張曦晨，李萌，楊書珍，彭麗桃，馮柏如，楊菁菁

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.廣州粒上皇食品有限公司，廣州 510600

板栗（Castanea mollissimaBlume）是殼斗科栗屬堅(jiān)果類植物，在我國(guó)大部分地區(qū)均有栽培，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)樹種，其種植面積和產(chǎn)量均居世界首位［1］。板栗果實(shí)甘甜味美，營(yíng)養(yǎng)豐富，素有“干果之王”的美譽(yù)［2］。但與其他堅(jiān)果相比，板栗的淀粉含量和水分含量較高，采后呼吸作用旺盛，對(duì)貯藏環(huán)境的溫濕度很敏感，在采后貯運(yùn)過(guò)程中常因管理不當(dāng)遭受病原菌的侵染而腐爛變質(zhì)［3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年因貯藏不當(dāng)而造成的板栗果實(shí)腐爛變質(zhì)導(dǎo)致的損失占總產(chǎn)量的20%～30%，而在南方的一些板栗產(chǎn)區(qū)，由于采收期高溫、高濕的環(huán)境，嚴(yán)重時(shí)板栗腐爛率可達(dá)50%，給板栗產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了極大的損失［4］。

板栗的采后病害通常是由于多種病原菌的共同侵染所致，發(fā)病癥狀多且雜，目前尚未有統(tǒng)一的系統(tǒng)分類。根據(jù)病斑的表觀顏色不同，板栗采后病害可分為黑腐、褐腐和紅腐；根據(jù)病果的濕潤(rùn)程度不同，可分為干腐和濕腐；根據(jù)病原菌的侵染途徑不同，可分為外腐和內(nèi)腐［5］。此外，板栗采后病原真菌的種類和數(shù)量受其產(chǎn)地和品種的影響大［6］，給板栗采后病害的防治帶來(lái)了極大的困難［7］。因此，明確板栗采后優(yōu)勢(shì)致腐真菌，進(jìn)一步針對(duì)性地控制板栗采后病害，對(duì)于有效減少板栗采后損失具有重要意義。

植物精油是一種植物源次生代謝產(chǎn)物［8］，通常具有優(yōu)異的抑菌活性，不僅對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌具有顯著的抑制效果［9］，同時(shí)對(duì)青霉菌、根霉菌和鏈格孢菌等病原真菌引起的果實(shí)采后病害也表現(xiàn)出良好的控制作用［10］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的3 000 多種植物精油中，約有1 340種具有較強(qiáng)的抑菌活性，是開發(fā)新型果蔬采后天然抑菌劑的優(yōu)勢(shì)資源［11］。然而，由于大多數(shù)植物精油的成分復(fù)雜，極易受植物的種類、品種、生長(zhǎng)部位和產(chǎn)地的影響，致使其生物活性穩(wěn)定性差，給植物精油在食品防腐保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用帶來(lái)一定的困難［12］。因此，近年來(lái)人們對(duì)植物精油單組分的抗菌活性進(jìn)行了廣泛研究，并發(fā)現(xiàn)了一些具有強(qiáng)烈抗菌活性的植物精油單組分，如檸檬醛［13］、香葉醇［14］、丁香酚［15］和肉桂醛［15］等對(duì)采后果蔬具有良好的抑菌防腐效果。目前有關(guān)植物精油單組分控制板栗采后病害的研究相對(duì)較少。因此，本研究從不同來(lái)源的發(fā)病板栗中分離并鑒定板栗采后優(yōu)勢(shì)致腐真菌，并分析植物精油單組分對(duì)優(yōu)勢(shì)致腐真菌的抑制活性，在此基礎(chǔ)上研究了活性精油單組分香芹酚對(duì)板栗采后病害的控制作用，旨在為進(jìn)一步研發(fā)適合板栗采后防腐保鮮的天然防腐保鮮劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用板栗采自湖北省黃岡市羅田縣鳳山鎮(zhèn)栗子坳工業(yè)園區(qū)，品種包括“大紅袍”“羊毛栗”和“紅光油栗”；試驗(yàn)中所有真菌的培養(yǎng)均使用馬鈴薯瓊脂葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基；PCR 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；紫蘇醛（90%）、肉桂醛（98%）、檸檬醛（97%）、葉醛（98%）、丁香酚（99%）、芳樟醇（98%）、橙花醇（97%）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司；麝香草酚（99%）、香芹酚（99%）、香茅醇（95%）均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；試驗(yàn)中其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 病原菌的分離與純化

板栗致腐菌的分離與純化采用組織分離法［16］進(jìn)行，具體的操作步驟：將常溫貯藏2 周后的板栗病果用刀片剝?nèi)ネ鈿ぃ謩e從果殼和果仁的病健交界處挑取組織，將組織小塊在75%乙醇中浸泡消毒10 s，經(jīng)無(wú)菌水清洗3次后，接種至PDA 培養(yǎng)基，26 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，挑取生長(zhǎng)在菌落邊緣的幼嫩菌絲體轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基上，在同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)之前的分離操作3～5 次，直至獲得純菌落，根據(jù)其菌落與菌絲的形態(tài)特征進(jìn)行初步歸類和編號(hào)，并保存菌種。

1.3 致病性測(cè)定

采用菌餅接種法［17］對(duì)病原菌的致病性進(jìn)行測(cè)定。將病原真菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，26 ℃下培養(yǎng)4 d后，于菌落邊緣取菌餅（直徑8 mm）待用。板栗經(jīng)過(guò)清水浮選，剔除浮起的病蟲害果后，選擇大小均一，表面無(wú)機(jī)械損傷的羅田板栗，用0.4%的NaClO溶液進(jìn)行表面消毒后，采用造傷接種法，用刀片在果實(shí)腰部割開一個(gè)方形小孔，露出內(nèi)種皮，將菌餅反貼至造傷部位。每種病原菌分別接種15 顆板栗，以反貼無(wú)菌PDA 培養(yǎng)基至造傷部位的板栗作對(duì)照，于室溫下放置7 d 后剝?nèi)ネ鈿?，觀察果仁的發(fā)病情況。按照公式（1）和公式（2）分別統(tǒng)計(jì)致病率和病情指數(shù)，并在病斑處再次分離病原菌，獲得菌株應(yīng)與原接種菌株一致。板栗病害病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［18］：0 級(jí)，果實(shí)不感病，未出現(xiàn)病斑；1級(jí)，有病斑但不擴(kuò)散；2級(jí)，0 mm＜病斑直徑≤5 mm；3 級(jí)，5 mm＜病斑直徑≤10 mm；4級(jí)，病斑直徑＞10 mm。

1.4 病原菌鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定。將通過(guò)致病性實(shí)驗(yàn)所得到的優(yōu)勢(shì)致腐真菌于26 ℃下培養(yǎng)3 d，根據(jù)其菌落形態(tài)、色澤、生長(zhǎng)速度和氣生菌絲的疏密程度，以及觀察光學(xué)顯微鏡下的菌絲形態(tài)、菌絲隔膜及孢子形態(tài)等特征，對(duì)病原菌進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定。

2）分子生物學(xué)鑒定。采用CATB 法［19］提取菌株基因組DNA，使用EF22T/EF3 和T22-R/T1-F、EF1-986R/EF1-728F 和ITS1/ITS4 兩組引物（表1）［20-23］分別對(duì)病原菌菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（15 μL 2×PCR Mix，1 μL DNA，1 μL10 mmol/L Forward primer 與1 μL10 mmol/L Reverse primer，12 μL ddH2O），95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 次循環(huán)。72 ℃修復(fù)延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)（20 min，120 V）后，由天一輝遠(yuǎn)生物科技（武漢）有限公司進(jìn)行測(cè)序，將獲得的序列與從NCBI中下載的菌株序列進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)人工校正后使用軟件MEGA 7.0，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 用于分子鑒定的基因位點(diǎn)與引物序列Table 1 Gene locus and primer sequences used to molecular identification

1.5 植物精油單組分的抑菌活性評(píng)價(jià)

參考Ambrico 等［24］的濾紙片擴(kuò)散法并稍作修改。將病原真菌在PDA 培養(yǎng)基上于26 ℃培養(yǎng)3 d后，于菌落邊緣處取菌餅，反貼于PDA 培養(yǎng)基的中央。將不同體積的植物精油單組分滴加至直徑為20 mm、已滅菌的圓形濾紙片上，迅速密封培養(yǎng)皿，26 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，每隔24 h 測(cè)定1 次菌落直徑，并按照公式（3）計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，以滴加等量蒸餾水的平板作對(duì)照。以精油單組分的濃度為橫坐標(biāo)，以菌絲生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)，制作毒力回歸方程并計(jì)算相應(yīng)的EC50和EC90。

1.6 香芹酚對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)和菌絲生物量的影響

菌落生長(zhǎng)的測(cè)定采用生長(zhǎng)速率法［25］進(jìn)行。將病原菌菌絲轉(zhuǎn)接至PDA 培養(yǎng)基上于26 ℃培養(yǎng)3 d 后，于菌落邊緣處取菌餅，反貼于PDA 培養(yǎng)基的中央。將不同體積的香芹酚（使其最終體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到0、5、10、15、20、25、30 μL/L）滴加至直徑為20 mm、已滅菌的圓形濾紙片上，迅速將其粘貼至培養(yǎng)皿內(nèi)蓋中心位置，迅速用封口膜將培養(yǎng)皿緊密封口；每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，26 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，定期觀察菌落形態(tài)，并用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

菌絲生物量的測(cè)定采用文獻(xiàn)［25］的方法進(jìn)行。將病原菌菌絲轉(zhuǎn)接至PDB 培養(yǎng)基中26 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，無(wú)菌過(guò)濾收集菌絲，稱取1.0 g的幼嫩濕重菌絲接種于100 mL 的PDB 培養(yǎng)基中，加入一定體積的香芹酚，使其最終體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到12.5、25、50、100、200 μL/L。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，26 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，菌絲過(guò)濾后用蒸餾水沖洗2次，冷凍干燥60 h，記錄菌絲干質(zhì)量。

1.7 香芹酚熏蒸處理對(duì)板栗采后病害的控制效果

將板栗進(jìn)行清水浮選，挑除已腐爛和發(fā)芽的果實(shí)后，再挑選外殼色澤一致，大小均一且無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)待用。病原菌的接種方法與本文“1.3”方法一致。香芹酚處理采用熏蒸法，將已接種病原菌的板栗置于帶蓋保鮮盒內(nèi)，滴加一定量的香芹酚于濾紙片上，貼于保鮮盒內(nèi)側(cè)，使盒內(nèi)香芹酚體積分?jǐn)?shù)為80 μL/L，以加入等量蒸餾水熏蒸空白對(duì)照，以上每組處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 顆果實(shí)，密閉熏蒸16 h，熏蒸結(jié)束后打開盒蓋通風(fēng)30 min，用扎孔保鮮膜封口，室溫下放置7 d 后，按照與本文“1.3”的方法測(cè)定板栗的發(fā)病率與病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗采后病害病原菌的分離純化結(jié)果

從150 顆不同來(lái)源的板栗腐爛果實(shí)中分離獲得共464 株病原菌，根據(jù)菌落在PDA 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)大致分為23類，經(jīng)過(guò)初步的致病性測(cè)定，獲得了5 株具有較強(qiáng)的致病性的病原真菌，編號(hào)依次為BL-3、BL-8、BL-18、BL-20 和BL-22，在分離純化過(guò)程中分別檢出36、30、39、49和33株。

2.2 板栗采后病害優(yōu)勢(shì)病原菌的致病性

根據(jù)柯赫氏法則，將前期篩選得到的5株病原菌菌株回接至健康的板栗果實(shí)上，室溫放置7 d 后將板栗外殼剝?nèi)?，觀察到部分板栗種仁表面產(chǎn)生了明顯的黑灰色病斑，少數(shù)種仁表面還有白色或粉紅色的菌苔覆蓋，而對(duì)照組果實(shí)則沒(méi)有發(fā)病。對(duì)病果發(fā)病組織中的病原菌再次分離純化培養(yǎng)，其生長(zhǎng)特性與菌落、菌絲形態(tài)等均與原菌株一致。由表2可知，BL-8 和BL-18 的致病率和病情指數(shù)均為最高，致病率分別為100% 和93.33%，病情指數(shù)分別為68.33 和63.33，說(shuō)明其致病性最強(qiáng)，而BL-20 的致病性最弱，其致病率和病情指數(shù)均為最低。

表2 板栗采后病原真菌的致病性Table 2 Pathogenicity assay of isolated fungal strains on chestnut

2.3 板栗采后病害優(yōu)勢(shì)病原菌的顯微形態(tài)特征

根據(jù)菌落特征、菌絲形態(tài)和孢子形態(tài)等對(duì)菌株BL-3、BL-8、BL-18、BL-20、BL-22 進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定，其菌落特征與顯微結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 5種優(yōu)勢(shì)病原菌的菌落形態(tài)（A）、菌絲形態(tài)（B）與孢子形態(tài)（C）觀察Fig.1 Colony morphology（A），mycelial morphology（B）and spore characteristics（C）of five pathogenic fungal strains

BL-3：菌落呈邊緣整齊的圓形，初為白色，培養(yǎng)2～3 d 后逐漸轉(zhuǎn)為淡粉色，最后漸變?yōu)榈S色，氣生菌絲呈白色棉絮狀，生長(zhǎng)速度中等。菌絲有分支與隔膜，寬度約為3.20～5.30 μm，在PDA 培養(yǎng)基上可產(chǎn)生大量小型分生孢子，有單細(xì)胞和多細(xì)胞2 種，呈橢圓或長(zhǎng)條形，長(zhǎng)5.10～18.75 μm，寬1.89～2.50 μm，依據(jù)上述特征并結(jié)合菌種鑒定手冊(cè)初步鑒定為鐮孢菌屬（Fusariumsp.）。

BL-8：菌落呈邊緣整齊的圓形，初為白色，培養(yǎng)2～3 d 后逐漸轉(zhuǎn)為淺粉色，最后呈玫紅色，氣生菌絲旺盛，呈白色絨毛狀，生長(zhǎng)速度較快。菌絲有分支與隔膜，寬度約為6.46～7.85 μm。由于在PDA 培養(yǎng)基上未觀察到分生孢子，依據(jù)上述特征并結(jié)合文獻(xiàn)［26］認(rèn)為其與鐮孢菌屬（Fusariumsp.）的形態(tài)特征相似，需要進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)鑒定明確其種類。

BL-18：菌落邊緣不整齊，初為白色，培養(yǎng)2～3 d后逐漸轉(zhuǎn)為灰綠色，最后顏色加深至灰黑色，氣生菌絲旺盛，呈白色棉絮狀，生長(zhǎng)速度較快。菌絲多為無(wú)隔膜菌絲，菌絲寬度約為2.46～4.72 μm。由于在PDA 培養(yǎng)基上未觀察到分生孢子，依據(jù)上述形態(tài)特征并結(jié)合文獻(xiàn)［27］，認(rèn)為其與新殼梭孢屬（Neofusicoccumsp.）的形態(tài)特征相似，需要進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)鑒定明確其種類。

BL-20：菌落呈邊緣整齊的圓形，匍匐生長(zhǎng)，始終為淺白色，無(wú)氣生菌絲，生長(zhǎng)速度緩慢。營(yíng)養(yǎng)菌絲有少量分支與隔膜，寬度約為7.10～9.50 μm，在PDA培養(yǎng)基上觀察到呈長(zhǎng)串狀生長(zhǎng)的分生孢子，以菌絲節(jié)孢的方式產(chǎn)孢，單個(gè)的分生孢子呈方形、長(zhǎng)筒型或圓形，長(zhǎng)3.92～6.65 μm，寬2.46～3.60 μm，依據(jù)上述特征并結(jié)合菌種鑒定手冊(cè)初步鑒定為地霉屬（Geotrichumsp.）。

BL-22：菌落初始為灰白色，培養(yǎng)約3 d 后，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?，表面密生小顆粒孢子團(tuán)，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)速度中等。菌絲有分支與隔膜，寬度約為6.35～9.24 μm，可觀察到球形孢子囊，內(nèi)含大量圓形或橢圓形的孢囊孢子，孢子長(zhǎng)0.90～1.57 μm，寬1.10～1.24 μm。依據(jù)上述形態(tài)特征，結(jié)合菌種鑒定手冊(cè)初步鑒定為毛霉屬（Mucorsp.）。

2.4 板栗采后病害優(yōu)勢(shì)病原菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株BL-8 的EF-1α和β-tubulin片段、BL-18的EF-1α和ITS片段進(jìn)行擴(kuò)增，菌株BL-8 分別獲得676 bp 和1 260 bp 的片段，菌株BL-18 分別獲得282 bp 和577 bp 的片段。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，下載同源性較高的菌株序列，與菌株BL-8 和BL-18 的相應(yīng)序列構(gòu)建雙基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)菌株BL-8與分離自玉米的F.asiaticum聚為同一分支（圖2），其EF-1α和β-tubulin核苷酸序列與F. asiaticum菌株HBQHD529 的匹配度分別達(dá)到了99.85%和99.84%。菌株BL-18 與分離自芒果、草莓、藍(lán)莓和柳樹的N. parvum聚為同一分支（圖3），其EF-1α和ITS核苷酸序列與N. parvum菌株WTS24 的匹配度分別達(dá)到了98.89%和100%。因此，菌株BL-8鑒定為Fusarium asiaticum，菌株BL-18鑒定為Neofusicoccum parvum。

圖2 基于菌株BL-8的EF-1α和β-tubulin基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed through NJ method based on combined EF-1α and β-tubulin gene sequences

圖3 基于菌株BL-18的EF-1α和ITS基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed through NJ method based on combined EF-1α and ITS gene sequences

2.5 植物精油單組分對(duì)板栗優(yōu)勢(shì)致腐菌的抑制作用

采用菌餅法測(cè)定了香芹酚、丁香酚、麝香草酚、紫蘇醛、肉桂醛、葉醛、檸檬醛、芳樟醇、香茅醇和橙花醇等10種常見(jiàn)的植物精油單組分對(duì)板栗采后優(yōu)勢(shì)致腐菌的抑制作用，結(jié)果如表3 所示，大多數(shù)精油單組分對(duì)菌株BL-8 和BL-18 表現(xiàn)出了一定的抑菌活性。香芹酚、丁香酚、麝香草酚、紫蘇醛、肉桂醛、葉醛、檸檬醛以及芳樟醇均對(duì)菌株BL-8 表現(xiàn)出顯著的抑制作用，其EC50值和EC90值均低于100 μL/L。其中，香芹酚的抑菌效果最強(qiáng)，對(duì)菌株BL-8 的EC50和EC90分別為5.696 和24.431 μL/L。而香芹酚、麝香草酚、紫蘇醛、葉醛等精油單組分對(duì)菌株BL-18 表現(xiàn)出明顯的抑制效果，其EC50值和EC90值均低于100 μL/L，同樣是香芹酚擁有最強(qiáng)的抑菌活性，其EC50和EC90分別僅達(dá)到2.561和11.768 μL/L。

表3 10種植物精油單組分對(duì)板栗優(yōu)勢(shì)致腐菌BL-8和BL-18抑制作用Table 3 Inhibitory effects of 10 essential oil components on the dominant pathogenic fungus of postharvest chestnut μL/L

2.6 香芹酚對(duì)板栗優(yōu)勢(shì)致腐菌菌絲生長(zhǎng)的影響

進(jìn)一步采用菌餅法和菌絲干重法分析香芹酚對(duì)板栗采后優(yōu)勢(shì)致腐菌菌株BL-8 和BL-18 生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖4、圖5 所示。由圖4A、B 可知，經(jīng)香芹酚處理的菌株BL-8的菌落直徑顯著低于對(duì)照菌的菌落直徑；香芹酚對(duì)菌株BL-8 的菌落生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈明顯的濃度效應(yīng)，當(dāng)香芹酚的體積分?jǐn)?shù)為30 μL/L 時(shí)，菌株BL-8 的菌落生長(zhǎng)被完全抑制。香芹酚處理對(duì)菌株BL-18 菌落生長(zhǎng)的抑制作用規(guī)律與菌株BL-8 相似，當(dāng)香芹酚的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到25 μL/L 時(shí)，菌株BL-18的菌落生長(zhǎng)被完全抑制。由圖5 可以看出，經(jīng)香芹酚處理的菌株BL-8 和BL-18，其菌絲干質(zhì)量顯著下降，并且隨著香芹酚體積分?jǐn)?shù)的增高，菌絲干質(zhì)量呈逐漸下降的趨勢(shì)。可見(jiàn)，香芹酚對(duì)板栗采后優(yōu)勢(shì)致腐菌菌株BL-8和BL-18的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用。

圖4 香芹酚處理后菌株BL-8（A）和BL-18（B）的菌落生長(zhǎng)情況Fig.4 Inhibition of carvacrol on colony growth of strain BL-8（A）and BL-18（B）

圖5 香芹酚處理下菌株BL-8和BL-18菌絲的干質(zhì)量Fig.5 Inhibition of carvacrol on mycelial biomass of strain BL-8 and BL-18

2.7 香芹酚熏蒸對(duì)板栗采后病害的控制效果

香芹酚對(duì)板栗采后病害的防治效果如圖6所示。接種菌株BL-8 和BL-18 的對(duì)照組果實(shí)感病癥狀明顯（圖6A、C），病情指數(shù)分別為94.45 和100（圖6B、D）。而經(jīng)過(guò)香芹酚熏蒸處理的板栗果實(shí)，發(fā)病癥狀和病情指數(shù)顯著低于對(duì)照組果實(shí)（圖6A）；并且在0～80 μL/L 的體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，隨著香芹酚濃度的上升，板栗果實(shí)的病情指數(shù)顯著降低，當(dāng)香芹酚的濃度達(dá)80 μL/L時(shí)，接種菌株BL-8 和BL-18的板栗果實(shí)的病情指數(shù)分別驟降至19.45和36.11，采后病害抑制率分別達(dá)到了79.4%和63.89%。可見(jiàn)，香芹酚熏蒸處理對(duì)板栗果實(shí)采后病害具有明顯的防治效果。

3 討 論

由病原真菌侵染引起的板栗病害是造成板栗采后腐爛的重要原因之一，我國(guó)板栗種植產(chǎn)區(qū)的分布十分廣泛，病原菌的種類及其侵染特性都存在著較大的地域差異性。王海霞等［5］對(duì)來(lái)自北京市產(chǎn)區(qū)的板栗進(jìn)行了病原菌的分離鑒定，其研究結(jié)果表明鐮孢菌屬和殼梭孢屬的致腐菌具有潛伏侵染的致病特性。梁麗松等［28］從湖北、湖南、安徽的等8 個(gè)主要板栗產(chǎn)區(qū)的6 個(gè)產(chǎn)區(qū)板栗中都分離出了鐮孢菌屬的病原菌，分布地域十分廣泛。菌株BL-18則是林木和果樹中的常見(jiàn)病原菌，可直接侵染果實(shí)導(dǎo)致采后柑橘、檸檬、蘋果和芒果的腐爛，也可在果樹的枝干和根中潛伏，造成枝干枯萎、樹根死亡［28-29］。本研究發(fā)現(xiàn)菌株BL-8和菌株BL-18在板栗采后病害的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，是2 種主要的致腐菌，此結(jié)果與前人研究基本一致［30］。在病原菌鑒定過(guò)程中，菌株BL-8 和菌株BL-18 均未在PDA 培養(yǎng)基上觀察到分生孢子，這與單柳穎［31］和袁志林等［32］的研究發(fā)現(xiàn)一致，這2種霉菌在營(yíng)養(yǎng)豐富的PDA培養(yǎng)基中均無(wú)法產(chǎn)生有性或無(wú)性繁殖結(jié)構(gòu)，需要在綠豆湯培養(yǎng)基等特殊培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并通過(guò)近紫外線照射誘導(dǎo)產(chǎn)孢。此外，本研究還在板栗病果中分離出了毛霉屬（Mucorsp.）和地霉屬（Geotrichumsp.），但其致病性并不強(qiáng)。吳小芹等［33］從江蘇“九家種”板栗病果中分離出了鐮刀屬、殼梭孢屬和毛霉屬，其中毛霉屬的分離率最高。李琳玲等［34］認(rèn)為束絲菌屬和曲霉屬是湖北羅田板栗病害的重要致腐菌。結(jié)合以往的研究來(lái)看，從同一批的發(fā)病板栗中可以分離出多種病原菌，而同一種病原菌也可以從不同產(chǎn)地、不同病癥的板栗中分離到。Turchetti 等［35］認(rèn)為，從同一批板栗中分離出的多種真菌并不都在板栗腐爛過(guò)程中起主要作用，由于菌種之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，直接導(dǎo)致板栗病害的可能只有少數(shù)幾種優(yōu)勢(shì)菌。因此，鑒于板栗復(fù)雜的發(fā)病規(guī)律，既需要全面系統(tǒng)地研究明確各種病原菌的種類與分布，也需要深入精確地研究病原菌的侵染機(jī)制與防控措施。

在果蔬采后防腐保鮮的領(lǐng)域，香芹酚也展現(xiàn)出了良好的發(fā)展前景。前人研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚作為牛至精油的主要成分，對(duì)青霉菌、曲霉菌、根霉菌等多種果蔬采后腐敗真菌均有抑制作用。Wu 等［36］報(bào)道了百里香精油對(duì)由鏈格孢菌引起的圣女果采后病害有良好的體外抑菌活性和病害控制效果，而百里香精油中的主要活性成分正是香芹酚。候輝宇等［37］發(fā)現(xiàn)香芹酚對(duì)鏈格孢菌和尖孢鐮孢菌的MIC 值均低于500 mg/L。此外，添加了香芹酚的可食性涂膜能有效減輕草莓的腐爛癥狀，延長(zhǎng)草莓的貨架期［38］。本研究通過(guò)測(cè)定香芹酚、丁香酚、麝香草酚、紫蘇醛、肉桂醛、葉醛、檸檬醛、芳樟醇、香茅醇和橙花醇等10種植物精油單組分對(duì)板栗采后病害病原真菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)香芹酚對(duì)板栗優(yōu)勢(shì)致腐菌的抑制效果最為顯著，將香芹酚以熏蒸的方式處理板栗，能有效控制板栗病害的發(fā)生。綜上所述，結(jié)合本研究的結(jié)果，作為一種天然植物源抑菌劑，香芹酚對(duì)板栗優(yōu)勢(shì)致腐菌所表現(xiàn)出的顯著抑制作用，以及對(duì)板栗采后病害的良好控制效果，使其在板栗采后真菌性病害的防治工作中具備了潛在的應(yīng)用價(jià)值。