張新燦，李小定

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，武漢 430070

克氏原螯蝦俗稱小龍蝦，因其繁殖速度快、生長迅速、能適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境，已成為我國長江中下游地區(qū)主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。但克氏原螯蝦在養(yǎng)殖過程中容易遭受疾病的侵害，藥物使用仍然是目前疾病防治的主要手段，因此克氏原螯蝦的用藥問題逐漸成為人們關(guān)注的焦點。氟苯尼考因抗菌譜廣、療效顯著等特點，常用于魚蝦病害防治［1］，但其不合理使用或過量使用不僅會對養(yǎng)殖生物和環(huán)境造成不利影響，在食品中的殘留甚至?xí)绊懭祟惤】?，因而其在可食性動物組織中的代謝和殘留已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。目前，關(guān)于氟苯尼考作為藥物使用僅在凡納濱對蝦［1］、鱈［2］、鮭［3］、虹鱒［4］等水產(chǎn)動物中有相關(guān)報道，但是，在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用偏少，研究尚在起步階段。因此，本研究使用在飼料中分別摻拌10、20、30 mg/kg 氟苯尼考的人工配合飼料喂養(yǎng)克氏原螯蝦20 d 并進(jìn)行15 d 的藥物消除試驗，測定克氏原鰲蝦肝胰腺Ⅰ相藥物代謝酶CYP450 亞族CYP1A、CYP2E 和CYP3A 的代表酶7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶（ECOD）、7-乙氧基異吩惡唑酮-O-脫乙基酶（EROD）、苯胺-4-羥化酶（AH）、紅霉素-N-脫甲基酶（ERND）、氨基比林-N-去甲基化酶（AND）活力變化，Ⅱ相藥物代謝酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、磺基轉(zhuǎn)移酶（SULT）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）活力變化，以及CYP450、GST、熱休克蛋白HSP70、金屬硫蛋白（MT）基因表達(dá)水平的變化，探討藥物代謝酶和相關(guān)基因?qū)Ψ侥峥嫉纳镯憫?yīng)及其在氟苯尼考代謝過程中的作用，旨在為克氏原螯蝦養(yǎng)殖中氟苯尼考的合理使用、科學(xué)聯(lián)合用藥及控制藥物殘留提供科學(xué)依據(jù)，同時也為克氏原螯蝦健康養(yǎng)殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料的配制

試驗用飼料為自制的人工配合飼料，基礎(chǔ)飼料（粗蛋白28%，粗脂肪3%，粗灰分20%，總磷1%，鈣0.6%，賴氨酸1.2%，水分12%）經(jīng)粉碎后過0.25 mm篩網(wǎng)，按比例分別加入10、20、30 mg/kg 的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%，Sigma-Aldrich 公司），混勻后加水?dāng)嚢?，用小型絞肉機加工成條狀，50 ℃烘干后用粉碎機破碎成顆粒，即得氟苯尼考人工配合飼料，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗動物分組及管理

克氏原螯蝦（體質(zhì)量20～35 g）購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)農(nóng)貿(mào)市場，使用基礎(chǔ)飼料馴化7 d 后開始試驗，每天定時觀察，剔除死蝦。試驗開始時挑選附肢完整、健康強壯、有活力的克氏原螯蝦，隨機分成4組，每組3個平行，每個平行20尾蝦。

1）試驗分組。C0組（對照組），投喂基礎(chǔ)飼料；試驗組C10 組、C20 組、C30 組，分別投喂氟苯尼考添加量為10、20、30 mg/kg的人工配合飼料。

2）飼養(yǎng)管理?？耸显r飼養(yǎng)于塑料箱（800 mm×600 mm×340 mm）中，水溫（25±1）℃，水深（4±0.5）cm，放入適量水草、泥沙作為隱蔽物，靜水連續(xù)充氧，每日定時換水1/2，每日按蝦體質(zhì)量的5.0%～8.0%投喂飼料，于08：00 和20：00 各投喂1次，飼養(yǎng)20 d 后全部改用不含氟苯尼考的基礎(chǔ)飼料繼續(xù)喂養(yǎng)15 d進(jìn)行消除試驗。

1.3 樣品采集

分別在第1 次給藥后第5、10、15、20、25、30、35天取試驗組和對照組的克氏原螯蝦，用自來水將其表面沖洗干凈，解剖取肝胰腺，用生理鹽水沖洗殘留血液，-80 ℃保存。

1.4 肝胰腺S9微粒體的制備

采用沈鈞等［5］改進(jìn)的方法，肝胰腺用4 ℃的磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每次濾紙吸干并稱質(zhì)量，按1∶5（W/V）的比例加入預(yù)冷的勻漿緩沖液（0.1 mol/L、pH=7.5 的磷酸緩沖液，含1 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟、1 mmol/L 丙基硫氧嘧啶、0.1 mmol/L 二硫蘇糖醇和15%甘油），冰浴勻漿，勻漿液在4 ℃、12 135 r/min 離心25 min，用吸管吸去漂浮的酯類物質(zhì)，上清液即肝胰腺S9微粒體，取上清液至預(yù)冷的離心管備用。

1.5 代謝酶活力測定

Ⅰ相藥物代謝酶CYP450 各亞族選取的代表酶為ECOD、EROD、ERND、AND。Ⅱ相藥物代謝酶選取的代表酶為GST、SULT、UGT。酶活力測定使用齊一生物科技（上海）有限公司和上海江萊生物科技有限公司提供的試劑盒進(jìn)行。

1.6 總RNA提取、cDNA合成及引物設(shè)計

采用Trizol 法提取總RNA［6］，通過分光光度法（D260/D280）和1%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA 的純度和完整性，使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測基因CYP450、GST、HSP70、MT的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參基因。目的基因引物根據(jù)GenBank 序列設(shè)計，引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers used for RT-qPCR assay

1.7 qRT-PCR檢測

采用VAZYME（SYBR Green Master Mix）試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 分析。cDNA 稀釋6 倍，熒光定量反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，正向引物（10 μmol/L）、反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 4 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL，滅菌水4.8 μL。反應(yīng)過程：預(yù)變性95 ℃10 min；變性95 ℃15 s；60 ℃60 s，95 ℃15 s，40 個循環(huán)；以0.5 ℃/s從60 ℃升溫到95 ℃繪制熔解曲線。

使用Thermo Scientific Pikoreal Real 軟件2.1（Thermo）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，目的基因的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法［7］計算。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Origin 2021 軟件作圖，IBM SPSS Statistics 26 進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s 法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異判別標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟苯尼考對ECOD和EROD活力的影響

由圖1 可見，投喂氟苯尼考后，ECOD 和EROD活力降低。投喂氟苯尼考后第10 天，所有試驗組ECOD 和EROD 活力與對照組相比均有顯著性差異，之后持續(xù)降低（P＜0.05）。消除試驗階段，C10組和C20 組ECOD、EROD 活力開始恢復(fù)，并在第35 天恢復(fù)至正常水平，與對照組相比沒有顯著性差異，C30 組ECOD 和EROD 活力較投藥期變化不大，停藥后第35天仍顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖1 克氏原螯蝦肝胰腺ECOD（A）、EROD（B）活力變化Fig.1 Changes of ECOD（A）and EROD（B）activities in hepatopancreas of Procambarus clarkii

2.2 氟苯尼考對AH活力的影響

投喂氟苯尼考后克氏原螯蝦肝胰腺AH 活力變化如圖2所示，試驗組AH活力逐漸降低，第5天開始C30組AH活力顯著低于對照組，并且在第20天降為最小值，第10 天開始C10 組和C20 組AH 活力也顯著低于對照組，在第20 天降為最小值（P＜0.05）。30 mg/kg 氟苯尼考對克氏原螯蝦肝胰腺AH 的抑制作用最強，10 mg/kg 氟苯尼考的抑制作用最弱。消除試驗結(jié)果顯示，氟苯尼考停喂后，試驗組AH 活力逐漸升高，均在第35天恢復(fù)至正常值，與對照組相比沒有顯著性差異。

圖2 克氏原螯蝦肝胰腺AH活力變化Fig.2 Changes of AH activity in hepatopancreas of Procambarus clarkii

2.3 氟苯尼考對ERND和AND活力的影響

由圖3 可見，投喂氟苯尼考后試驗組ERND、AND 活力降低，且呈現(xiàn)降低的趨勢，在第20 天降為最小值。消除試驗階段，試驗組ERND、AND活力開始恢復(fù)，C10 組ERND 活力在第30 天恢復(fù)至正常值，AND 活力在第35 天恢復(fù)至正常水平，與對照組相比沒有顯著性差異。C20 組和C30 組ERND、AND 活力變化不大，35 d 后，ERND 活力仍顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖3 克氏原螯蝦肝胰腺ERND（A）、AND（B）活力變化Fig.3 Changes of ERND（A）and AND（B）activities in hepatopancreas of Procambarus clarkii

2.4 氟苯尼考對GST、SULT、UGT活力的影響

投喂氟苯尼考后，克氏原螯蝦肝胰腺GST、SULT、UGT 活力變化如圖4 所示，試驗組SULT 和UGT 活力升高，第10 天開始與對照組相比有顯著性差異，試驗組GST 活力在第15 天開始與對照組相比有顯著性差異，試驗組3 種酶活力均在第20 天達(dá)到最大值（P＜0.05）。消除試驗結(jié)果顯示，消除期過后，C10 組和C20 組GST 活力仍維持在較高水平，較投喂氟苯尼考期間沒有太大變化，仍顯著高于對照組，而C30組GST 活力逐漸降低并恢復(fù)至正常水平，與對照組相比沒有顯著性差異，C10 組和C20 組SULT活力逐漸恢復(fù)至正常水平，而C30組SULT活力降為正常值后仍繼續(xù)降低并且顯著低于對照組，所有試驗組UGT 活力逐漸降低并恢復(fù)至正常水平，且與對照組相比沒有顯著性差異（P＜0.05）。

圖4 克氏原螯蝦肝胰腺GST（A）、SULT（B）及UGT（C）活力變化Fig.4 Changes of GST（A），SULT（B）and UGT（C）activities in hepatopancreas of Procambarus clarkii

2.5 氟苯尼考對克氏原鰲蝦基因mRNA 表達(dá)的影響

對克氏原螯蝦肝胰腺相關(guān)代謝基因mRNA 表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，投喂氟苯尼考20 d 后，試驗組CYP450mRNA 表達(dá)上調(diào)，并且顯著高于對照組（P＜0.05）。C10 組GST和HSP70mRNA 表達(dá)量上調(diào)，但在C20組和C30組中的表達(dá)下調(diào)。投喂氟苯尼考劑量越高，MTmRNA 表達(dá)量越低，C10 組和C20組MTmRNA表達(dá)上調(diào)，顯著高于對照組（P＜0.05），但C30組MTmRNA表達(dá)量與對照組相比沒有顯著性差異。消除期過后，C20組和C30組CYP450mRNA表達(dá)量仍維持在較高水平，但C10組CYP450mRNA表達(dá)下調(diào)并恢復(fù)至正常水平。所有試驗組GSTmRNA 表達(dá)下調(diào)并恢復(fù)至正常水平。C10 組HSP70mRNA 表達(dá)量與對照組沒有顯著差異，但C20 組和C30 組HSP70mRNA 表達(dá)量顯著低于對照組（P＜0.05）。C20 組MTmRNA 表達(dá)量仍維持在較高水平，但C10 組和C30 組MTmRNA 表達(dá)量恢復(fù)至正常水平。

圖5 克氏原螯蝦肝胰腺基因表達(dá)Fig.5 Gene expression in hepatopancreas of Procambarus clarkii

3 討 論

3.1 氟苯尼考對代謝酶的影響

CYP450 酶系是生物代謝藥物的第一階段酶系，與藥物的代謝有密切關(guān)系［8］，CYP450 酶活力可被藥物誘導(dǎo)或抑制，CYP450 酶也可影響藥物的代謝進(jìn)程，影響藥物的正常療效［9］。ECOD、EROD，AH，ERND、AND 分別是CYP1A、CYP2E 和CYP3A 亞族的標(biāo)志酶，是生物體內(nèi)參與藥物Ⅰ相代謝反應(yīng)的重要解毒酶［1］。GST、UGT 和SULT 是Ⅱ相代謝反應(yīng)中重要的藥物代謝轉(zhuǎn)移酶，GST 可催化外源性物質(zhì)的親電基團(tuán)與還原型谷胱甘肽的巰基結(jié)合［10］，SULT 是機體內(nèi)催化多種外源性化合物硫酸化代謝的關(guān)鍵酶，使外源性化合物更能有效地排出體外，從而達(dá)到解毒的目的［11］，UGT 可催化外源性化合物生成葡萄糖醛酸結(jié)合物［12］。本試驗發(fā)現(xiàn)投喂氟苯尼考后，克氏原螯蝦肝胰腺5 種Ⅰ相代謝酶活力降低，說明肝胰腺細(xì)胞中氧化酶數(shù)量不斷減少，而穩(wěn)定后的狀態(tài)說明氟苯尼考不能無限制抑制氧化酶，這與前人研究發(fā)現(xiàn)藥物對水產(chǎn)動物CYP450 酶大多表現(xiàn)為抑制作用一致［13］，所以推測這些酶參與氟苯尼考在克氏原螯蝦體內(nèi)的代謝反應(yīng)。此外，該結(jié)果說明經(jīng)CYP450 酶代謝的氟苯尼考在肝臟中首過效應(yīng)降低，生物利用度增加，使用時要充分考慮其用量［12］。我們發(fā)現(xiàn)氟苯尼考對不同CYP450酶的抑制效果不同，推測在氟苯尼考代謝的過程中，不同CYP450酶與氟苯尼考可能存在競爭機制和選擇性，或者可能是由于不同的酶結(jié)構(gòu)所致［14］，這表明不同亞群酶在抑制時間或抑制程度上存在差異。試驗組GST活力在投喂氟苯尼考15 d 后顯著高于對照組，遲于5 種CYP450 酶，說明氟苯尼考或其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)積累，減弱了CYP450 酶的代謝結(jié)合能力，GST 迅速對這些物質(zhì)進(jìn)行解毒，緩解機體代謝壓力［15］。SULT和UGT 也被氟苯尼考誘導(dǎo)，但發(fā)揮作用的時間與GST 不同，這種差別表明這3 種酶在克氏原螯蝦中是獨立地發(fā)揮作用。而消除試驗結(jié)果表明，消除期過后，C10 組5 種Ⅰ相代謝酶活力均恢復(fù)至正常水平，說明克氏原螯蝦可通過自身的調(diào)節(jié)機制完成氟苯尼考的代謝，避免造成機體損傷。而用20 mg/kg和30 mg/kg氟苯尼考喂養(yǎng)克氏原螯蝦在停喂氟苯尼考后繼續(xù)用普通飼料飼養(yǎng)15 d，部分酶活力還不能恢復(fù)，表明高劑量氟苯尼考超出了克氏原螯蝦自身的承受能力，引起的氧化損傷破壞了酶的結(jié)構(gòu)。在消除試驗階段，C10 組和C20 組GST 活力仍然較高，目的是清除氟苯尼考在體內(nèi)的殘留，但C30 組SULT活力顯著低于對照組，原因可能是暴露期氟苯尼考劑量過高，超出了SULT 的承載力。此現(xiàn)象說明克氏原螯蝦在氟苯尼考低劑量下能夠?qū)ψ陨斫舛緳C制進(jìn)行調(diào)節(jié)來完成氟苯尼考的代謝，高劑量氟苯尼考對克氏原螯蝦造成氧化損傷［16］。

3.2 氟苯尼考對相關(guān)基因表達(dá)的影響

本研究結(jié)果表明氟苯尼考對CYP450基因表達(dá)有顯著的誘導(dǎo)作用，但基因表達(dá)水平與酶活力變化不一致。有研究報道，天然提取物處理的細(xì)胞中CYP1A1亞型mRNA 轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)之間沒有相關(guān)性［17］，多氯聯(lián)苯可誘導(dǎo)CYP1A1蛋白的表達(dá)，但對CYP1A1 亞型mRNA 的轉(zhuǎn)錄無影響［18］，這說明mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)之間可能不遵循線性關(guān)系，而是具有更為復(fù)雜的關(guān)系［13］。本試驗發(fā)現(xiàn)氟苯尼考在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)CYP450mRNA 的表達(dá)，但抑制CYP450酶活力，說明此抑制作用不通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，而是蛋白質(zhì)合成過程受阻，具體的相關(guān)機制仍有待進(jìn)一步探究。投喂氟苯尼考期間，C10 組GST基因表達(dá)顯著上調(diào)，說明低劑量氟苯尼考對GST基因表達(dá)有誘導(dǎo)作用，催化谷胱甘肽等內(nèi)源性化合物與Ⅰ相代謝產(chǎn)物結(jié)合，減少氟苯尼考與細(xì)胞結(jié)合，降低氟苯尼考對機體產(chǎn)生的危害［19］。C20 組和C30 組GST基因表達(dá)量低于對照組，但GST 活力顯著高于對照組，說明高劑量氟苯尼考雖抑制GST基因表達(dá)，但蛋白質(zhì)合成過程可能不受影響。熱休克蛋白HSP70 是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)、高度保守的可溶性蛋白［20］，生物受到刺激后，HSP70可通過維持蛋白質(zhì)構(gòu)象、抗凋亡、細(xì)胞保護(hù)等作用以維持機體穩(wěn)態(tài)，抵抗一系列應(yīng)激［21］，與生物的環(huán)境適應(yīng)能力密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)投喂10 mg/kg 氟苯尼考時，HSP70mRNA 表達(dá)上調(diào)，當(dāng)氟苯尼考劑量增加時，HSP70mRNA 表達(dá)下調(diào)，并且低于對照組，說明高劑量氟苯尼考引起克氏原螯蝦的機體損傷［13］。MT主要功能是維持生物體內(nèi)必需金屬元素的穩(wěn)定和非必需金屬元素的解毒，是一類多功能誘導(dǎo)性的小分子蛋白家族，MT 富含半胱氨酸，具有很強的自由基清除能力，能有效清除機體羥基自由基［22］。MT 的抗氧化作用不僅表現(xiàn)為能直接清除OH—，還能顯著提高超氧化物歧化酶的活力，在機體解毒過程和抗氧化防御方面發(fā)揮重要的作用［16］。本研究中，氟苯尼考誘導(dǎo)MTmRNA 表達(dá)上調(diào)，但表達(dá)量隨氟苯尼考劑量的增大而減少，說明氟苯尼考導(dǎo)致肝臟細(xì)胞產(chǎn)生自由基，引起了氧化應(yīng)激，克氏原螯蝦可以通過MTmRNA 表達(dá)應(yīng)對低劑量氟苯尼考造成的這種改變，但高劑量氟苯尼考超出了機體的承受范圍，大量的自由基對機體造成一定的損傷。

消除試驗的結(jié)果表明，氟苯尼考停藥15 d 后，C20組和C30組部分基因表達(dá)沒有恢復(fù)至正常水平，說明高劑量氟苯尼考對克氏原螯蝦造成的氧化損傷需要更長的休藥期來恢復(fù)甚至不能恢復(fù)。

綜上，氟苯尼考對Ⅰ相藥物代謝酶具有抑制作用，但對Ⅱ相藥物代謝酶具有誘導(dǎo)作用。基因表達(dá)結(jié)果表明，氟苯尼考可誘導(dǎo)CYP450基因表達(dá)上調(diào)，10 mg/kg 氟苯尼考誘導(dǎo)GST基因表達(dá)上調(diào)，但20 mg/kg 和30 mg/kg 氟苯尼考抑制GST基因表達(dá)，基因表達(dá)與酶活力變化不一致的現(xiàn)象說明基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成之間并沒有必然的聯(lián)系；10 mg/kg 氟苯尼考通過誘導(dǎo)HSP70、MT等基因的表達(dá)維持機體的穩(wěn)態(tài)，但高劑量氟苯尼考超出了機體的承受范圍，引起機體損傷。因此，為安全起見，以飼料摻拌方式喂養(yǎng)克氏原螯蝦時，建議氟苯尼考劑量為10 mg/kg，既有利于充分發(fā)揮藥效而不會過早排出體外，又可避免氟苯尼考劑量過高造成克氏原螯蝦機體損傷和在體內(nèi)蓄積。