張 宇，夏 利，林蓓蓓，張穩(wěn)杰，徐皓然，張成林

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

L-高絲氨酸屬于L-天冬氨酸族非蛋白質(zhì)氨基酸，是合成必需氨基酸L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸和L-異亮氨酸的前體物[1]。作為重要的平臺化合物，L-高絲氨酸還被用于O-乙酰高絲氨酸、L-氮雜環(huán)丁烷、高絲氨酸內(nèi)酯、異丁醇和γ-丁內(nèi)酯等高附加值化合物的合成[2-7]。此外，有研究表明L-高絲氨酸還具有提高植物抗逆性、促進(jìn)家禽生長的功能[5,8]。由此可見，L-高絲氨酸有望廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

目前L-高絲氨酸主要通過化學(xué)法合成，但由于合成效率低等原因限制了其生產(chǎn)規(guī)模和應(yīng)用范圍[3]。近年來，隨著代謝工程和合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展，發(fā)酵法合成L-高絲氨酸受到廣泛關(guān)注。如圖1所示，L-高絲氨酸的生物合成以草酰乙酸為前體物，經(jīng)天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸半醛脫氫酶催化合成，其中天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶為限速酶[4]。L-高絲氨酸通常在胞內(nèi)不積累，而直接代謝為L-蘇氨酸。此外，L-賴氨酸與L-高絲氨酸競爭前體物天冬氨酸半醛。故常見L-高絲氨酸生產(chǎn)菌株代謝工程選育策略主要包括增強(qiáng)前體物草酰乙酸合成、阻斷L-高絲氨酸競爭和降解途徑等。Plachy等[9]最先報道利用L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）發(fā)酵72 h生成14.2 g/LL-高絲氨酸，但同時積累7.5 g/LL-賴氨酸。Li Ning等[4]利用阻斷C. glutamicum L-高絲氨酸競爭及降解途徑并增加其合成通量等策略，使得L-高絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到8.8 g/L。但總體而言，利用C. glutamicum合成L-高絲氨酸效率較低。

大腸桿菌（Escherichia coli）因遺傳背景清晰、生長速度快等特性也被應(yīng)用于發(fā)酵法合成L-高絲氨酸研究[10-17]。Li Hua等[16]報道通過代謝工程改造E. coli合成L-高絲氨酸39.5 g/L（45 h），為目前報道的最高產(chǎn)量。Liu Peng等[17]通過對E. coli代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)使得L-高絲氨酸產(chǎn)量達(dá)37.6 g/L（108 h）。盡管利用E. coli合成L-高絲氨酸取得了顯著進(jìn)展，但構(gòu)建適用于工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)胞工廠仍具有挑戰(zhàn)性。主要表現(xiàn)在，為使L-高絲氨酸積累，現(xiàn)有菌株的L-高絲氨酸降解途徑相關(guān)基因均被敲除，造成L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)缺陷。故需在發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加適量的上述營養(yǎng)物質(zhì)。這不僅增加了生產(chǎn)成本，還使得發(fā)酵過程復(fù)雜化。

圖1 L-高絲氨酸合成途徑及本研究主要策略Fig. 1 Pathway and strategy for the synthesis of L-homoserine used in this study

本研究針對上述問題，以E. coliW3110為底盤細(xì)胞構(gòu)建非營養(yǎng)缺陷型的L-高絲氨酸高效合成基因工程菌。首先弱化L-高絲氨酸降解途徑削弱其降解；然后通過增強(qiáng)合成代謝流、提高前體物和輔酶供應(yīng)實現(xiàn)L-高絲氨酸積累；在此基礎(chǔ)上促進(jìn)L-高絲氨酸外排，進(jìn)一步提高其產(chǎn)量（圖1）。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究使用的菌株和質(zhì)粒見表1。其中E. coliDH5α用于質(zhì)粒構(gòu)建，E. coliW3110 ΔlacI作為出發(fā)菌株用于構(gòu)建L-高絲氨酸生產(chǎn)菌株。E. coliCRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)所用質(zhì)粒pRedCas9和pGRB由天津大學(xué)陳濤教授惠贈。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertan）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.5。

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.5。

搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉12 g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，MnSO4·7H2O 8 mg/L，VB12 mg/L，pH 7.0～7.5。發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基同搖瓶種子培養(yǎng)基。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉4 g/L， KH2PO42 g/L，MgSO4·H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，pH 7.0～7.5。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨8 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO43.5 g/L，MgSO4·H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，玉米漿30 mL/L，pH 7.0～7.5。

1.1.3 引物

引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，序列見表2。

表2 DNA片段擴(kuò)增引物Table 2 Primers used for the amplification of DNA fragments

續(xù)表2

1.1.4 試劑

(NH4)2SO4、MgSO4·H2O、KH2PO4國藥集團(tuán)試劑有限公司；L-高絲氨酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物 英國Oxoid公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒美國Omega BioTek公司；限制性內(nèi)切酶、Primer STAR HS DNA聚合酶 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；一步法克隆試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000高效液相色譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；PTC-1148型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；ZORBAX Eclipse AAA氨基酸柱 美國Agilent公司；SBA-40D生物傳感器分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)粒及重組菌株的構(gòu)建

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因整合和啟動子替換[18]。以將PthrABC替換為PBBa_J23108為例。利用sgRNA設(shè)計工具CRISPR RGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-designer/）設(shè)計20 bp間隔序列（pGRB-thrABC-1和pGRB-thrABC-2），退火后利用一步法克隆試劑盒與線性pGRB連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α并篩選后獲得質(zhì)粒pGRBPthrB。以E. coliW3110基因組DNA為模板，分別利用引物thrL-U-F/PBBa_J23108-U-R和PBBa_J23108-D-F/thrL-D-R擴(kuò)增并通過重疊PCR獲得含PthrABC上下游同源臂和PBBa_J23108的供體DNA。將PthrB（100 ng）和供體DNA（200 ng）電轉(zhuǎn)化至含pREDCas9的E. coliW3110ΔlacI感受態(tài)細(xì)胞中。復(fù)蘇2 h后，涂布于含100 μg/mL的氨芐青霉素和奇霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于32 ℃培養(yǎng)過夜。挑選單菌落，利用引物thrL-U-F/thrL-D-R進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的轉(zhuǎn)化子于含10 mmol/L阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基中32 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，以丟失pGRB-PthrB。利用菌落PCR對重組菌株進(jìn)行鑒定，并將PCR產(chǎn)物委托蘇州金唯智生物科技有限公司測序驗證。菌株于LB液體培養(yǎng)基42 ℃振蕩培養(yǎng)過夜以丟失pREDCas9質(zhì)粒。每次構(gòu)建獲得的菌株于LB液體培養(yǎng)基活化并連續(xù)傳代10 次，稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基，挑取3～5 個單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗，選取L-高絲氨酸產(chǎn)量高且生物量無顯著降低的菌株進(jìn)行后續(xù)改造。

以E. coliW3110基因組DNA為模板，利用引物rhtA-1和rhtA-2擴(kuò)增rhtA基因，PCR產(chǎn)物回收后連接至經(jīng)NcoI酶切的pTrc99a質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、菌落PCR鑒定后獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-rhtA。將pTrc99a-rhtA電轉(zhuǎn)化至H-9，經(jīng)篩選、菌落PCR鑒定后獲得菌株H-10。

1.3.2 發(fā)酵實驗

1.3.2.1 搖瓶發(fā)酵

將適量經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后的菌體細(xì)胞接種至含30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，35 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。以1%接種量接種至45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，35 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵過程中根據(jù)情況補(bǔ)充80%葡萄糖，用氨水調(diào)節(jié)pH值約為7.0。利用H-10發(fā)酵時，接種后加入終濃度為0.05 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）。

1.3.2.2 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵

將適量經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后的菌體細(xì)胞接種至裝有2.5 L種子培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐，流加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 6.8～7.2，溶氧維持20%～40%，通風(fēng)量2～4 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速200～800 r/min，35 ℃培養(yǎng)6 h。以10%接種量將種子培養(yǎng)物接至裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度35 ℃，通風(fēng)量2～4 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速300～900 r/min，溶氧維持在20%～50%，流加80%的葡萄糖溶液，維持殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為1～3 g/L，流加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 6.8～7.2，發(fā)酵周期52 h。利用H-10發(fā)酵時，接種后加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG。

1.3.3 檢測與分析方法

用生物傳感器分析儀測定葡萄糖含量。生物量以O(shè)D600nm計。采用高效液相色譜柱前衍生法測定L-高絲氨酸濃度。樣品用2,4-二硝基氟苯衍生，以乙腈-水混合液（1∶1，V/V）和50 mmol/L乙酸銨溶液為流動相，以1 mL/min的流速梯度混合經(jīng)過C18AAA色譜柱分離，最后在360 nm波長處進(jìn)行檢測[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 弱化蘇氨酸操縱子thrABC對L-高絲氨酸合成的影響

目前報道的常用策略是通過敲除高絲氨酸激酶編碼基因thrB阻斷L-高絲氨酸的降解，實現(xiàn)其積累。與阻斷策略不同，適度弱化降解途徑不會引起菌株營養(yǎng)缺陷，故可在不影響菌株生長的前提下實現(xiàn)代謝產(chǎn)物的積累[15,19]。在E. coli中，高絲氨酸激酶編碼基因thrB與蘇氨酸合成酶編碼基因thrC及天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶編碼基因thrA組成操縱子thrABC，而高絲氨酸激酶和蘇氨酸合成酶均參與L-高絲氨酸的降解[20-21]。為不破壞thrABC操縱子的天然結(jié)構(gòu)并實現(xiàn)thrB和thrC的弱化，擬將該操縱子的啟動子替換為不同強(qiáng)度的PBBa_J23108、PBBa_J23109和PBBa_J23114。但啟動子替換會引起L-高絲氨酸關(guān)鍵合成基因thrA的弱化，故先在出發(fā)菌株E. coliW3110 ΔlacI基因組先整合1 個拷貝強(qiáng)啟動子Ptrc調(diào)控的thrAC1034T（解除L-蘇氨酸反饋抑制）[22]。利用鑒定引物ylbe-U-F/ylbe-thrA-J進(jìn)行菌落PCR鑒定，thrAC1034T基因整合菌株基因組DNA擴(kuò)增獲得堿基約為1 013 bp的條帶（圖2），表明thrAC1034T基因整合成功，將菌株命名為H-1。在H-1的在整個發(fā)酵過程中，未檢測到L-高絲氨酸積累（圖3A），其原因可能是L-高絲氨酸被代謝為L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸等代謝物。

為弱化L-高絲氨酸降解，將H-1的PthrABC分別替換為PBBa_J23108、PBBa_J23109和PBBa_J23114。由出發(fā)菌株H-1基因組DNA應(yīng)擴(kuò)增出堿基數(shù)為1 599 bp的條帶，而啟動子替換菌株基因組DNA擴(kuò)增獲得堿基約為1 131 bp的條帶，由圖4可知，啟動子替換成功，將菌株分別命名為H-2、H-3和H-4。為考察PthrABC替換對菌株生長和L-高絲氨酸合成的影響，對其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗。在不添加L-蘇氨酸的培養(yǎng)基中H-2、H-3和H-4能夠生長，表明PthrABC替換為弱啟動子未造成其L-蘇氨酸缺陷（圖3B）；H-2無L-高絲氨酸積累，H-3和H-4可分別合成1.5 g/L和0.8 g/LL-高絲氨酸（圖3A）。PBBa_J23108、PBBa_J23114和PBBa_J23109的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度依次降低，PBBa_J23108分別是PBBa_J23114和PBBa_J23109的約5 倍和50 倍。由此推測，因PBBa_J23108轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度較高不利于L-高絲氨酸的積累；PBBa_J23114和PBBa_J23109有效降低了thrBC的轉(zhuǎn)錄，L-高絲氨酸得以積累；又因PBBa_J23109轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度低于PBBa_J23114，故H-3的L-高絲氨酸產(chǎn)量高于H-4。此外，由圖3B可知，與對照菌株H-1相比，H-3和H-4最終生物量有所降低，且H-3生物量低于H-4，與菌株L-高絲氨酸產(chǎn)量呈相反趨勢，其原因可能是thrBC轉(zhuǎn)錄的下調(diào)有效弱化了菌株生長代謝流。Li Hua等[16]敲除thrB并過表達(dá)thrA，菌株L-高絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.2 g/L，較H-3低20%，且在發(fā)酵過程需添加L-蘇氨酸。綜上，適度弱化thrBC轉(zhuǎn)錄可實現(xiàn)L-高絲氨酸的積累，且不會造成營養(yǎng)缺陷，其效果優(yōu)于敲除thrB。

圖2 菌株H-1鑒定圖譜Fig. 2 Identification of strain H-1

圖3 PthrABC替換對菌株生長和L-高絲氨酸合成的影響Fig. 3 Effect of thrABC promoter substitution on the growth of strains and L-homoserine production

圖4 菌株H-2（A）、H-3（B）和H-4（C）鑒定圖譜Fig. 4 Identification of strains H-2 (A), H-3 (B) and H-4 (C)

2.2 增強(qiáng)thrA拷貝數(shù)對L-高絲氨酸合成的影響

盡管通過弱化降解途徑實現(xiàn)了L-高絲氨酸的積累，但其產(chǎn)量較低。天冬氨酸激酶是L-高絲氨酸合成的關(guān)鍵酶[20-21]。在E. coli中共含有3 個天冬氨酸激酶I、II和III，其中thrA的天冬氨酸激酶I豐度最高，在合成L-高絲氨酸中起主要作用[22]。為進(jìn)一步提高L-高絲氨酸的合成代謝流，向H-3再整合1 拷貝的thrAC1034T（受強(qiáng)啟動子Ptrc調(diào)控）。由圖5A可知，thrAC1034T基因整合成功，將其命名為H-5。搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果表明，H-5的L-高絲氨酸產(chǎn)量為2.6 g/L，較H-3提高73.3%（圖6）。為考察進(jìn)一步過表達(dá)thrAC1034T對高絲氨酸合成的影響，向H-5再整合1 拷貝的thrAC1034T（受強(qiáng)啟動子Ptrc調(diào)控）。由圖5B可知，thrAC1034T基因整合成功，將其命名為H-6。搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果表明，H-6的L-高絲氨酸產(chǎn)量為3.4 g/L，較出發(fā)菌株提高30.7%。

圖5 菌株H-5和H-6鑒定圖譜Fig. 5 Identification of strains H-5 and H-6

圖6 菌株H-5、H-6和H-7的L-高絲氨酸產(chǎn)量和生物量Fig. 6 L-Homoserine production and biomass of strains H-5, H-6 and H-7

2.3 增加草酰乙酸合成對L-高絲氨酸合成的影響

圖7 菌株H-7鑒定圖譜Fig. 7 Identification of strain H-7

由圖6可知，在H-6的L-高絲氨酸產(chǎn)量提高程度較H-5低，推測L-高絲氨酸前體物供應(yīng)不足限制了其合成。草酰乙酸是合成包括L-高絲氨酸在內(nèi)的L-天冬氨酸族氨基酸的重要前體物[19,23-25]。為增加L-高絲氨酸合成代謝流，向H-6基因型整合1 拷貝由自身啟動子調(diào)控的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因ppc，鑒定結(jié)果如圖7所示，由出發(fā)菌株H-6基因組擴(kuò)增出堿基數(shù)為1 873 bp的條帶，由ppc基因整合菌株基因組擴(kuò)增獲得堿基約為3 000 bp的條帶，與預(yù)期一致（3 249 bp），表明菌株構(gòu)建成功，將其命名為H-7。H-7的L-高絲氨酸產(chǎn)量達(dá)5.8 g/L，比菌株H-8提升了70.5%（圖6）。上述結(jié)果表明，草酰乙酸是L-高絲氨酸的限制因素，提高其供應(yīng)有利于增強(qiáng)L-高絲氨酸的合成。

2.4 增加NADPH再生對L-高絲氨酸的影響

圖8 菌株H-8和H-9鑒定圖譜Fig. 8 Identification of strains H-8 and H-9

在L-高絲氨酸生物合成途徑中，高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸半醛脫氫酶催化的反應(yīng)需要NADPH。生成1 molL-高絲氨酸需要2 mol NADPH，由此推測NADPH供應(yīng)是L-高絲氨酸的另一限制因素。研究證明，過表達(dá)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因可有效促進(jìn)NADPH的再生并增強(qiáng)L-賴氨酸、L-纈氨酸等代謝物合成[11,26-28]。為增強(qiáng)NADPH的再生，分別將自身啟動子PpntAB和Ptrc調(diào)控的pntAB整合至H-7基因組。由菌株H-7基因組DNA應(yīng)擴(kuò)增出堿基數(shù)為1 681 bp的條帶，由pntAB整合菌株基因組DNA擴(kuò)增獲得堿基可擴(kuò)增出4 443 bp（PpntAB-pntAB）和3 994 bp（Ptrc-pntAB）的條帶。由圖8可知，pntAB基因整合成功，將菌株分別命名為H-8和H-9。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖9所示，H-8的L-高絲氨酸產(chǎn)量（7.8 g/L）略高于H-9（7.1 g/L），說明pntAB自身啟動子效果略優(yōu)于Ptrc。上述結(jié)果表明，增強(qiáng)NADPH再生可有效促進(jìn)L-高絲氨酸的合成。以往研究均聚焦于L-高絲氨酸代謝途徑的改造，鮮見增強(qiáng)還原力供應(yīng)的相關(guān)報道[4,8-9,16-17]。本研究證明了強(qiáng)化pntAB表達(dá)可顯著提高L-高絲氨酸的合成。

圖9 菌株H-8、H-9和H-10的L-高絲氨酸產(chǎn)量和生物量Fig. 9 L-Homoserine production and biomass of strains H-8,H-9 and H-10

2.5 促進(jìn)L-高絲氨酸輸出對其產(chǎn)量的影響

胞內(nèi)高濃度的L-高絲氨酸積累可抑制谷氨酸脫氫酶的活性，從而對菌體細(xì)胞生長具有毒害作用[29]。由圖7、9可知，H-8和H-9的生物量較H-7顯著降低，可能與L-高絲氨酸的毒害作用有關(guān)。L-蘇氨酸/L-高絲氨酸輸出載體具有外排L-高絲氨酸的功能，過表達(dá)其編碼基因rhtA可有效提高L-高絲氨酸的產(chǎn)量和菌體生物量[16-17,30]。為增強(qiáng)L-高絲氨酸輸出以提高其產(chǎn)量和菌株抗性，構(gòu)建了rhtA過表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a-rhtA，并將其轉(zhuǎn)化至H-8，獲得菌株H-10。如圖9所示，H-10的L-高絲氨酸產(chǎn)量達(dá)12.5 g/L，比H-8提高了60.2%；其生物量提高12.6%，表明增強(qiáng)L-高絲氨酸輸出可有效提高其產(chǎn)量并增強(qiáng)菌株對L-高絲氨酸的抗性。

2.6 發(fā)酵罐發(fā)酵實驗

為進(jìn)一步考察H-10的發(fā)酵性能，于5 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實驗。如圖10所示，菌株于8 h進(jìn)入對數(shù)生長期，32 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后生物量緩慢下降；于4 h可檢測到L-高絲氨酸的積累，12 h后合成速率逐漸提升，48 h達(dá)到最高，52.1 g/L，其轉(zhuǎn)化率為43%（以占葡萄糖質(zhì)量計）。由表3可知，本研究所構(gòu)建的H-10L-高絲氨酸合成效率高于現(xiàn)有報道且該菌株無營養(yǎng)缺陷，故無需在發(fā)酵過程中額外添加營養(yǎng)物質(zhì)，具有工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。

圖10 H-10發(fā)酵過程曲線Fig. 10 Time courses of L-homoserine production and biomass of strain H-10

表3 本研究與報道文獻(xiàn)的參數(shù)比較Table 3 Comparison of L-homoserine production performance between strain H-10 and E. coli

3 結(jié) 論

采用系統(tǒng)代謝工程策略構(gòu)建了1 株無營養(yǎng)缺陷的L-高絲氨酸高產(chǎn)菌株H-10，主要策略包括利用弱啟動子調(diào)控thrB和thrC轉(zhuǎn)錄弱化L-高絲氨酸的降解代謝流；過表達(dá)關(guān)鍵酶基因thrAfbr、ppc和pntAB，增強(qiáng)其合成代謝流、前體物草酰乙酸供應(yīng)及NADPH再生；過表達(dá)L-高絲氨酸輸出蛋白增強(qiáng)其外排。于5 L發(fā)酵罐經(jīng)發(fā)酵48 h，H-10菌株的L-高絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到52.1 g/L，高于現(xiàn)有報道且發(fā)酵過程中無需額外添加營養(yǎng)物質(zhì)，故具備工業(yè)化潛力。本研究采用的代謝途徑弱化策略可為工業(yè)微生物的代謝工程構(gòu)建提供借鑒。