和氨化合物)[6]。電子鼻具有高效性、可靠性和易操作性，已應(yīng)用于羅非魚、三文魚、帶魚等魚類的新鮮度檢測(cè)[7-8]。但是，由于傳感問(wèn)題和模式識(shí)別問(wèn)題，電子鼻很少被商業(yè)化。例如，金屬氧化物型電子鼻對(duì)濕度敏感，需要在高溫條件下工作，不能區(qū)分非常相似的化合物。此外，電子鼻系統(tǒng)需要強(qiáng)大的交叉反應(yīng)傳感和指紋模式識(shí)別。因此，GUO等[9]將交叉反應(yīng)比色條形碼與深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(deep convolutional neural networks, DCNN)相結(jié)合，構(gòu)建了一個(gè)同時(shí)提供氣味指紋和智能指紋識(shí)別的電子鼻系統(tǒng)，利用智能手機(jī)APP界面快速、實(shí)時(shí)無(wú)損監(jiān)測(cè)肉類新鮮度，總準(zhǔn)確率達(dá)98.5%(圖1)，有望應(yīng)用于魚類新鮮度檢測(cè)。

目前，如何使電子鼻商業(yè)化仍有待進(jìn)一步深入研究，想要解決這個(gè)問(wèn)題可以嘗試構(gòu)建一個(gè)具有交叉反應(yīng)傳感器陣列和數(shù)據(jù)分析方法的電子鼻系統(tǒng)，完成從非線性數(shù)據(jù)集中提取信息并準(zhǔn)確預(yù)測(cè)指紋模式的目標(biāo)。

圖1 交叉反應(yīng)比色條形碼組合學(xué)和深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組合形成用于監(jiān)測(cè)肉新鮮度的系統(tǒng)[9]Fig.1 Working principle of the human olfactory system and our system based on colorimetric barcode combinatorics and DCNN[9]

1.3 電子舌

電子舌是根據(jù)模仿人體味覺(jué)機(jī)理研制而成，由傳感器陣列、信號(hào)采集系統(tǒng)和模式識(shí)別系統(tǒng)3部分組成[10]。評(píng)估魚體新鮮度時(shí)，大多數(shù)研究者將其氣味或味道作為考慮的唯一屬性。其中，鄭舒文等[11]使用電子鼻和電子舌技術(shù)分別檢測(cè)了鱈魚的新鮮度，結(jié)果表明，電子舌相比于電子鼻能夠更加明顯地區(qū)分鱈魚的新鮮度等級(jí)。事實(shí)上，在魚體新鮮度評(píng)價(jià)過(guò)程中，氣味和味道特征同等重要。因此，考慮將電子鼻技術(shù)和電子舌技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于魚體的新鮮度檢測(cè)是未來(lái)研究趨勢(shì)。例如，SHI等[12]證明了利用電子鼻和電子舌綜合評(píng)價(jià)貯藏于不同溫度下羅非魚片的新鮮度具有可行性和優(yōu)越性，并通過(guò)建立主成分分析和徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)貯藏于0～10 ℃下羅非魚片的新鮮度。

電子舌技術(shù)具有高靈敏度、無(wú)損檢測(cè)、食品感官和安全指標(biāo)檢測(cè)限低等優(yōu)勢(shì)，正成為魚體傳統(tǒng)檢測(cè)方法中一種很有前途的補(bǔ)充技術(shù)。但是，它經(jīng)常受到環(huán)境因素影響，例如溫度會(huì)導(dǎo)致傳感器漂移等。并且，電子舌技術(shù)對(duì)檢測(cè)對(duì)象具有局限性，譬如相比于魚肉等固體樣品，其更適用于液體食品的新鮮度監(jiān)測(cè)。目前的研究重點(diǎn)是突破電子舌技術(shù)在檢測(cè)方面的瓶頸，因此將電子舌技術(shù)與其他數(shù)據(jù)處理方法聯(lián)合使用可以彌補(bǔ)電子舌技術(shù)的不足，比如考慮將電子舌技術(shù)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法結(jié)合、或?qū)⑵渑c線性和非線性多變量算法結(jié)合等，從多個(gè)角度更加全面、詳細(xì)評(píng)價(jià)魚體新鮮度變化。

2 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器主要包括負(fù)責(zé)檢測(cè)生物成分的生物識(shí)別元件和將特定生化信息轉(zhuǎn)換為電、熱或光信號(hào)的物理或化學(xué)傳感器，其特異性主要基于生物結(jié)合反應(yīng)[13]。目前，應(yīng)用于檢測(cè)魚體新鮮度的生物傳感器包括：酶?jìng)鞲衅骱臀⑸飩鞲衅鳌?/p>

2.1 酶?jìng)鞲衅?/h3>

在酶?jìng)鞲衅髦校姌O上的固定化酶可以與目標(biāo)材料發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生電活性物質(zhì)。電極將電活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，通過(guò)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出目標(biāo)濃度[14]。目前，檢測(cè)魚體新鮮度的酶?jìng)鞲衅魍ǔＪ褂命S嘌呤氧化酶作為酶識(shí)別元件。比如，MUSTAFA等[15]開(kāi)發(fā)了一種利用黃嘌呤氧化酶(xanthione oxidase，XOD)使次黃嘌呤(hypoxanthine，HX)發(fā)生酶轉(zhuǎn)化，測(cè)量HX的酶?jìng)鞲衅?圖2)，其測(cè)量水平可與商用HX檢測(cè)試劑盒相媲美。它是一種新型的魚體新鮮度實(shí)時(shí)檢測(cè)方式，在檢測(cè)過(guò)程中不需要添加外源試劑或使用復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。最近，ZHU等[16]采用激光直寫技術(shù)，在聚酰亞胺上制備了三維多孔石墨烯柔性納米酶電極，該電極對(duì)黃嘌呤(0.3～179.9 μmol/L)和HX(0.3～159.9 μmol/L)具有酶類動(dòng)力學(xué)特征，檢出限分別為0.26 μmol/L和0.18 μmol/L。通過(guò)對(duì)XT和HX同時(shí)檢測(cè)，并結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法建立機(jī)器學(xué)習(xí)模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)魚體新鮮度的智能分析和數(shù)字輸出。

酶?jìng)鞲衅骶哂谐杀镜?、?zhǔn)確度高、精密度好、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。但是，它會(huì)出現(xiàn)電極表面缺乏再現(xiàn)性、工作電極表面鈍化等問(wèn)題。在今后研究中，酶?jìng)鞲衅鞯膫鞲胁牧细倪M(jìn)和電極選擇是亟待解決的問(wèn)題，比如考慮如何將納米材料、納米材料與高分子材料的復(fù)合以及碳基納米材料等應(yīng)用于酶?jìng)鞲衅?。此外，促進(jìn)其向微型化和智能化方向發(fā)展，也是酶?jìng)鞲衅鞯陌l(fā)展趨勢(shì)。

圖2 XOD生物傳感器概念設(shè)計(jì)和操作[15]Fig.2 The conceptual design and operation of the XOD biosensor[15]

2.2 微生物傳感器

微生物傳感器由固定化微生物與電化學(xué)裝置組成[17]，根據(jù)微生物的呼吸或代謝作用產(chǎn)生電流、電壓、電導(dǎo)的變化進(jìn)行測(cè)定。HOSHI等[18]構(gòu)建了由固定在膜內(nèi)的腐敗交替單胞菌、流動(dòng)池、氧電極、蠕動(dòng)泵、緩沖罐、恒溫控制浴和記錄器組成的微生物傳感器系統(tǒng)。通過(guò)檢測(cè)藍(lán)鰭金槍魚肉表面的化學(xué)成分和傳感器電流衰減率來(lái)評(píng)價(jià)魚肉鮮度品質(zhì)，一次檢測(cè)時(shí)間只需13 min。

微生物傳感器系統(tǒng)利用引起新鮮度變化的整體化學(xué)和酶反應(yīng)，能夠快速、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)魚體新鮮度。此外，微生物傳感器應(yīng)用于確定魚肉口味和肉類老化方面需要大量的研究工作，其發(fā)展受限于生物識(shí)別元件(微生物細(xì)胞)，這一難題也值得研究者深入探討。

3 光譜技術(shù)

光譜技術(shù)利用物質(zhì)的吸收光譜、發(fā)射光譜或散射光譜特征來(lái)研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，在檢測(cè)魚類的病原菌、外來(lái)污染、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、脂質(zhì)氧化和腐敗監(jiān)測(cè)等方面也展現(xiàn)出巨大的潛力[19]。

3.1 可見(jiàn)/近紅外光譜技術(shù)

可見(jiàn)/近紅外光輻射可用于測(cè)定魚體的有機(jī)官能團(tuán)的吸收強(qiáng)度[20]，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，可見(jiàn)/近紅外光譜技術(shù)適用范圍廣、樣品量使用少、對(duì)環(huán)境友好和可重復(fù)使用。但是，不同貯藏條件的樣品需要不同的模型，常需要校準(zhǔn)。

REIS等[21]使用可見(jiàn)/近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)區(qū)分新鮮和凍融金槍魚片，實(shí)驗(yàn)表明新鮮樣品和凍融樣品被正確檢測(cè)的概率分別為92%和82%。但是，在偏最小二乘回歸法建模之前，為消除散射和失真等噪聲，需要對(duì)頻譜進(jìn)行預(yù)處理。為了解決上述問(wèn)題，WU等[22]采用可見(jiàn)/近紅外光譜技術(shù)和雙層疊加去噪自編碼神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對(duì)低溫箱中三文魚魚肉和魚皮的新鮮度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，此方法不需要預(yù)處理，在降低噪聲和優(yōu)化初始權(quán)值方面具有更好效果，并且準(zhǔn)確性較高(R2=0.98，RMSEP=0.93 d)。因此，將可見(jiàn)/近紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法以及機(jī)器學(xué)習(xí)方法相結(jié)合，建立適合不同條件下魚樣品的分析模型，為光譜技術(shù)應(yīng)用于魚體新鮮度檢測(cè)提供多種新的可能性。

3.2 高光譜成像技術(shù)

高光譜成像技術(shù)(hysperspectral image，HSI)將計(jì)算機(jī)視覺(jué)和可見(jiàn)/近紅外光譜技術(shù)結(jié)合，得到同時(shí)具有光譜和空間信息的三維數(shù)據(jù)集[23]。其中，張文娣等[24]和章海亮等[25]采用HSI技術(shù)分別對(duì)不同解凍方式下的大口黑鱸魚和多寶魚的新鮮度進(jìn)行檢測(cè)，并準(zhǔn)確檢測(cè)出不同凍融次數(shù)和冷凍時(shí)間。然而，利用HSI技術(shù)對(duì)新鮮魚、冷藏魚和凍融魚的貯藏時(shí)間同時(shí)進(jìn)行預(yù)測(cè)和可視化的研究還很少。最近，CHEN等[26]利用HSI技術(shù)了實(shí)現(xiàn)了珍珠龍膽石斑魚在不同貯藏條件下貯藏時(shí)間的快速準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和分布可視化。采用PLS-DA和競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)重加權(quán)-偏最小二乘判別分析(competitive adaptive reweighted sampling-partial least squares-discrimination analysis, CARS-PLS-DA)對(duì)新鮮魚、冷藏魚和凍融魚進(jìn)行分類(圖3)。結(jié)果表明，PLS-DA分類結(jié)果總體較好，新鮮、冷藏和冷凍樣品的準(zhǔn)確率分別為100%、96.43%和96.43%。

HSI是一種快速、無(wú)損、可靠的新鮮度在線評(píng)估工具，并且可以檢測(cè)魚肉變質(zhì)的變化模式。HSI與化學(xué)計(jì)量學(xué)聯(lián)用對(duì)魚體新鮮度檢測(cè)是目前主要的發(fā)展趨勢(shì)，例如考慮將深度學(xué)習(xí)算法與HSI聯(lián)合使用是一個(gè)可研究方向。

圖3 數(shù)據(jù)處理流程圖[26]Fig.3 Workflow chart for data processing[26]

3.3 熒光光譜技術(shù)

樣品中熒光化合物被短波長(zhǎng)的光激發(fā)后，把能量?jī)?chǔ)存起來(lái)，緩慢發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光，這種光稱為熒光，熒光光譜技術(shù)將熒光強(qiáng)度作為發(fā)射波長(zhǎng)的函數(shù)來(lái)測(cè)量[27]。熒光光譜技術(shù)對(duì)魚類等食品可進(jìn)行快速、非接觸和非破壞性分析，測(cè)量的濃度是正常吸收光譜的千分之一。其中，前表面熒光光譜(front-face fluorescence spectroscopy，F(xiàn)FFS)技術(shù)以特定的入射角度照射魚類樣品，獲得包含理化和質(zhì)構(gòu)信息的熒光光譜，完成對(duì)魚體新鮮度的檢測(cè)[28]。如KAROUI等[29]采用前表面熒光光譜技術(shù)結(jié)合因子判別分析模型成功鑒別了新鮮鱸魚和凍融鱸魚，正確率達(dá)92%。HASSOUN等[30]采用前表面熒光光譜技術(shù)結(jié)合物理化學(xué)方法評(píng)估鱈魚在不同條件下貯藏12 d的鮮度變化，正確率可達(dá)90.5%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色氨酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的熒光強(qiáng)度與硫代巴比妥酸反應(yīng)物呈良好的相關(guān)性。

FFFS技術(shù)具有快速采集數(shù)據(jù)和替代昂貴、耗時(shí)的檢測(cè)技術(shù)的能力，以及可同時(shí)確定多個(gè)參數(shù)的潛力。隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)工具的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)FFS技術(shù)在評(píng)價(jià)魚類新鮮度方面的潛力不斷增加，未來(lái)可嘗試應(yīng)用于大量樣本以及多脂魚類等。

3.4 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜技術(shù)以拉曼散射效應(yīng)為基礎(chǔ)，不僅能夠檢測(cè)完整細(xì)胞和組織內(nèi)生化分子的濃度、結(jié)構(gòu)和相互作用，而且可以檢測(cè)魚體肌肉中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)并獲得基團(tuán)的強(qiáng)度和位置變化[31]。拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)魚體新鮮度具有無(wú)損檢測(cè)、樣品使用量少、和不需要前處理等特點(diǎn)。但是檢測(cè)過(guò)程中，拉曼散射的微弱影響、生物熒光背景信號(hào)的強(qiáng)干擾以及激光產(chǎn)生的一些熱量，可能會(huì)影響評(píng)估的有效性。同時(shí)，它不適合發(fā)射強(qiáng)熒光的材料，并且由于強(qiáng)可見(jiàn)激光照射，不穩(wěn)定的化合物通常會(huì)遇到光分解和光異構(gòu)化。目前，拉曼光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法已應(yīng)用于魚類的質(zhì)量評(píng)估。比如，VELIOGLU等[32]利用拉曼光譜結(jié)合主成分分析，成功地對(duì)來(lái)自6種凍融魚(竹莢魚、歐洲鳀魚、紅鯔魚、藍(lán)魚、大西洋鮭魚和飛魚)進(jìn)行了物種鑒別及新鮮度分析。在今后研究中，嘗試將拉曼光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法聯(lián)合應(yīng)用于其他魚種，是魚體新鮮度新型檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的一個(gè)前進(jìn)方向。

4 新鮮度指示型智能包裝技術(shù)

新鮮度指示型智能包裝由一個(gè)傳感元件組成，該元件與食物代謝物相互作用，并在食品品質(zhì)變化時(shí)顯示出明顯的顏色變化[33]。在各種傳感元件中，pH染料是智能包裝中最常用的一種。在貯存過(guò)程中，腐爛的魚產(chǎn)生揮發(fā)性胺會(huì)改變包裝內(nèi)環(huán)境的pH值，導(dǎo)致pH染料的顏色發(fā)生變化，工作原理如圖4所示[34]。近年來(lái)，應(yīng)用于檢測(cè)魚體新鮮度的指示型智能包裝以其智能化、實(shí)時(shí)監(jiān)控魚體新鮮度的功能而備受關(guān)注，但是未對(duì)其進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的闡述。表2總結(jié)了近幾年新鮮度指示型智能包裝應(yīng)用于檢測(cè)魚體新鮮度實(shí)例。

圖4 新鮮度指示膜顏色變化示意圖(以姜黃素為例)[34]Fig.4 Schematic of the changes in the freshness indicator intelligent food packaging films′color[34]

表2 新鮮度指示型智能包裝應(yīng)用于檢測(cè)魚體新鮮度實(shí)例Table 2 Examples of smart packaging for fish freshness detection

4.1 化學(xué)合成指示劑型

用于監(jiān)測(cè)魚類新鮮度的化學(xué)合成指示劑具有對(duì)酸堿度變化敏感、價(jià)格低廉、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低、可工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。最初，應(yīng)用于檢測(cè)魚體新鮮度的指示型智能包裝大多數(shù)使用化學(xué)合成指示劑。如WANG等[43]使用聚苯胺薄膜作為食品包裝比色標(biāo)簽，檢測(cè)羅非魚的新鮮度(圖5)。研究表明，聚苯胺的顏色變化與揮發(fā)性鹽基氮有很好的相關(guān)性。這類比色標(biāo)簽生產(chǎn)量大、成本低、可再生，并且無(wú)需額外的技術(shù)支持(如射頻識(shí)別)即可使用。但是，聚苯胺檢測(cè)的靈敏度影響了其顯色效果。因此，LIU等[35]利用聚苯胺和四苯乙烯研制了1種高靈敏度比色熒光雙模式傳感標(biāo)簽。當(dāng)魚體發(fā)生腐敗變質(zhì)時(shí)，傳感標(biāo)簽不僅顯示出從翡翠綠變?yōu)榭兹杆{(lán)，而且在紫外線照射下，熒光信號(hào)從黑色變?yōu)榱了{(lán)色。此標(biāo)簽在室溫下和冷藏溫度下的靈敏度分別是普通傳感標(biāo)簽的2.5倍和3.4倍。但是在應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，這類指示劑的靈敏性和精確度仍有待提高，并且存在安全隱患。

圖5 羅非魚揮發(fā)性鹽基氮變化及聚苯胺薄膜的顏色變化(4 ℃)[43]Fig.5 TVB-N changes and colour changes of doped polyaniline films sealed in tilapia samples(4 ℃)[42]

4.2 天然色素指示劑型

近年來(lái)，研究者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到化學(xué)合成指示劑的潛在毒性和危害，研究重點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)移到天然的酸堿度傳感染料上，它們具有無(wú)毒、可生物降解和響應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。最近，EZATI等[44]將天然萘醌色素紫草素吸附在纖維素紙上，制備了1種新型智能pH響應(yīng)型顏色指示劑，用于監(jiān)測(cè)魚肉在室溫下的新鮮度，結(jié)果表明指示劑的顏色變化與樣品的新鮮度變化有很高的相關(guān)性。此外，該指示劑在貯存4個(gè)月后顯示出高穩(wěn)定性。ZHAI等[45]采用溶劑蒸發(fā)法將淀粉/聚乙烯醇(starch/polyvinyl alcohol, SPVA)與玫瑰花青素(roselle anthocyanins, RACNs)不同比例結(jié)合，制備酸堿度傳感膜用于監(jiān)測(cè)冷藏期間鰱魚的新鮮度。結(jié)果表明，不同比例組成的比色膜呈現(xiàn)出不同變色效果，在冷藏溫度和室溫下穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)14 d，相對(duì)顏色變化小于5%(圖6)。類似的是，ZENG等[38]以明膠/聚乙烯醇為基質(zhì)，加入從桑椹中提取的花青素，制備魚體新鮮度比色指示膜。在檢測(cè)過(guò)程中，該膜由鮮紅色變?yōu)樯罹G色，明顯反映了魚類在貯藏過(guò)程中的新鮮度和腐敗程度。

天然色素指示劑為檢測(cè)魚的新鮮度變化提供了一種簡(jiǎn)單而直觀的方法，不僅對(duì)人體健康無(wú)損，而且也有助于降低成本和保護(hù)環(huán)境。但是，目前發(fā)現(xiàn)可用作指示劑的天然色素較少，如何從天然水果和蔬菜中提取色素用作指示劑仍需進(jìn)一步深入地探索。

圖6 比色膜顏色變化[45]Fig.6 The color changes of the colorimetric films[45]

5 蛋白組學(xué)分析技術(shù)

魚死后，內(nèi)源酶催化蛋白質(zhì)發(fā)生水解反應(yīng)，過(guò)程中產(chǎn)生了促進(jìn)細(xì)菌增殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此從魚體肌肉蛋白質(zhì)的降解、聚合和變性角度分析可能是評(píng)價(jià)魚體新鮮度的一個(gè)重要途徑[46]。目前越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始利用蛋白組學(xué)分析技術(shù)，對(duì)魚體品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其變化機(jī)理進(jìn)行詳細(xì)的解釋說(shuō)明。蛋白組學(xué)技術(shù)以傳統(tǒng)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳為基礎(chǔ)，更多研究者在此基礎(chǔ)上加入了等電點(diǎn)分離和質(zhì)譜技術(shù)，即二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，目的是了解與研究魚體肌肉中的蛋白信息。如LI等[47]采用二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從4 ℃下貯藏18 d的大菱鲆肌肉中篩選并確定出7種蛋白，這些蛋白可作為大菱鲆的新鮮度變化標(biāo)記物。相似的是，ETHUIN等[48]采用相同技術(shù)區(qū)分新鮮和凍融海鱸魚，發(fā)現(xiàn)小清蛋白亞型可能是區(qū)分新鮮鱸魚和凍融鱸魚魚片的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。目前，采用二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從分子水平揭示魚體新鮮度變化顯示出相當(dāng)大的潛力。但是，二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在蛋白質(zhì)鑒定中也存在部分缺陷，例如太大或太小的蛋白質(zhì)、極度疏水和低豐度的蛋白質(zhì)很難識(shí)別。

近幾年，多肽體外標(biāo)記技術(shù)在研究魚體中不同差異蛋白方面具有突出優(yōu)勢(shì)。其中，馬聰聰?shù)萚49]利用定量蛋白組學(xué)技術(shù)分析貯藏于0 ℃下不同貯藏時(shí)間的三文魚肌肉蛋白，篩選出28個(gè)可能與三文魚貯存期間鮮度品質(zhì)變化相關(guān)的差異蛋白，并利用多反應(yīng)檢測(cè)模式對(duì)這些蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證，為揭示不同貯藏時(shí)間下三文魚新鮮度變化機(jī)理提供一定理論支撐。ZHANG等[50]采用TMT(tandem mass tag)技術(shù)研究了冷藏期間石斑魚魚片的蛋白質(zhì)變化。研究發(fā)現(xiàn)，在第0 d、6 d和12 d共有64個(gè)顯著性差異表達(dá)的蛋白，并找到與石斑魚魚片的pH值、離心損失、顏色(L*、a*、b*)和質(zhì)地(硬度、咀嚼性和膠質(zhì))變化密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。為研究石斑魚魚片在冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化及新鮮度下降的機(jī)理奠定一定基礎(chǔ)。

目前，使用新型蛋白質(zhì)標(biāo)記定量技術(shù)評(píng)價(jià)魚體的新鮮度研究還較少，未來(lái)有待進(jìn)一步深入探索。與基礎(chǔ)的二維電泳技術(shù)相比，新型蛋白質(zhì)標(biāo)記定量技術(shù)提高了多個(gè)樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性，降低了實(shí)驗(yàn)誤差，克服了二維電泳測(cè)定的缺點(diǎn)。蛋白組學(xué)技術(shù)的不斷突破為開(kāi)發(fā)魚體新鮮度新型檢測(cè)技術(shù)提供了新的契機(jī)，為從新鮮度機(jī)理層面研究新鮮度變化、實(shí)現(xiàn)漁獲物冷鏈物流過(guò)程中新鮮度變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)奠定理論基礎(chǔ)。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，現(xiàn)存的新型魚體新鮮度檢測(cè)技術(shù)具有無(wú)損、全面和快速等優(yōu)勢(shì)，但是魚體的腐敗變質(zhì)受多種因素影響，僅憑單一的技術(shù)無(wú)法精確評(píng)價(jià)各個(gè)時(shí)期魚體的新鮮度。在實(shí)際操作中，從魚體的視覺(jué)、嗅覺(jué)和味覺(jué)多個(gè)傳感角度全面評(píng)價(jià)魚體的新鮮度更加符合未來(lái)的研究趨勢(shì)。近年來(lái)，通過(guò)將氣味指紋技術(shù)與智能技術(shù)、光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)以及蛋白組學(xué)與質(zhì)譜技術(shù)等聯(lián)用的方法，全面、精確地評(píng)價(jià)魚體的新鮮度的相關(guān)研究仍處于發(fā)展階段，如何使其真正應(yīng)用于市場(chǎng)有待進(jìn)一步深入研究。另一方面，對(duì)魚體新鮮度的檢測(cè)大多停留在宏觀水平，而最新研究表明，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的研究促進(jìn)了魚體新鮮度機(jī)理不斷發(fā)展，如何從宏觀和分子水平上共同探究魚體新鮮度變化，實(shí)現(xiàn)多種新型檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)相結(jié)合，得到多指標(biāo)融合的檢測(cè)結(jié)果也是需要重點(diǎn)考慮的問(wèn)題。

在未來(lái)的研究中，為進(jìn)一步拓寬新技術(shù)的廣度和深度，可從以下幾個(gè)方面開(kāi)展研究：(1)氣味指紋技術(shù)與智能技術(shù)聯(lián)用時(shí)，建立適合不同條件下魚樣品的氣味指紋圖譜庫(kù)，探索并使用智能技術(shù)處理氣味信號(hào)，改善數(shù)據(jù)處理的局限性，達(dá)到對(duì)新鮮度檢測(cè)和控制的目的，推動(dòng)其向更精準(zhǔn)化的方向發(fā)展；(2)生物傳感器技術(shù)需要提高測(cè)量精確性和靈敏性，減少前處理時(shí)間，并完成可重復(fù)性，根據(jù)不同處理?xiàng)l件和品種建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型進(jìn)而判斷新鮮度，嘗試添加與配備具有彩色閱讀軟件的智能便攜設(shè)備，開(kāi)發(fā)多傳感器多指標(biāo)融合檢測(cè)技術(shù)，促進(jìn)其向取代化學(xué)檢測(cè)方法方面發(fā)展；(3)對(duì)于光譜技術(shù)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與優(yōu)化算法和化學(xué)計(jì)量學(xué)，嘗試將其與氣味指紋技術(shù)等聯(lián)用，同時(shí)降低設(shè)備成本、促進(jìn)設(shè)備智能化和微型化，建立完善的光譜檢測(cè)模型庫(kù)，擴(kuò)大該技術(shù)在魚體新鮮度在線檢測(cè)中的推廣應(yīng)用；(4)對(duì)于新鮮度指示型智能包裝技術(shù)，開(kāi)發(fā)高靈敏、低成本的天然指示劑，將納米復(fù)合材料應(yīng)用于指示劑膜的制備以提高其抗菌性和抗氧化能力，嘗試多指示劑組合形式監(jiān)測(cè)魚體腐敗變質(zhì)情況，提高消費(fèi)者認(rèn)可度，使其逐步走出實(shí)驗(yàn)室，真正應(yīng)用于市場(chǎng)；(5)蛋白組學(xué)技術(shù)不僅可與代謝組學(xué)等其他組學(xué)技術(shù)聯(lián)用，同時(shí)結(jié)合生物信息學(xué)，確定更多的魚體新鮮度變化標(biāo)記物和標(biāo)志代謝物，而且可與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用以開(kāi)發(fā)新型蛋白質(zhì)標(biāo)記定量技術(shù)，從魚體的蛋白結(jié)構(gòu)方面研究新鮮度機(jī)理，為研發(fā)魚體新鮮度變化試劑盒和蛋白質(zhì)變性的控制技術(shù)提供更多的可能性。