羅小葉，趙皓靜，班世棟，王曉丹*

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)2(貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)

香菇(Lentinusedodes)又名香覃、冬菇，分類學(xué)地位為擔(dān)子菌亞門、傘菌綱、傘菌目、側(cè)耳科，小香菇屬[1-2]。我國香菇資源豐富，并且已有800多年的人工栽培歷史，是世界上香菇生產(chǎn)第一大國[3]。隨著產(chǎn)業(yè)化栽培技術(shù)的迅速發(fā)展，香菇已成為世界上第二大食用菌栽培品種，其獨特的風(fēng)味和廣譜藥理作用使其被大量的食用[4]。風(fēng)味主要包含鮮味和香味兩方面，香菇的鮮味，主要是由于存在谷氨酸，天冬氨酸和5′-核苷酸，尤其是5′-GMP、5′-IMP、5′-AMP和5′-XMP等小分子物質(zhì)[5]。香味則大部分由醇類、酮類、醛類、酯類、醚類、烷烴類和烯烴類等7種揮發(fā)性物質(zhì)組成，其中醇類包括揮發(fā)性八碳化合物如1-辛烯-3-醇、1-辛烯-4-醇、3-辛烯-2-醇等是香菇最重要的香味物質(zhì)，典型的1-辛烯-3-醇具有濃郁的蘑菇特有風(fēng)味[6]。醚類中含硫化合物如二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚等也是香菇風(fēng)味的重要組成成分，通常能影響香菇的整體風(fēng)味[7]。此外，香菇的風(fēng)味在感官屬性和消費者接受度方面起著重要作用[8]。然而，食品中香味物質(zhì)的含量非常低，一般在μg/L水平[9]，因此對分析和檢測技術(shù)要求較高。頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(headspace solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)技術(shù)是經(jīng)過萃取、解析過程，再結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，利用固相萃取吸附幾何微區(qū)效應(yīng)的一種提取分離檢測技術(shù)，常用于檢測食品香氣或揮發(fā)性成分，并且在揮發(fā)性成分的分析和鑒定方面效果十分理想[10-11]。它集頂空固相微萃取、氣相色譜安全、準(zhǔn)確、分離能力強和質(zhì)譜鑒定物質(zhì)的優(yōu)勢于一體[12]。

安龍縣是貴州省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展示范縣，該縣通過發(fā)展現(xiàn)代山地農(nóng)業(yè)示范園區(qū)與易地扶貧搬遷相結(jié)合，致力于打造“中國最大優(yōu)質(zhì)夏菇生產(chǎn)基地”、“中國西南菌都”、“食用菌硅谷”和“中國香菇第一村”，以實現(xiàn)農(nóng)村貧困人口脫貧致富。但是，安龍縣食用菌產(chǎn)業(yè)在持續(xù)發(fā)展中存在著生產(chǎn)香菇品質(zhì)不高等問題。培養(yǎng)料是生產(chǎn)香菇的物質(zhì)基礎(chǔ)，其對香菇的風(fēng)味品質(zhì)至關(guān)重要。菜籽餅營養(yǎng)豐富，其中粗蛋白含量較高，氨基酸組成均衡，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，適量添加菜籽餅可以提高香菇的品質(zhì)和產(chǎn)量[13-14]。本研究對添加不同含量菜籽餅的多效價復(fù)合配方栽培的香菇，采用固相微萃取法提取其子實體中揮發(fā)性物質(zhì)，再用氣相色譜和質(zhì)譜進行風(fēng)味物質(zhì)分析，目的是為香菇品質(zhì)的提高提供理論支持，促進該地區(qū)香菇產(chǎn)業(yè)鏈延伸和產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用香菇栽培種由貴州安慶菌農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，上海菁海儀器有限公司；HP6890/5975C氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；手動固相微萃取裝置、2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維頭，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 多效價復(fù)合配方香菇子實體栽培色譜條件

食用菌栽培基質(zhì)最重要的2種成分為碳元素和氮元素，其中碳氮比對子實體的生長具有重要的調(diào)控作用[15]。食用菌對栽培料碳氮比的要求通常在營養(yǎng)生長階段, 即菌絲體生長階段，要求氮含量偏高, 碳氮比一般以20∶1為佳；子實體生長發(fā)育階段，要求氮含量所占的比例偏低，碳氮比以30～40∶1較優(yōu)[16]。本實驗以企業(yè)常規(guī)栽培配方(木屑78%、麩皮20%、石膏1%、糖1%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))為對照，設(shè)置添加不同比例含量的菜籽餅代替麥麩栽培香菇，共設(shè)置5個配方，代替比例及各配方組成和配比見表1，每個栽培配方設(shè)3次重復(fù)，生產(chǎn)方法采用香菇常規(guī)生產(chǎn)方法。

生產(chǎn)流程：

備料→配料→裝袋→滅菌→冷卻→接種→菌絲培養(yǎng)→脫袋排場→轉(zhuǎn)色管理→變溫催菇→出菇管理→采收

表1 多效價菌棒復(fù)合配方Table 1 Compound formulas of multi-titer fungus sticks

1.3.2 檢測方法

提取方法：準(zhǔn)確稱取5 g鮮香菇丁(去除菇柄)，置于25 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250 ℃)中，熱解析7 min進樣。

色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度：38 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min升溫至176 ℃，以6 ℃/min升溫至260 ℃；載氣：He；流量：1.0 mL/min；不分流進樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(electron impact，EI)；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；倍增器電壓1 812 V；質(zhì)量掃描范圍29～500 u。

1.3.3 揮發(fā)性成分定性與定量方法

各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist 2017和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，對揮發(fā)性化學(xué)成分進行鑒定，用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均進行3次重復(fù)試驗。采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計制表，SPSS 21.0對特征風(fēng)味成分進行主成分分析和聚類分析，Origin 2018用于圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分鑒定及在不同復(fù)合配方中的差異

由圖1、圖2可知，通過HS-SPME-GC-MS從6種不同復(fù)合配方栽培香菇子實體中共檢測出醇類、醛類、酮類、酯類、醚類、烷烴類、烯烴類等55種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中包括13種醇類物質(zhì)、13種醛類物質(zhì)、5種酮類物質(zhì)、5種酯類物質(zhì)、4種醚類物質(zhì)、10種烷烴類物質(zhì)、5種烯烴類物質(zhì)。不同復(fù)合配方栽培香菇子實體中相對含量最高的風(fēng)味成分均為1-辛烯-3-醇，分別為52.0%、53.7%、59.1%、58.9%、58.2%和55.1%。根據(jù)不同復(fù)合配方中對香菇風(fēng)味重要的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量相比較發(fā)現(xiàn)，由于菜籽餅營養(yǎng)豐富，適量的添加可使香菇的風(fēng)味物質(zhì)增加，復(fù)合配方3和復(fù)合配方4中揮發(fā)性成分均多于50種，高于常規(guī)配方的48種風(fēng)味物質(zhì)。其中，復(fù)合配方3栽培香菇子實體的揮發(fā)性風(fēng)味成分含量最高，并且對香菇風(fēng)味組成重要的醇類和醛類揮發(fā)性物質(zhì)的含量也均為最高，分別為81.4%和2.2%。但菜籽餅含有硫甙、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，且其油性較大，會影響香菇菌絲對培養(yǎng)基養(yǎng)料及水分的吸收，不利于揮發(fā)性風(fēng)味成分的積累，復(fù)合配方1和復(fù)合配方2分別為40種和45種風(fēng)味物質(zhì)，重要的醇類和醛類物質(zhì)分別為63.3%、0.9%和65.8%、1.0%，均比其他復(fù)合配方及常規(guī)配方的含量低。復(fù)合配方5與常規(guī)配方較為接近，菜籽餅代替比例僅為2%，因此2個配方所生產(chǎn)香菇子實體的重要的醇類和醛類揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量也較為接近，分別為47種、72.4%、1.8%和48種、72.9%、1.5%，說明菜籽餅添加量較少，對重要揮發(fā)性物質(zhì)的影響也較小。

香菇的揮發(fā)性物質(zhì)主要為八碳化合物和含硫化合物，其中，1-辛烯-3-醇是香菇最具代表性的八碳化合物，又稱蘑菇醇；1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷，又稱香菇精，是一種揮發(fā)性環(huán)狀含硫化合物，香菇香味的主要呈味成分之一，香味強烈并且特征性強[18]。各配方香菇1-辛烯-3-醇的相對含量排序為：配方3>配方4>配方5>常規(guī)配方>配方2>配方1;1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷的相對含量排序為：配方2>常規(guī)配方>配方5>配方3>配方1>配方4。配方3中1-辛烯-3-醇的相對含量最高為59.1%，比常規(guī)配方提高了7.2%，但1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷的相對含量為0.6%，比常規(guī)配方降低了11.5%；配方1和配方2中1-辛烯-3-醇的相對含量分別為52.0%、53.7%，均低于其他復(fù)合配方及常規(guī)配方，然而配方2中1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷的相對含量最高為0.7%；配方4中1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷的相對含量最低為0.3%，低于常規(guī)配方的54.1%。如圖3所示，綜合2種揮發(fā)性物質(zhì)的總含量來看，配方3揮發(fā)性物質(zhì)含量相對較高，說明菜籽餅的替代比例為10%更利于香菇子實體風(fēng)味物質(zhì)的積累。

圖1 不同復(fù)合配方栽培香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分種類及相對含量Fig.1 Types and relative contents of volatile flavor components in Lentinus edodes cultivated with different compound formulations

圖2 不同復(fù)合配方栽培香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分比較Fig.2 Comparison of volatile flavor components of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

圖3 不同復(fù)合配方栽培香菇2種主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比較Fig.3 Comparison of two main volatile flavor compounds of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

2.2 不同復(fù)合配方香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分主成分分析

成分分析是一種多元統(tǒng)計技術(shù)，將原始的相關(guān)變量轉(zhuǎn)化為一組新的不相關(guān)變量，其目的是在降維空間中提取最大的數(shù)據(jù)方差，主成分分析累計貢獻率越大，越能反映樣品的信息[19-20]。本試驗以6種不同復(fù)合配方香菇的7種關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分進行主成分分析，綜合評價不同復(fù)合配方香菇的風(fēng)味品質(zhì)差異[21-23]。

2.2.1 揮發(fā)性風(fēng)味成分主成分評價模型的構(gòu)建

以特征值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，對7種風(fēng)味成分降維進行主成分分析，得到各主成分特征值、貢獻率及累計貢獻率，如表2所示。選取前3個主成分，其累計方差貢獻率達89.1%(>85%)，包含了不同復(fù)合配方香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分的絕大部分信息，符合主成分分析要求[24]。結(jié)合表3主成分特征向量與荷載矩陣可得，前3個主成分中，第一主成分的方差貢獻率為43.1%，決定第一主成分的主要是醇類、醛類、酯類及烷烴類物質(zhì)。第二主成分的方差貢獻率為24.2%，決定第二主成分的主要是醇類、醛類、酮類、醚類及烷烴類物質(zhì)。第三主成分的方差貢獻率為21.8%，決定第三主成分的主要是醇類、酮類、酯類、醚類、烷烴類及烯烴類物質(zhì)。此外，荷載還能反映各變量與主成分間的相關(guān)系數(shù)，且絕對值數(shù)值越大，相關(guān)性越強[25-26]。由于各主成分反映的變異信息存在重合性，因此結(jié)合各主成分間的變異信息與主成分間的相關(guān)性，將7類風(fēng)味物質(zhì)的變異信息分為3組，第一主成分主要反映醇類及醛類物質(zhì)的變異信息，第二主成分主要反映酮類、醚類及烷烴類物質(zhì)的變異信息，第三主成分主要反映酯類及烯烴類物質(zhì)的變異信息

表2 主成分的特征值、貢獻率及累計貢獻率Table 2 Eigenvalues, contribution rates and accumulative contribution rate of principal components

2.2.2 基于主成分評價模型的風(fēng)味品質(zhì)的比較

根據(jù)表2、表3，建立復(fù)合配方栽培香菇風(fēng)味品質(zhì)的評價模型，得出各主成分得分與各揮發(fā)性風(fēng)味成分間的線性關(guān)系式為[27-29]：

F1=0.300X1+0.274X2-0.123X3+0.208X4-0.219X5+0.187X6-0.159X7

F2=0.051X1+0.160X2+0.502X3-0.171X4+0.306X5+0.360X6-0.240X7

F3=0.228X1-0.154X2+0.182X3+0.470X4+0.225X5+0.148X6+0.502X7

表3 主成分的特征向量與載荷矩陣Table 3 Principal component eigenvectors and loading matrix

可以利用前3個主成分新的綜合指標(biāo)來替代原始的多個指標(biāo)進行分析。以不同特征值的方差貢獻率βi(i=1，2，…，k)為加權(quán)系數(shù)，利用綜合評價函數(shù)F=β1F1+β2F2+…+βkFk，建立不同復(fù)合配方栽培香菇綜合風(fēng)味品質(zhì)的評價模型：F=0.430 92F1+0.241 84F2+0.218 35F3。其中F1為第一主成分得分，F(xiàn)2為第二主成分得分，F(xiàn)3為第三主成分得分，得分值越高，表示該主成分對不同復(fù)合配方栽培香菇的風(fēng)味貢獻越大。根據(jù)不同復(fù)合配方栽培香菇的風(fēng)味評價綜合得分值見表4，該得分值可反映不同復(fù)合配方栽培香風(fēng)味品質(zhì)的差異。

表4 不同復(fù)合配方栽培香菇主成分綜合得分Table 4 Comprehensive scores of principal components of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

由表4可知，復(fù)合配方4栽培香菇的第一、第三主成分得分較其他復(fù)合配方和常規(guī)配方高，反映出醇類、醛類、酯類及烯烴類物質(zhì)對該復(fù)合配方栽培香菇樣品的風(fēng)味物質(zhì)貢獻較大；復(fù)合配方2栽培香菇的第二主成分得分最高，充分反映出酮類、醚類及烷烴類物質(zhì)對該復(fù)合配方栽培香菇樣品的風(fēng)味物質(zhì)貢獻較大。因此，復(fù)合配方4栽培香菇受醇類、醛類、酯類及烯烴類物質(zhì)的影響較大，復(fù)合配方2栽培香菇受酮類、醚類及烷烴類物質(zhì)的影響較大。6種不同復(fù)合配方栽培香菇風(fēng)味品質(zhì)從高到低綜合排名依次為復(fù)合配方3(F=15.841)、復(fù)合配方4(F=15.831 0)、復(fù)合配方5(F=15.678 3)、常規(guī)配方(F=15.782 6)、復(fù)合配方2(F=14.971 8)、復(fù)合配方1(F=13.192 5)，表明在該主成分評價模型下，不同復(fù)合配方栽培香菇風(fēng)味品質(zhì)差異明顯，且復(fù)合配方3栽培香菇風(fēng)味品質(zhì)最佳。

2.2 不同復(fù)合配方香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分聚類分析

聚類分析是將樣品對象的集合分組為類似的對象組的多個類的分析過程。如圖4所示，在歐式距離為5時，將5種復(fù)合配方和常規(guī)配方分為三類，各風(fēng)味成分相對含量詳見表5。復(fù)合配方1單獨組成第一聚類，占總配方的16.67%，這一聚類的主要特點是風(fēng)味品質(zhì)適中。復(fù)合配方2單獨組成第二聚類，其主要特點是酮類、醚類和烯烴類物質(zhì)含量較高。復(fù)合配方3、復(fù)合配方4、復(fù)合配方5和常規(guī)配方共同組成第三聚類，占總配方的66.67%，這類群的醇類、醛類、酯類和烷烴類物質(zhì)含量較高。復(fù)合配方1和復(fù)合配方2中重要揮發(fā)性物質(zhì)低于其他配方，說明菜籽餅添加量過多會影響醇類和醛類等重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的積累。

圖4 不同復(fù)合配方栽培香菇風(fēng)味成分系統(tǒng)聚類分析Fig.4 Systematic cluster analysis of the flavor components of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

表5 復(fù)合配方栽培香菇3個聚類的7種風(fēng)味物質(zhì)平均值Table 5 Average values of seven flavor substances in three clusters of Lentinus edodes cultivated with compound formulas

3 結(jié)論

本研究運用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對香菇子實體風(fēng)味成分進行檢測，共鑒定出55種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，且各配方中1-辛烯-3-醇含量均最高，分別為52.0%、53.7%、59.1%、58.9%、58.2%和55.1%。不同比例的菜籽餅替代麩皮的多效價復(fù)合配方對栽培的香菇子實體風(fēng)味成分均有影響，綜合1-辛烯-3-醇和1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷的總含量來看，配方3揮發(fā)性物質(zhì)含量相對較高；主成分分析選出3個代表89.1%樣品信息的主成分來說明樣品之間的差異，其中代替比例為10%、5%的多效價復(fù)合配方風(fēng)味成分種類和含量比常規(guī)配方高；聚類分析也發(fā)現(xiàn)配方1和配方2中醇類、醛類、酯類和烷烴類物質(zhì)低于其他復(fù)合配方和常規(guī)配方。對于替代比例僅為2%的配方5，香菇子實體的重要揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量為47種和86.3%，與常規(guī)配方的48種和86.9%相接近。綜合比較后得出復(fù)合配方3整體風(fēng)味品質(zhì)最佳。本實驗通過分析比較不同多效價復(fù)合配方和常規(guī)配方栽培香菇子實體的風(fēng)味成分，為香菇栽培配方的改良和品質(zhì)的提高提供理論基礎(chǔ)，對安龍縣食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。