唐麗，魏雯麗，趙雅嬌，于文平，吳正云，曾里，張文學(xué),2*

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610065)2(四川大學(xué) 錦江學(xué)院白酒學(xué)院，四川 眉山，620860)

四川泡菜歷史悠久，因其富含維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸和益生菌而成為家喻戶曉的開胃菜和佐菜，并已從傳統(tǒng)小型家庭作坊式生產(chǎn)發(fā)展為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[1]。工業(yè)泡菜大多是使用食鹽直接腌制新鮮蔬菜而成，而蘿卜泡菜是其中的典型代表。蘿卜是四川盆地種植的主要農(nóng)作物之一，且蘿卜泡菜由于其質(zhì)地口感好、藥用價(jià)值高和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富而成為重要的發(fā)酵蔬菜之一[2]。

近年來，隨著分子微生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于發(fā)酵豆制品[3-5]、腐乳[6]、醬醋[7]、酸魚[8]、發(fā)酵茶[9]和發(fā)酵蔬菜[10]等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物群落結(jié)構(gòu)分析。LIANG等[11]研究表明四川工業(yè)榨菜泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌是主要的活性微生物，乳酸桿菌(Lactobacillus)是發(fā)酵中后期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。LIU等[12]闡明了中國(guó)南方傳統(tǒng)泡菜和北方辣白菜在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上的差異，且總酸、乳酸和乙酸與辣白菜細(xì)菌群落呈正相關(guān)，與傳統(tǒng)泡菜細(xì)菌群落呈負(fù)相關(guān)。RAO等[13]研究發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)腌制蘿卜中乳酸桿菌是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，畢赤酵母(Pichia)和假絲酵母(Candida)是優(yōu)勢(shì)真菌屬。呂嘉櫪等[14]通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)不同原料的傳統(tǒng)老壇自然發(fā)酵泡菜的真菌群落結(jié)構(gòu)不同。因此現(xiàn)有研究大多關(guān)注于家庭泡菜中的細(xì)菌多樣性，對(duì)工業(yè)泡菜和真菌多樣性研究較少。迄今為止，尚未見到針對(duì)不同工藝四川工業(yè)泡菜發(fā)酵過程中的真菌多樣性研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同工廠蘿卜泡菜發(fā)酵過程中真菌多樣性進(jìn)行分析，同時(shí)結(jié)合理化指標(biāo)的變化，揭示工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律，以期對(duì)工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵工藝的全面優(yōu)化和發(fā)酵過程的精準(zhǔn)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NaOH、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰醋酸、四硼酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；草酸、酒石酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸(色譜純)，天津科密歐化學(xué)試劑公司；DNeasy PowerSoil Kit試劑盒，德國(guó)QIAGEN公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，美國(guó)Axygen Biosciences公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WS202鹽度計(jì)，上海民儀電子有限公司；LC-2030高效液相色譜儀，日本島津公司；MyCyclerTMThermal Cycler PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-5瓊脂糖凝膠電泳儀，中國(guó)北京市六一儀器廠；Legend Micro 17R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛公司；Illumina HiSeq 2 500測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)與方法

1.3.1 樣品采集

采集四川眉山兩個(gè)工廠(J廠和W廠)的發(fā)酵蘿卜漬液進(jìn)行分析，以新鮮蘿卜下池經(jīng)石壓7 d左右出水時(shí)為取樣第0天，后續(xù)第30、60、120、180、240天分別取樣。取樣后用冰袋迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 理化指標(biāo)的檢測(cè)

采用pH計(jì)和鹽度計(jì)分別測(cè)定pH值和鹽度值；參照GB/T 12456—2008《食品總酸的測(cè)定》測(cè)定樣品中總酸含量；采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定亞硝酸鹽含量。

采用高效液相色譜法測(cè)定有機(jī)酸含量。樣品處理：在4 ℃條件下以10 000 r/min離心15 min，上清液用0.22 μm水系膜過濾。測(cè)定條件：色譜柱為Agilent ZORBAX-SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為V(0.1%的磷酸緩沖液)∶V(甲醇)=95∶5，流速0.8 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積的比較，對(duì)其進(jìn)行定性和定量。

1.3.3 DNA提取與測(cè)序

采用DNeasy PowerSoil Kit試劑盒提取發(fā)酵蘿卜漬液中微生物總DNA。使用ITS真菌通用引物：ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)，ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對(duì)總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：5 μL Q5反應(yīng)緩沖液(5×)，5 μL Q5保真GC緩沖液(5×)，0.25 μL 高保真DNA聚合酶(5 U/μL)，2 μL(2.5 mmol/L)三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs)，前后引物各1 μL(10 μmol/L)，2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，用ABI Step OnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測(cè)，送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq 2500。

1.3.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

用QIIME計(jì)算Alpha多樣性，包括 Chao1、Simpson、Shannon和Good′s coverage，以表征真菌群落結(jié)構(gòu)的豐富度和多樣性。使用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA)構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)。結(jié)合UNITE數(shù)據(jù)庫(Release 8.0, http://unite.ut.ee/)進(jìn)行物種注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵過程的理化指標(biāo)分析

總酸(total acid，TTA)和pH是衡量泡菜發(fā)酵程度的重要指標(biāo)。如圖1所示，在發(fā)酵剛啟動(dòng)時(shí)，兩廠的蘿卜泡菜的總酸含量較低，從60 d時(shí)開始迅速升高，直至240 d達(dá)到最高點(diǎn)，pH則與總酸含量趨勢(shì)相反，在整個(gè)發(fā)酵過程中逐漸降低，到發(fā)酵終止時(shí)在4.0左右。由圖1-a、圖1-b可知，0 d時(shí)J廠母水的pH(6.37)要高于W廠(5.30)，J廠總酸含量(1.33 g/kg)卻高于W廠(0.06 g/kg)，猜測(cè)與2個(gè)工廠的蘿卜在封池前堆放的時(shí)間有關(guān)。鹽度在一定程度上決定了泡菜的品質(zhì)。由圖1-c、圖1-d可知，發(fā)酵前60 d，兩廠蘿卜泡菜的鹽度不斷增加，最高到15%左右，隨后基本維持穩(wěn)定，但J廠的鹽度始終高于W廠，這會(huì)抑制一些不耐鹽微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致兩廠真菌群落結(jié)構(gòu)的差異。亞硝酸鹽含量在兩廠的蘿卜泡菜中均呈波動(dòng)變化的趨勢(shì)，發(fā)酵后期基本維持在8.34 mg/kg(J廠)和5.44 mg/kg(W廠)，低于國(guó)標(biāo)中的20 mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)。除0 d外，J廠的亞硝酸鹽含量均高于W廠。

有機(jī)酸是四川泡菜發(fā)酵中的重要呈味物質(zhì)，且與微生物代謝活動(dòng)密切相關(guān)。兩廠蘿卜泡菜發(fā)酵過程中的有機(jī)酸含量變化如表1所示，共檢測(cè)到7種有機(jī)酸，其中，含量最高的是來自蘿卜泡菜原料中的草酸。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蘿卜和母水中存在的豐富微生物開始生長(zhǎng)代謝，草酸被不斷分解,含量逐漸降低，而乳酸和乙酸含量明顯增加，并且在發(fā)酵后期乳酸濃度是所有有機(jī)酸中最高的。這和工業(yè)豇豆泡菜[15]的研究結(jié)果一致。240 d時(shí)J廠的乳酸含量增加到9.82 g/kg，占整個(gè)有機(jī)酸總量的29.13%，W廠到240 d時(shí)乳酸含量為5.64 g/kg，占24.73%。蘿卜泡菜在發(fā)酵120 d時(shí)才產(chǎn)生酒石酸，隨后J廠酒石酸含量從0.31 g/kg增加到1.93 g/kg，W廠則在3.83 g/kg處小幅波動(dòng)。檸檬酸和琥珀酸在兩廠的發(fā)酵過程中均呈先增加再減少的趨勢(shì)，而有較大差異的蘋果酸在J廠含量最高為2.82 g/kg(120 d)，在W廠為1.71 g/kg(240 d)。

a-TTA；b-pH；c-鹽度；d-亞硝酸鹽含量圖1 工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵過程中TTA、pH、鹽度及亞硝酸鹽含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of TTA, pH and the contents of salinity, nitrite during the fermentation of industrial radish paocai

表1 工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化 單位：g/kg

2.2 Alpha多樣性分析

通過Illumina Miseq測(cè)序，為了保證樣本測(cè)序序列的均一性，對(duì)所有樣品有效序列按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平(每個(gè)樣本45 629條有效序列)。抽平后，所有樣品序列歸屬于12個(gè)門，37個(gè)綱，74個(gè)目，176個(gè)科，299個(gè)屬，480個(gè)種。Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao1、Simpson、Shannon和Good′s coverage，常用于表征在環(huán)境中微生物群落的豐富度以及多樣性情況。每個(gè)樣品的Good′s coverage值均達(dá)0.999 9，表明測(cè)序深度良好，可以較真實(shí)展示樣品中的絕大多數(shù)真菌的群落結(jié)構(gòu)(表2)。J廠蘿卜泡菜的Chao1指數(shù)隨著發(fā)酵的進(jìn)行先增加后減少，在發(fā)酵60 d時(shí)真菌群落豐富度達(dá)到最高。而W廠發(fā)酵第0天的Chao1指數(shù)最大且高于J廠，表明W廠在發(fā)酵第0天真菌群落豐富度最高，經(jīng)過發(fā)酵作用后菌群豐富度有所降低。J廠的Simpson和Shannon指數(shù)值隨著發(fā)酵呈下降趨勢(shì)，W廠的真菌群落多樣性變化趨勢(shì)則與豐富度類似，這可能是由于不同工廠發(fā)酵初始母水的酸度和鹽度不同。

2.3 Beta多樣性分析

在真菌操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)分類水平上，對(duì)J廠和W廠不同發(fā)酵時(shí)期蘿卜泡菜樣品進(jìn)行主成分分析(圖2)，以樣本點(diǎn)之間的距離來衡量其真菌群落結(jié)構(gòu)組成的相似或差異程度。不同樣本真菌群落結(jié)構(gòu)信息主要集中在前3個(gè)主成分，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為84.45%，PC1的貢獻(xiàn)率為49.18%， PC2的貢獻(xiàn)率為24.43%。其中，PC1可以區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)間工業(yè)蘿卜泡菜真菌群落結(jié)構(gòu)的差異性，PC2可以區(qū)分不同工廠的工業(yè)蘿卜泡菜樣品。分析發(fā)現(xiàn)36個(gè)樣品出現(xiàn)明顯的聚類趨勢(shì)，可將整個(gè)發(fā)酵過程分為發(fā)酵起始點(diǎn)(0 d)、前期(30～60 d)、中期(60～180 d)和后期(180～240 d)。

表2 Alpha多樣性指數(shù)分析Table 2 The analysis of Alpha diversity estimators

圖2 工業(yè)蘿卜泡菜真菌群落主成分分析Fig.2 Principal component analysis of fungi community structure in industrial radish paocai

2.4 真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和演替規(guī)律分析

在門水平上，各廠不同發(fā)酵時(shí)期蘿卜泡菜樣品真菌群落組成如圖3-a所示。去除未分類的真菌后，所有樣品中真菌群落共包含10個(gè)門，其中子囊菌門(Ascomycota)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度為42.7%～99.9%。其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，其相對(duì)豐度為 0.01%～56.9%，這與吳進(jìn)菊等[16]在發(fā)酵大頭菜的研究結(jié)果一致。在兩個(gè)不同工廠蘿卜泡菜中，擔(dān)子菌門在發(fā)酵前期相對(duì)豐度較高，且均呈先增后減的趨勢(shì)，W廠發(fā)酵第0天和第30天擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度超過50%，而J廠在第0天時(shí)相對(duì)豐度僅為4.58%，隨后增加到27.66%(30 d)。發(fā)酵到120、180、240 d 時(shí)，則子囊菌門(99%)主導(dǎo)了整個(gè)發(fā)酵中后期。

在兩廠36個(gè)蘿卜泡菜樣品中共鑒定出230個(gè)屬，其中樣品J60-2檢測(cè)到屬水平微生物數(shù)量最多(106個(gè))，W120-3檢測(cè)到屬水平微生物數(shù)量最少(5個(gè))。選取其相對(duì)豐度較高的前20個(gè)優(yōu)勢(shì)屬(至少占每個(gè)樣品總相對(duì)豐度85%以上)，包括假絲酵母屬(Candida)、Starmerella、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、Tausonia、梗孢酵母屬(Sterigmatomyces)和畢赤酵母屬(Pichia)，各廠蘿卜泡菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)屬的動(dòng)態(tài)變化如圖3-b所示。假絲酵母屬在兩廠發(fā)酵過程相對(duì)豐度中先減后增，蘿卜泡菜發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)屬為德巴利氏酵母屬，假絲酵母屬和德巴利氏酵母屬是泡菜中常見的真菌屬[17-18]。

a-門水平；b-屬水平圖3 門水平及屬水平上工業(yè)蘿卜泡菜真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性Fig.3 Diversity of fungal community structure of industrial radish paocai based on phylum and genus level

由圖3-b可知，J工廠蘿卜發(fā)酵過程優(yōu)勢(shì)菌屬為假絲酵母屬(3.02%～99.38%)、德巴利氏酵母屬(0.05%～64.83%)、畢赤酵母屬(0.04%～33.01%)和Starmerella(0.04%～72.75%)。發(fā)酵第0天，假絲酵母屬(57.84%)和畢赤酵母屬(33.01%)為J廠母水中的優(yōu)勢(shì)微生物，隨后顯著下降，同時(shí)德巴利氏酵母屬迅速成為發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)屬。Starmerella在發(fā)酵120 d相對(duì)豐度很高(72.75%)，隨后減少。畢赤酵母屬是J工廠蘿卜0 d特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬，適合在弱酸環(huán)境中生存，也具有一定的產(chǎn)膜能力[19]；Starmerella在以往泡菜的研究中很少出現(xiàn)，在發(fā)酵葡萄酒中出現(xiàn)較多，對(duì)腐敗微生物有一定的抑制能力[20]。

由圖3-b可知，W工廠蘿卜發(fā)酵過程優(yōu)勢(shì)菌屬為梗孢酵母屬(0.04%～43.88%)、假絲酵母屬(0.26%～44.76%)、德巴利氏酵母屬(0.29%～84.13%)、Tausonia(0.09%～56.68%)和Starmerella(0.25%～97.92%)。與J廠不同的是，W廠發(fā)酵第0天物種豐富度最高，且優(yōu)勢(shì)真菌屬為梗孢酵母屬(43.88%)。發(fā)酵前期除德巴利氏酵母屬外，Tausonia在30 d相對(duì)豐度占56.68%，隨后驟降。Starmerella在發(fā)酵中期為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬(97.92%)，后期隨著假絲酵母屬的活躍而相對(duì)豐度略有降低。梗孢酵母屬和Tausonia分別是W工廠蘿卜0、30 d特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬，其中梗孢酵母屬在白酒大曲和紅曲醋醅中有報(bào)道出現(xiàn)[21-22]，Tausonia在土壤微生物的報(bào)道中出現(xiàn)過[23-24]，可能是新鮮蘿卜本身攜帶進(jìn)入發(fā)酵池。

2.5 真菌群落和理化因子關(guān)聯(lián)性分析

將不同工廠蘿卜泡菜4個(gè)理化指標(biāo)(pH、TTA、鹽度、亞硝酸鹽)和7種有機(jī)酸作為環(huán)境因子，同時(shí)各自選取相對(duì)豐度較高的10個(gè)真菌屬，進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis, RDA)，分析結(jié)果見圖4。在RDA圖中各環(huán)境因子箭頭越長(zhǎng)表示對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響越大。箭頭連線與排序軸的夾角以及箭頭連線之間的夾角表示相關(guān)性，銳角表示正相關(guān)，鈍角表示負(fù)相關(guān)[25]。TTA(45.3%)和pH(29.1%)對(duì)J廠蘿卜泡菜發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，TTA與假絲酵母屬呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，檸檬酸與德巴利氏酵母屬呈顯著正相關(guān)；酒石酸(51%)是驅(qū)動(dòng)W廠蘿卜泡菜真菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素，草酸與Tausonia呈顯著正相關(guān)?？偟恼f來，pH、鹽度、檸檬酸和草酸與發(fā)酵前期的真菌群落結(jié)構(gòu)呈正相關(guān)，蘋果酸、乙酸與發(fā)酵中期呈正相關(guān)，TTA、亞硝酸鹽、乳酸和酒石酸與發(fā)酵后期呈正相關(guān)。

a-J廠；b-W廠圖4 工業(yè)蘿卜泡菜真菌群落的冗余分析Fig.4 The redundancy analysis of fungi in industrial radish paocai

3 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序?qū)廠和W廠發(fā)酵過程中蘿卜泡菜的真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律進(jìn)行研究。在發(fā)酵過程中，兩廠的蘿卜泡菜總酸濃度不斷增加，pH和草酸含量逐漸下降，鹽度先升高后緩慢降低，而J廠的亞硝酸鹽和乳酸含量高于W廠，后者pH、鹽度和乙酸含量更高。經(jīng)OTU分析，36份樣品中共發(fā)現(xiàn)12個(gè)門，37個(gè)綱，74個(gè)目，176個(gè)科，299個(gè)屬，480個(gè)種。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，36個(gè)樣品可根據(jù)真菌群落結(jié)構(gòu)特征將發(fā)酵的整個(gè)過程分為4個(gè)不同的階段。所有樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門均為子囊菌門，其次為擔(dān)子菌門。屬水平上，假絲酵母屬在兩廠發(fā)酵過程中相對(duì)豐度先減后增，德巴利氏酵母屬在蘿卜泡菜發(fā)酵前期是優(yōu)勢(shì)屬，發(fā)酵中期優(yōu)勢(shì)屬為Starmerella。畢赤酵母屬是J廠發(fā)酵0 d特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬，梗孢酵母屬和Tausonia分別是W工廠蘿卜0、30 d特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬。此外，RDA表明，pH、鹽度、檸檬酸和草酸與發(fā)酵前期的真菌群落結(jié)構(gòu)呈正相關(guān)，蘋果酸、乙酸與發(fā)酵中期呈正相關(guān)，TTA、亞硝酸鹽、乳酸和酒石酸與發(fā)酵后期呈正相關(guān)。本研究揭示了不同生產(chǎn)工藝對(duì)四川工業(yè)蘿卜泡菜真菌群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化的影響，為工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)今后四川泡菜的工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)具有重要的意義。