賈岑岑， 王琴容， 周建獎， 程薇， 趙艷，**

(1.貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 血液科， 貴州 貴陽 550004)

胃癌是全球范圍內常見的消化道腫瘤，發(fā)病率和死亡率分別排在所有腫瘤第5位和第3位，在中國胃癌發(fā)病率居第3 位[1]。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)在胃炎、消化性潰瘍和胃癌的發(fā)病機制中起著重要作用，被認為是胃癌的致病菌，其表達的細胞毒素相關基因A (cytotoxin-associated gene A, CagA) 蛋白和空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A，VacA)是H.pylori致病的關鍵因素[2-3]。CagA通過細菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)進入胃上皮細胞，其C端有5個氨基酸組成的基序，即谷氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸(glu-pro-lle-tyr-ala ，EPIYA)基序。宿主細胞內酪氨酸激酶使EPIYA基序中酪氨酸磷酸化，與相鄰序列一起產生CagA的生物活性[4]。CagA蛋白有EPIYA-A、EPIYA-B、EPIYA-C及EPIYA-D 4種不同的EPIYA基序，從西方國家分離的菌株通常具有EPIYA-A、EPIYA-B和EPIYA-C，稱西方型CagA；而東亞國家的菌株具有EPIYA-A、EPIYA-B和EPIYA-D序列，稱東亞型CagA[5-6]；在亞洲國家的東方型CagA比西方型CagA引起胃癌發(fā)生的風險更高[7]。有研究顯示，CagA陽性菌株的感染會增加胃黏膜的炎癥，引發(fā)氧化應激和DNA損傷，從而增加宿主細胞中基因組不穩(wěn)定，增強胃癌發(fā)生的風險[8-10]。DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)是DNA損傷的一種特征類型，磷酸化組蛋白H2AX (histone protein H2AX，γH2AX)是由DSB斷點處的組蛋白H2AX磷酸化而來，γH2AX參與DNA損傷應答過程，是目前最常用的 DSBs 損傷評價的指標，因而用特異性抗體標記γH2AX后、可通過熒光顯微鏡觀察焦點的多少來判斷DNA雙鏈斷裂的多少，從而判斷DNA損傷[11-12]。本研究選取課題組前期分離的H.pylori東亞株，構建不同序列的CagA表達載體，轉染細胞，分析不同序列的CagA對胃癌細胞DNA損傷的影響，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株及H.pylori胃癌AGS細胞株購于美國ATCC公司，H.pyloriGZ7ΔCagA(CagA敲除株)由課題組前期構建，H.pyloriGZ7(野生株)由課題組分離、鑒定和保存，其CagA序列已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫 (KR154737)，鑒定為典型東亞株。

1.1.2主要試劑及儀器 無內毒素質粒小提中量試劑盒(天根生化科技有限公司)，Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)，伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清及胰酶(美國Gibco公司)，兔抗 γH2AX抗體 (1 ∶200,proteintech)、熒光二抗 (1 ∶200，proteintech)及pcDNA3.1(PC)質粒(上海生物生工公司)；微需氧產氣袋及密封罐(日本三菱公司)，流式細胞分析儀(美國BD Medical Technology公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細菌質粒的轉化及測序鑒定 本課題組前期構建并保存的各種H.pyloriGZ7-CagA表達載體分為載體a、載體b、載體c、載體d和載體e，將5種不同質粒分別置于感受態(tài)細胞DH5α中，冰上30 min，42 ℃水浴中熱激90 s，置于冰上；加Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基500 μL，2 000 r/min于37 ℃空氣震蕩1 h，涂布于50 mg/L Ampicillin的LB培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取陽性單克隆菌落，于含Ampicillin的液體LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)；用無內毒素質粒提取試劑盒提取質粒后進行測序鑒定。見圖1。

1.2.2細胞培養(yǎng)及質粒轉染 人胃癌細胞AGS用含10 %胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)；取對數(shù)生長期的人胃癌細胞以4×105個/孔細胞量接種于6孔細胞培養(yǎng)板，細胞融合度至60%時，設PC組及載體a、載體b、載體c、載體d、載體e組，分別用PC質粒和載體a、b、c、d、e以質粒 ∶Lipofectamine2000為3 ∶5的比例分別轉染AGS細胞，6 h后更換培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)至48 h，收集細胞備用。

1.2.3H.pylori的培養(yǎng)及細胞感染H.pyloriGZ7和H.pyloriGZ7ΔCagA接種于哥倫比亞血瓊脂平板并放置于密封罐中，加微需氧產氣袋(7%氧氣、10%CO2、83%氮)37 ℃培養(yǎng)3 d ；取對數(shù)期生長的胃癌細胞接種于6孔板，按感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI；細菌 ∶細胞) 30 ∶1加H.pyloriGZ7和H.pyloriGZ7ΔCagA感染細胞，分為Control組、H.pyloriGZ7組和H.pyloriGZ7ΔCagA組，感染6 h后換液。

1.2.4免疫熒光檢測γH2AX 將對數(shù)生長期的胃癌細胞AGS接種于已放有玻片的6孔細胞培養(yǎng)板，分別用不同的載體轉染細胞48 h，4%多聚甲醛固定細胞30 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline， PBS)洗滌，加0.3%Triton-X 100通透細胞30 min，PBS洗滌3次、5 min/次；5%牛血清蛋白封閉液封閉1 h；加兔抗γH2AX抗體(1 ∶200)4 ℃過夜；PBS洗滌，加羊抗兔的熒光二抗(1 ∶200)室溫1 h；PBS洗滌3次、5 min/次，加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)溶液避光孵育10 min；PBS洗滌3次，滴加適量的抗熒光猝滅劑，熒光顯微鏡觀察采圖。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期 分別收集各種載體轉染48 h后的細胞，1 000 r/min離心5 min，預冷的PBS洗滌細胞2次；加預冷的PBS制備的70%乙醇，吹打混勻，4 ℃過夜；1 000 r/min離心5 min，去除乙醇，PBS洗滌細胞1次，加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液500 (L于4℃避光孵育30 min，尼龍布過濾樣本，流式細胞儀分析樣本。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 載體鑒定

復蘇本課題組保存的5個不同片段的CagA質粒，轉化大腸桿菌，培養(yǎng)后提取質粒，測序驗證，用Snapgene 6.0進行序列比對(圖2)，提示所有的載體構建成功。

2.2 H. pylori GZ7和H. pylori GZ7ΔCagA感染對胃癌細胞DNA損傷的影響

免疫熒光結果顯示，H.pyloriGZ7感染的胃癌細胞AGS核內γH2AX的表達高于H.pyloriGZ7ΔCagA感染的細胞(P<0.05 )，提示H.pylori注入細胞的CagA是引起細胞DNA損傷的主要因素。見圖3。

2.3 不同序列的CagA載體轉染對胃癌細胞γH2AX表達的影響

將不同序列的CagA載體轉染胃癌細胞AGS，用免疫熒光檢測γH2AX的表達情況。結果顯示，與PC組比較，載體a、載體b、載體c、載體d和載體 e轉染后胃癌細胞AGS細胞核內γH2AX的表達均有增加(P<0.05或P<0.01)，其中載體b、載體c和載體d表達增加更明顯(P<0.01)，提示CagA中的EPYIA序列是引起細胞DNA損傷的主要結構。見圖4。

2.4 不同序列的CagA載體對細胞周期分布的影響

不同載體轉染胃癌細胞AGS后用流式細胞儀檢測細胞周期，結果表明，載體 a和載體 c轉染后胃癌細胞AGS的G0/G1期細胞比例升高(P<0.05)，載體 b、載體 c、載體d及載體e轉染后胃癌細胞AGS的G2/M期比例明顯升高(P<0.01)。見圖5。

3 討論

超過60%的胃癌是由H.pylori感染引起，被歸類為I類致癌物，是導致慢性胃炎、消化性潰瘍和胃腺癌等嚴重胃疾病中已知最強的風險因素[13]。它含有多種黏附素，介導細菌與胃上皮細胞的緊密粘附，從而啟動和促進細菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的形成[14-16]。CagA通過細菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)進入胃上皮細胞，其C端的EPIYA基序被宿主細胞內c-Src和c-Abl家族的酪氨酸激酶依次磷酸化，磷酸化后的酪氨酸與Src同源2磷酸酶[Src homology 2(SH2)-containing protein-tyrosine phosphatase，SHP2]或適配蛋白(growth factor receptor-bound protein 2，GrB2)相互作用，從而激活一系列相關通路，抑制細胞的增殖并阻礙細胞間的粘附[17]。

DNA損傷是DNA在復制過程中核苷酸序列發(fā)生永久性改變，從而導致遺傳特征發(fā)生改變。受損的DNA復制可能導致基因突變，癌基因、抑癌基因或控制細胞周期的基因突變可以產生在增殖方面具有明顯優(yōu)勢細胞群，這一系列改變是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要分子機制。DSBs是最嚴重的DNA損傷類型之一，是DNA雙螺旋結構中2條互補鏈于同一對應處或緊密相鄰處同時斷裂的DNA損傷，斷裂處可誘導組蛋白H2AX保守區(qū)139位絲氨酸磷酸化形成γH2AX，進而募集DNA修復蛋白完成DNA的損傷修復，是細胞發(fā)生雙鏈DNA斷裂的特征性標志。有研究報道，細胞發(fā)生DSBs后1～3 min即有γH2AX出現(xiàn)在DSBs處，顯微鏡下在細胞核中可見特征性的點狀結構(foci)，10 min時達到最高，因而用來評價DSBs的程度[18]。體外研究表明，H.pylori通過誘導DSBs并抑制胃上皮細胞中多種DNA修復基因的功能，是通過調節(jié)DNA損傷修復反應而導致胃癌發(fā)生的關鍵因素[19-20]，但其潛在機制尚未完全清楚。H.pylori可通過多種方式引起細胞DNA損傷：(1)H.pylori持續(xù)感染引起細胞中活性氧增加，引起DNA損傷[21]；(2)H.pylori通過細菌IV型分泌系統(tǒng)激活NF-κB，使核苷酸內切酶XPF和XPG富集，引起DNA損傷[22]；(3)CagA已被證明可與PAR1、MARK相互作用，導致DSBs增加和染色體不穩(wěn)定[23-24]；(4)H.pylori感染被報道會誘發(fā)微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)以及移碼和點突變[25-29]。 然而這些研究結果主要是基于H.pylori西方株獲得的。

γH2AX是細胞DNA損傷后修復的特征性標志，通常用于判斷細胞DNA損傷。本研究利用課題組前期分離的CagA+H.pylori東亞株，首先證實H.pylori野生株比CagA敲除株引起γH2AX表達更高，提示CagA是引起細胞DNA雙鏈斷裂損傷的主要因素；隨后構建了CagA不同區(qū)域的表達載體，5個載體轉染后，所有胃癌細胞的S期細胞百分數(shù)均降低，提示不同序列的CagA載體均能抑制細胞增殖，轉染胃癌細胞后發(fā)現(xiàn)含有完整EPYIA基序的CagA(載體b、c及d)是引起細胞DNA雙鏈斷裂損傷的重要結構，而去除EPYIA基序后，CagA(載體a和e)使細胞DNA雙鏈斷裂損傷明顯降低。細胞DNA損傷后會阻斷細胞周期的進程，使細胞阻滯于G0/G1期或G2/M期，讓細胞進行DNA的修復反應。DSBs主要啟動2種類型的修復途徑——同源重組和非同源末端連接，前者主要發(fā)生于晚S期和G2期，后者則發(fā)生G1期和早S期[30]。本研究結果表明，所有的CagA載體(包括去除EPYIA基序的載體a和載體e)均能抑制細胞周期的進程，其中載體b、c、d及e可使細胞阻滯于G2/M期，載體a則使細胞主要阻滯于G0/G1。進一步提示CagA能引起細胞的DNA損傷，尤其是攜帶EPYIA基序的CagA主要引起DSBs并以DNA的同源修復為主，同時顯示除了DSBs以外，CagA還能引起其它類型的DNA損傷。

綜上，本研究結果表明CagA是H.pylori感染誘導細胞DSBs的重要因素，而CagA中的EPYIA基序是其損傷的重要結構，從而為H.pylori-CagA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要線索。