朱文濤, 夏景全, 劉相波, 尹洪洋, 朱銘, 任瑜瀟, 謝敏睿,黃建中, 李秀保

1. 海南大學生態(tài)與環(huán)境學院, 海南 ?？?70228;

2. 海南大學海洋學院, 海南 ?？?70228;

3. 海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室, 海南 ?？?570228

珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)大多數(shù)位于寡營養(yǎng)鹽的熱帶海洋環(huán)境中, 卻是地球上最多樣化和生產(chǎn)力最高的生態(tài)系統(tǒng)之一。其中造礁石珊瑚的礁石建造能力和形成的復雜物理結(jié)構(gòu)能為珊瑚礁中豐富的生物提供棲息地, 并支持廣泛的生態(tài)系統(tǒng)服務功能和為人類提供重要的經(jīng)濟服務價值(Roberts et al, 2002)。珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)覆蓋不到海洋表面的1%面積, 但它們卻在維護海洋生物多樣性、緩解全球氣候變化中起著十分重要的作用, 是對人類及其他生物不可或缺的海洋資源(Spalding et al, 2015)。造礁石珊瑚是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的基礎(chǔ)和關(guān)鍵物種, 對氣候變化和人類活動的干擾非常敏感(Putnam et al, 2017)。在進入人類世時代后, 大規(guī)模白化事件的發(fā)生頻率和嚴重程度逐漸增加(Hughes et al, 2018a), 世界上各區(qū)域的珊瑚礁正在經(jīng)歷廣泛的白化事件, 這對當前珊瑚礁構(gòu)成了最大的威脅, 因此人類世的熱帶珊瑚礁的覆蓋面積正在迅速減少(Hughes et al, 2017)。如果白化事件持續(xù)時間較長, 還會改變珊瑚礁群落組成和結(jié)構(gòu)的復雜性(Hussain et al, 2020), 繼而導致生物多樣性下降和生態(tài)系統(tǒng)服務功能衰退, 對生態(tài)、經(jīng)濟和社會產(chǎn)生長期和廣泛的影響(Hughes et al,2018b)。

珊瑚宿主與共生藻類、細菌、病毒和真菌等多種微生物構(gòu)成了珊瑚共生功能體(Thompson et al,2015), 其中珊瑚動物宿主與其共生蟲黃藻之間存在互惠互利的緊密關(guān)系, 使得珊瑚能對養(yǎng)分的高效吸收和營養(yǎng)物質(zhì)的再循環(huán)利用(R?decker et al, 2015)。蟲黃藻通過光合作用固定的絕大多數(shù)碳和氮化合物能被珊瑚宿主獲取, 這可以滿足動物宿主高達95%的能量需求和日常代謝(Yellowlees et al, 2008), 而珊瑚宿主則為共生藻提供了包括二氧化碳和銨鹽等營養(yǎng)物質(zhì)(Wooldridge, 2010)。超過珊瑚耐受范圍的熱脅迫是造成珊瑚白化的主要因素, 而且由于人類活動引起的壓力也會引起珊瑚褪色(Quimpo et al,2020)。先前的研究表明, 白化會嚴重破壞珊瑚的生理特征, 若珊瑚宿主與蟲黃藻之間的共生關(guān)系崩潰,珊瑚還會發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的死亡現(xiàn)象(Baker, 2003)。進一步研究表明, 珊瑚對熱漂白的敏感性和抵抗力與蟲黃藻密度有關(guān)(Wooldridge, 2014), 共生的蟲黃藻密度是評估珊瑚耐熱性和健康狀況的關(guān)鍵指標(Qin et al, 2019)。蟲黃藻的光合生理變化會影響珊瑚的健康發(fā)育(黃玲英 等, 2011), 因此珊瑚共生藻光合生理研究可以揭示不同脅迫下珊瑚光合特性和白化機制(周潔 等, 2011)。同時, 珊瑚白化的敏感性以及共生關(guān)系的功能取決于共生蟲黃藻密度和光合能力,所以開展不同珊瑚種類和不同野外條件下的珊瑚光合生理研究非常重要(Xu et al, 2017a)。

珊瑚微生物組在生物地球化學循環(huán)、物質(zhì)轉(zhuǎn)化和維護珊瑚健康等方面發(fā)揮著重要作用(Biagi et al,2020), 它們通過有效地捕獲、保留和循環(huán)養(yǎng)分以幫助珊瑚礁在寡營養(yǎng)的熱帶水域中生存和生長(Vanwonterghem et al, 2020)。目前, 珊瑚相關(guān)微生物的研究主要集中棲息在珊瑚宿主組織中的共生蟲黃藻和細菌群落, 而對其他真核微生物(例如真菌、原生生物)的物種多樣性和功能貢獻的了解有限(Ainsworth et al, 2017), 特別是作為珊瑚微生物組最重要組成部分之一的真菌在生物地球化學循環(huán)、物質(zhì)轉(zhuǎn)化和維護珊瑚健康等方面發(fā)揮著重要作用。人們對珊瑚宿主與共生細菌之間的相互作用了解得相對較多(Amend et al, 2012), 但對共生真菌的研究相對較少, 特別是對珊瑚共生真菌的物種多樣性及其在維持珊瑚的健康中發(fā)揮的生態(tài)功能知之更少(Góes-Neto et al, 2020)。

叢生盔形珊瑚Galaxea fascicularis隸屬于真葉珊瑚科(Euphylliidae)盔形珊瑚屬(Galaxea), 廣泛分布在紅海、印度洋—太平洋的大部分海域, 也是我國近岸珊瑚礁以及南海海域包括海南島的重要生態(tài)和優(yōu)勢種之一。目前, 對叢生盔形珊瑚的分子相關(guān)研究主要包括基于核糖體DNA 第二內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS2)序列來探索共生藻科的多樣性組成(Zhou et al, 2017)、在不同脅迫下(例如富營養(yǎng)化、熱脅迫漂白時、pH 極端變化)的轉(zhuǎn)錄組反應等(Lin et al, 2017,2018; Hou et al, 2018)。另外, 還有通過傳統(tǒng)的稀釋分離法、培養(yǎng)基等方法來研究叢生盔形珊瑚的共附生真菌, 這些文獻主要關(guān)注叢生盔形珊瑚共附生可培養(yǎng)真菌多樣性(徐佳 等, 2011a)、分離及其抗菌活性的篩選(徐佳 等, 2011b)、真菌的鑒定及生理學特性(王荻瀟 等, 2018)等方面, 但基于高通量測序方法來探究健康和白化叢生盔形珊瑚的真菌組成和多樣性未見報道。在2020 年9 月熱脅迫期間, 本研究在調(diào)查海南島西北部近岸海域理化環(huán)境要素的基礎(chǔ)上, 比較分析了優(yōu)勢叢生盔形珊瑚在健康和白化狀態(tài)下的蟲黃藻密度、光合生理指標和共生真菌群落的差異。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域

海南島西北部海域珊瑚礁是南海珊瑚礁典型的岸礁, 屬于印度洋—太平洋區(qū)系珊瑚礁的重要組成部分。近年來隨著海南島的建設和發(fā)展, 其西北部海域被過度開發(fā)利用, 造礁石珊瑚群落受到破壞退化嚴重, 生態(tài)系統(tǒng)多樣性和覆蓋率急劇下降(黃暉等, 2012)。2020 年8 月, 海南島西北部海域水溫持續(xù)高溫, 出現(xiàn)了罕見的大規(guī)模珊瑚白化現(xiàn)象, 而且這些珊瑚中的多數(shù)種類為高溫耐受性物種。本研究是2020 年9 月在海南島西北部的美夏(Meixia, MX)、黃龍(Huanglong, HL)、排浦(Paipu, PP) 3 個海域進行的。使用GPS 記錄調(diào)查采集樣品站位的經(jīng)緯度。使用濁度儀(Aqualogger210)、便攜式 pH/電導率儀(420C-01A Orion Star, Thermo Fisher Scientific, 美國)原位分別記錄了海水的溫度、鹽度和pH。使用采水器收集底層接近珊瑚礁基質(zhì)附近深度為1m 的海水1L, 在經(jīng)過孔徑0.45μm 的混合纖維素酯微孔濾膜過濾后, 收集100mL 濾液到試劑瓶中, 使用營養(yǎng)鹽全自動分析儀(德國SEAL, AA3)檢測水樣的無機氮、無機硅酸鹽、磷酸鹽等溶解無機營養(yǎng)鹽含量。所有采樣站位的海水溫度均超過30℃, 超過了珊瑚生存最適范圍的上限(表1)。美夏區(qū)域的海水溫度均值最高, 介于31.75～34.07℃之間。3 個研究區(qū)域的pH 和鹽度相差不大, 都處于珊瑚正常生長的范圍內(nèi)。根據(jù)海水水質(zhì)標準(GB3097-1997), MX 和HL 海域的溶解態(tài)無機氮(DIN)、磷酸鹽(DIP)平均濃度在第二類海水和第三類海水標準范圍之間, PP 海域的DIN、DIP 屬于第一類海水。

表1 調(diào)查站位的地理坐標及水體環(huán)境參數(shù)Tab. 1 Geographical locations of the sampling stations

1.2 珊瑚采樣

選擇耐熱珊瑚物種叢生盔形珊瑚為研究目標,分別在3 個研究區(qū)域采集健康珊瑚和白化珊瑚, 其中, 健康組珊瑚是指從視覺上確保珊瑚的健康狀況良好的珊瑚。在每個地點分別選擇3 個重復采樣點,利用錘子和鑿子收集健康和白化的珊瑚樣品后, 將其暫養(yǎng)在裝有海水的泡沫箱中, 以待測量光合生理指標?；氐綄嶒炇伊⒓从眠^濾的海水沖洗部分珊瑚碎片表面, 并將每個珊瑚分成實驗所需大小的樣品,暫放在–20℃冰箱中, 其中微生物樣品裝入滅菌的離心管中保存在–80℃超低溫冰箱以待分子測序。

1.3 光合生理參數(shù)和蟲黃藻密度

將采集的珊瑚暫養(yǎng)并黑暗適應半個小時后, 使用葉綠素調(diào)制熒光儀MINI-PAM-Ⅱ測量珊瑚共生蟲黃藻的光合生理參數(shù)最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)。在測量過程中PAM 的光纖探頭與珊瑚表面的固定距離保持在1cm 左右, 隨機選擇每個珊瑚樣品的3～5 個不同位置進行重復測定, 并計算平均值。使用潔碧洗牙器和0.45μm 濾膜過濾的海水沖洗珊瑚表面, 量取10mL沖洗后的溶液, 在顯微鏡下通過血細胞計數(shù)板計數(shù)來測定蟲黃藻密度。根據(jù)不同已知表面積大小的鋁箔紙進行稱重, 建立面積和重量線性關(guān)系式; 然后用鋁箔紙包裹珊瑚表面后稱重, 根據(jù)上述關(guān)系式, 通過重量來間接估算珊瑚表面積。最終結(jié)果使用單位珊瑚表面積的蟲黃藻密度(單位: 個?cm–2)表示。

1.4 高通量測序

將保存好的珊瑚樣品在經(jīng)過研缽磨碎成勻漿溶液后轉(zhuǎn)移到試管中, 按照海洋動物基因組DNA 提取試劑盒制造商的步驟提取珊瑚共生體基因組DNA。使用 NanoDrop ND-1000 型分光光度計測定(NanoDrop Technologies, Wilmington, USA) DNA 的濃度和純度, 在1%瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA 的質(zhì)量。使用帶有條形碼的通用引物ITS3 (5′-GCATCGA TGAAGAACGCAGC-3′)和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3′)進行擴增。PCR 反應總體積為30μL,擴增的條件為在98℃下預變性1min, 然后依次進行30 個循環(huán): 98℃變性10s, 50℃退火30s, 72℃延伸60s,最后72℃ 5min。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)品量化和鑒定后, 將PCR 產(chǎn)物以等比例混合純化后, 根據(jù)NEB Next?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, USA)制造商的步驟生成測序文庫。在經(jīng)過 Qubit@2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100 system 評估library 質(zhì)量后,在Illumina MiSeq 平臺進行測序。所得的測序數(shù)據(jù)經(jīng)去除冗余和無效序列后, 選取操作分類單元(以97%的序列相似性聚類)的代表性序列, 使用 RDP(ribosomal database project)分類器確定可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)的注釋分類信息(Wang et al, 2007)。按照最低測序深度26542 抽平處理后用于后續(xù)分析。不同樣品真菌的功能預測信息是通過FUNGuild 數(shù)據(jù)庫(http://www. funguild.org/)得到(Nguyen et al, 2016)。

1.5 統(tǒng)計分析

在差異分析之前, 對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性假設檢驗。使用t檢驗分析健康珊瑚和白化珊瑚的差異, 如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布, 考慮非參數(shù)的檢驗方法Wilcox 秩和檢驗分析。結(jié)果表示為平均值±標準誤差,p<0.05 認為是差異顯著。在OTUs 水平上計算了真菌的Shannon 指數(shù)、覆蓋率指數(shù), 并使用方差分析或者非參數(shù)檢驗比較多樣性指數(shù)在不同分組的差異。基于Bray-Curtis 相異矩陣的非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling, NMDS)來分析樣本間的真菌群落構(gòu)成差異, 并使用Permutational ANOVA and MANOVA (PERMA NOVA)來檢驗各組的群落差異是否顯著。使用pheatma 包繪制真菌預測功能的豐度熱圖, 以上的數(shù)據(jù)分析和圖形的可視化均于R 軟件(R4.0.3 版本)中完成的。最后使用在線工具(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_upload)進行線性判別差異分析(Linear discriminant analysis Effect Size, LEfSe), 以期找出對各組產(chǎn)生顯著性差異影響的指示物種。

2 結(jié)果

2.1 蟲黃藻與光合生理

如圖1a 所示, 健康組叢生盔形珊瑚的共生蟲黃藻平均密度為(1.85±0.09)×106個?cm–2, 介于(1.61～2.32)×106個?cm–2之間; 白化組珊瑚的共生蟲黃藻平均密度為(0.87±0.11)×106個?cm–2, 介于(0.11～0.87)×106個?cm–2之間。如圖1b 可知, 健康組珊瑚的Fv/Fm均值為0.68, 介于0.63～0.69 之間。白化組珊瑚的Fv/Fm維持在較高水平, 均值為0.57,介于0.41～0.68 之間。使用t檢驗分析表明珊瑚健康狀態(tài)和白化狀態(tài)下蟲黃藻密度與光合生理參數(shù)存在顯著性差異(p<0.05), 白化珊瑚的最大光化學量子產(chǎn)量Fv/Fm、蟲黃藻密度比健康珊瑚中相應的指標參數(shù)顯著降低了16%和75%。

圖1 健康組和白化組叢生盔形珊瑚中蟲黃藻密度(a)和最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm, b)分析圖中*表示兩組之間具有顯著性差異(p<0.05); 圖b 中虛線表示0.5 的閾值Fig. 1 Analysis of zooxanthellae density (a) and maximum photochemical quantum yield (Fv/Fm, b) between healthy and bleaching Galaxea fascicularis

2.2 群落組成

通過高通量測序方法對18 個叢生盔形珊瑚樣品的共生真菌群落組成進行分子測序, 經(jīng)過一系列過濾篩選過程后, 留下與真菌組相關(guān)的序列進行進一步分析; 在對最小讀數(shù)進行二次抽樣后,按照 97%的相似閾值對有效序列進行聚類, 并與數(shù)據(jù)庫UNITE (https://unite.ut.ee)比對進行物種注釋。結(jié)果表明, 在不同的分類水平上, 共檢測到4門、25 綱、63 目、157 科、302 屬、472 種。在白化組中的優(yōu)勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、毛霉門(Mucoromycota), 相對豐度分別為80.43%、16.78%、2.31%、0.43%; 在健康組中優(yōu)勢菌門為Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota、Mucoromycota, 相對豐度分別為86.09%、11.93%、1.74%、0.23%。在門水平上(圖 2a), 健康組和白化組中均無現(xiàn)顯著性差異(p>0.05)。在屬水平上(圖2b), 真菌前10 個優(yōu)勢屬的相對豐度從高到低,分別為Gloeotinia、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢菌屬(Cladosporium)、 絲孢子菌屬(Sporothrix)、Kazachstania、 鏈 格 孢 霉 屬 (Alternaria) 、Solicoccozyma、側(cè) 齒 霉 屬(Engyodontium)、晶杯菌屬(Hyaloscypha) 、Juxtiphoma。 其中,Gloeotinia、Aspergillus兩個屬在健康組和白化組中的平均相對豐度均在 10%以上, 分別為23.94%、21.04%和10.48%、13.15%。但是這些優(yōu)勢屬在白化組和健康組中的平均相對豐度均無顯著差異(p>0.05), 除了Solicoccozyma在白化組(5.66%)中顯著高于健康組(2.42%)。

圖2 健康組和白化組叢生盔形珊瑚在門水平(a)和屬水平(b)的真菌相對豐度圖Fig. 2 Relative abundance of fungi in Galaxea fascicularis at phylum (a) and genus (b) level

2.3 真菌多樣性

根據(jù)在每個單獨的樣本中顯示觀察到的OTUs的數(shù)量和相對于總識別的序列的數(shù)量來構(gòu)建稀釋曲線(圖3a), 除了樣品P5 有更低程度的稀薄形狀外,本次測序的絕大部分樣品的稀釋曲線在測序深度為10000 左右時趨于平緩狀態(tài), 另外16 個測序樣品的覆蓋度指數(shù)均到達了0.999, 這些表明共生真菌的測序深度足夠進行可靠的α多樣性分析以及保證了測序結(jié)果的合理性。健康組和白化組叢生盔形珊瑚中共生真菌Shannon 多樣性指數(shù)如圖3b 所示。其中健康組的Shannon 多樣性指數(shù)平均值為3.78±0.24,變化范圍分別為2.28～4.66 之間; 白化組中共生真菌的Shannon 多樣性指數(shù)平均值為3.94±0.24, 變化范圍介于2.92～5.24 之間。盡管共生真菌的Shannon多樣性指數(shù)平均值在健康組中低于白化組, 但兩者之間并無顯著性差異。

圖3 健康組和白化組叢生盔形珊瑚共生真菌稀釋曲線(a)和Shannon 多樣性指數(shù)(b)圖a 中每一條曲線代表一個樣本, 豎直虛線表示樣本測序深度情況Fig. 3 Dilution curve (a) and Shannon diversity index (b)of symbiotic fungi in healthy and bleaching Galaxea fascicularis

2.4 差異群落

基于Bray-Curtis 距離矩陣進一步利用非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling,NMDS)分析了樣本群落即β-多樣性的差異性(圖4a),當應力值小于0.2 時, 表示分析結(jié)果具有一定的可靠性。本研究中的應力值為0.066, 說明數(shù)據(jù)可用于NMDS 分析。如圖4 所示, 無論是健康組還是白化組中, 大部分樣本之間的分布距離較遠且較為分散,這說明珊瑚真菌群落結(jié)構(gòu)的組內(nèi)差異性大于組間差異性, 珊瑚的真菌群落存在很強的個體異質(zhì)性。使用PERMANOVA 方法進行檢驗分析發(fā)現(xiàn), 健康組和白化組的叢生盔形珊瑚中共生真菌群落結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定,β-多樣性并不存在顯著性差異(p>0.05)。通過線性判別分析(LEfSe)發(fā)現(xiàn)(圖4b), 健康組和白化組之間在豐度上存在顯著差異的真菌物種類群僅有7 類。其中, 在健康組中富集的類群有4 個, 包括微球黑粉菌綱(Microbotryomycetes)、鎖擲孢酵母科(Sporidiobolaceae)、鎖擲酵母目(Sporidiobolales)、紅酵母屬(Rhodotorula)。在白化組豐度較為豐富的僅有線黑粉菌目(Filobasidiales)、Piskurozymaceae科、產(chǎn)油菌屬(Solicoccozyma)共3 個類群。

圖4 健康組和白化組叢生盔形珊瑚共生真菌群落組成的非度量多維尺度(a)和線性判別分析(b)Fig. 4 NMDS analysis (a) and LEfSe analysis (b) of Fungi community composition in healthyand bleaching Galaxea fascicularis

2.5 預測功能

基于真菌的物種分類數(shù)據(jù), 利用FUNGuild 數(shù)據(jù)庫預測了叢生盔形珊瑚共生真菌群落的營養(yǎng)型。如圖5 所示, 叢生盔形珊瑚真菌有280 個OTUs, 可被劃分為7 個功能類群, 包括3 類營養(yǎng)型和4 類互有交叉營養(yǎng)型功能菌群, 分別是共生菌群(Symbiotroph, 3.53%) 、 腐生菌群(Saprotroph,11.10%)、病理寄生菌群(Pathotroph, 19.55%)、腐生-共生過渡型(Saprotroph-Symbiotroph, 0.38%)、病理寄生-共生菌群(Pathotroph-Symbiotroph, 9.24%)、病原菌- 腐生- 共生菌群(Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph, 11.67%) 、 病理寄生- 腐生菌群(Pathotroph-Saprotroph, 5.70%), 剩余的是未定義的營養(yǎng)型(38.83%)。但是這些真菌功能類群在健康組和白化組中的相對豐度均無顯著差異(p>0.05)。

圖5 健康組(a)和白化組(b)叢生盔形珊瑚共生真菌的FunGuild 功能預測相對豐度熱圖Fig. 5 Function predict relative abundance heat map based on FunGuild

3 討論

珊瑚因環(huán)境脅迫而引起共生藻喪失、光合色素減少進而褪色的現(xiàn)象被稱為白化。人們普遍認為塊狀珊瑚比分枝狀珊瑚具有更高的熱應力承受能力(Wooldridge, 2014)。研究發(fā)現(xiàn), 含高密度共生蟲黃藻的塊狀珊瑚遭受熱白化脅迫后比低密度的物種存活率更高(Qin et al, 2019)。這可能與高密度的蟲黃藻會導致更有效的自我遮蔽能保護珊瑚免受高強度光的傷害有關(guān)(Xu et al, 2020)。本研究中健康叢生盔形珊瑚的共生蟲黃藻密度為(1.85±0.09)×106個?cm–2,該數(shù)值低于南海北部三亞灣和大亞灣(李淑 等,2007)、南海黃巖島(潘子良 等, 2019) 等海域的塊狀珊瑚共生蟲黃藻密度。從調(diào)查的海水溫度的結(jié)果可以看出, 本次采樣期間調(diào)查的3 個區(qū)域所有站位的海水溫度都超過30℃, 并且美國國家海洋和大氣管理局(National Oceanic and Atmospheric Administration,NOAA)衛(wèi)星數(shù)據(jù)顯示調(diào)查區(qū)域海水溫度一直處于較高水平?？梢酝茰y, 珊瑚蟲黃藻可能受到熱應激的威脅而數(shù)量顯著減少, 但健康珊瑚蟲黃藻含量仍在建議的最佳共生體密度 1～3×106個?cm–2范圍之內(nèi)(Wooldridge, 2020)。在本研究中白化珊瑚的蟲黃藻密度比健康珊瑚的顯著降低了75%。蟲黃藻密度是健康珊瑚和白化珊瑚外觀差異最直接和最直觀的證據(jù)之一, 叢生盔形珊瑚呈現(xiàn)出白化的極端外觀表征, 這是由于共生蟲黃藻被逐漸排出后密度顯著降低到一定閾值的表現(xiàn)(李淑 等, 2011)。

光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大量子產(chǎn)量(Fv/Fm), 能反映和指示造礁石珊瑚共生蟲黃藻的潛在光合能力和生理狀態(tài)(Gorbunov et al, 2001)。在本研究中白化珊瑚的Fv/Fm比健康珊瑚中的降低了16%, 說明白化狀態(tài)下蟲黃藻的光合作用原初反應過程受到抑制、光合效率降低。Fv/Fm低于0.5 通常被用來指示蟲黃藻光系統(tǒng)Ⅱ遭到損害(Bhagooli et al, 2004)。盡管這項研究中白化珊瑚觀察到光合產(chǎn)量的顯著降低, 但在白化珊瑚Fv/Fm的平均值仍然大于0.5, 表明光合電子傳遞系統(tǒng)并沒有受到破壞, 暗示了叢生盔形珊瑚在高溫下光合生理的適應能力較強。

本研究利用高通量測序技術(shù)評估了珊瑚中的真菌多樣性和組成, 在白化和健康叢生盔形珊瑚樣品中鑒定出4 個優(yōu)勢真菌門, 分別為子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota、壺菌門Chytridiomycota、毛霉門Mucoromycota。這與西南太平洋不同珊瑚屬骨骼和珊瑚藻相關(guān)的真菌中鑒定的結(jié)果一致(Góes-Neto et al,2020)。在菌屬分類水平上,Gloeotinia屬的平均相對豐度均在20%以上, 這與?？诤５閸u榮域溫泉(舒為 等,2020)、南大西洋中脊的深海熱液噴口站點(Xu et al,2017b)的真菌序列中的報道一致。其中該真菌屬的Gloeotinia temulenta是一種內(nèi)生真菌, 是可在牧草種子中生長的病原體(Alderman, 1998), 但是在本研究中僅僅鑒定到屬, 該屬在叢生盔形珊瑚中的具體功能仍然不確定。

相對豐度較高的曲霉屬Aspergillus、枝孢菌屬Cladosporium、鏈格孢霉屬Alternaria等主要為陸生的子囊菌屬物種(Góes-Neto et al, 2020), 在叢生盔形珊瑚(徐佳 等, 2011a)和南海3 種珊瑚(張丹 等,2015)中均有發(fā)現(xiàn)。這些共附生真菌是重要生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)者之一, 也是珊瑚微生物組的常見成員。雜色曲霉(Aspergillus versicolor)是曲霉屬中研究最廣泛的珊瑚真菌之一,據(jù)報道是加勒比海柳珊瑚(Harvell et al, 2007)和佛羅里達礁群島柳珊瑚Gorgoniaspp.中的致病病原體(Alker et al, 2001)。盡管有研究在健康的珊瑚和周圍海水中也發(fā)現(xiàn)了Aspergillus versicolor(Soler-Hurtado et al, 2016), 但在本文中健康組和白化組叢生盔形珊瑚中均未出現(xiàn)該物種。毛霉菌門的物種可能會引起海洋動物疾病,不過在本研究中鑒定到的豐度極低, 在健康和白化珊瑚中均低于0.5%。

其他優(yōu)勢屬例如Gloeotinia、絲孢子菌屬Sporothrix、Kazachstania、Solicoccozyma、側(cè)齒霉屬Engyodontium、 晶杯菌屬Hyaloscypha、Juxtiphoma等未在以往叢生盔形珊瑚可培養(yǎng)真菌的報道中發(fā)現(xiàn)。這可能與傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法的限制有關(guān), 大約95%的菌落不能被成功分離培養(yǎng)出來。例如有學者(徐佳 等, 2011a)利用5 種培養(yǎng)基在叢生盔形珊瑚中共分離出19 株共附生真菌, 這些真菌基本在本研究的高通量測序結(jié)果中被檢測到較低的豐度, 這可能與受到PCR 引物偏好性的影響有關(guān)(Deiner et al, 2017)。本研究中的所有樣品都采集于高溫脅迫期間, 這可能對珊瑚共附生真菌種類和豐度產(chǎn)生影響。

基于真菌的物種分類數(shù)據(jù)和 FUNGuild 數(shù)據(jù)庫, 叢生盔形珊瑚共生真菌群落預測結(jié)果共發(fā)現(xiàn)3 類營養(yǎng)型和4 類互有交叉營養(yǎng)型功能菌群。但是利用 FUNGuild 數(shù)據(jù)庫得到真菌的功能預測信息是不全面的(Nguyen et al, 2016), 其中本研究中未定義的營養(yǎng)型可達38.826%。在本研究中真菌類群劃分到病理寄生菌群和病原菌-腐生-共生菌群的相對豐度分別為19.551%和11.670%。這些預測功能僅是基于真菌群體的攝食習慣, 它們的功能并非完全是致病性的, 也有可能會幫助珊瑚宿主形成穩(wěn)定的共生關(guān)系(Góes-Neto et al, 2020)。本研究結(jié)果側(cè)重于真菌多樣性檢測和功能預測, 然而這些預測有待通過真菌培養(yǎng)和宏基因組技術(shù)進一步詳細驗證, 因此在后續(xù)研究中可以結(jié)合這些方法來更全面評估和闡明叢生盔形珊瑚共附生真菌的實際生態(tài)功能。

研究表明珊瑚在熱應激、藻類脅迫等各種壓力下, 其共生細菌的α-多樣性和β-多樣性會響應壓力而發(fā)生改變(Zaneveld et al, 2016), 這表明珊瑚宿主調(diào)節(jié)共生微生物組之間相互作用的平衡穩(wěn)定以及抵抗病原體感染并維持健康微生物組功能的能力降低(Pollock et al, 2019)。當微生物組群落結(jié)構(gòu)改變和功能失衡后(Patel et al, 2020), 珊瑚最終可能由于遭受機會性微生物的侵害而白化和死亡(Glasl et al, 2017)。本研究結(jié)果表明, 健康組叢生盔形珊瑚共生真菌的 Shannon 指數(shù)的平均值(3.78±0.24)低于白化組的(3.94±0.24), 但差異性不顯著。在豐度上有顯著差異的真菌物種類群有7 類,平均豐度所占比例較小, 因此叢生盔形珊瑚在健康和白化狀態(tài)下共生真菌群落組成相對穩(wěn)定。珊瑚病原體和機會真菌類群沒有在白化珊瑚中顯著增加, 并且它們也可以在健康珊瑚樣本中檢測到較小的豐度。本研究采樣時間約于白化事件發(fā)生的一個月后, 但白化珊瑚中預測的致病功能真菌豐度較少。白化狀態(tài)的叢生盔形珊瑚中沒有觀察到珊瑚病原體顯著增加, 在熱脅迫下都保持與健康狀態(tài)珊瑚相似的真菌群落結(jié)構(gòu), 并且白化珊瑚沒有發(fā)生嚴重的光系統(tǒng)損傷和能夠保持較好的光合生理狀態(tài),這暗示共生真菌群落的穩(wěn)定性可能在熱應激反應和珊瑚生存中發(fā)揮重要作用。