王婷,劉嬋嬋,毛跟年,錢衛(wèi)東*

1(陜西科技大學 食品與生物工程學院,陜西 西安,710021)2(西安醫(yī)學高等?？茖W校,陜西 西安,710032)

富硒酵母是通過在培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉(Na2SeO3),經過生物合成轉化獲得的有機硒含量高(1 000～2 500 mg/kg)、安全無毒,生理活性好的酵母硒補充劑。富硒酵母被廣泛應用于保護心臟、治療糖尿病、抗癌、抗衰老等需要添加強化硒營養(yǎng)的功能性食品、藥品、化妝品中,發(fā)展前景十分廣闊[1-3]。

果糖是一種常見的己酮糖,具有甜度高、升糖指數低以及滲透性好等優(yōu)點[4]?？狄愕萚5]發(fā)現(xiàn)使用108 g/L果糖發(fā)酵釀酒酵母時,釀酒酵母的甘油產量最高；DANCH等[6]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加果糖可以促進釀酒酵母對無機硒的吸收,但其分子機制尚不明確。

本研究以食品級多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)為出發(fā)菌株,通過對比不同碳源發(fā)酵組的酵母細胞生物量(dry cell weight,DCW)、胞內硒代蛋氨酸(selenomethionine,Se-Met)含量,并結合轉錄組測序分析,篩選果糖發(fā)酵組與葡萄糖發(fā)酵組之間的表達差異基因(differential expression genes,DEGs),進而富集分析與果糖代謝及無機硒吸收代謝相關的基因通路基因,為進一步解析果糖對多形漢遜酵母中的糖代謝和硒代謝影響的分子機制,以及優(yōu)化酵母富硒發(fā)酵工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多形漢遜酵母(HasenulapolymorphaATCC 26012),由陜西科技大學功能微生物研究室保存。

富硒-酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基加無菌Na2SeO3母液(終濃度60 μmol/L)。

葡萄糖、D-果糖,天津科密歐公司；Na2SeO3、胰蛋白酶、硒代蛋氨酸,美國Sigma公司；TRIzol Reagent,美國Invtrogen公司；正己烷(色譜級)、乙腈(色譜級),Merck公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜系統(tǒng),美國Agilent公司；NexION 300D電感耦合等離子體質譜儀,美國Perkin-Elmer公司；ELX808多功能酶標儀,美國BioTek公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多形漢遜酵母富硒發(fā)酵培養(yǎng)

菌種以YPD培養(yǎng)基復蘇,經30 ℃、160 r/min發(fā)酵12 h,得到種子液。以10%的接種量,將種子液分別接種到葡萄糖-富硒-YPD和不同濃度的果糖-富硒-YPD(果糖含量分別為0、20、40、60、80、120、140、160、200 g/L)培養(yǎng)基中,經30 ℃,200 r/min培養(yǎng)72 h；12～24 h間隔取樣,測定酵母DCW和Se-Met含量。

1.3.2 Se-Met的提取和含量分析[7-8]

取酵母發(fā)酵液5 mL,6 000 r/min離心10 min后,加入5 mL的30 mmol/L Tris-HCl和SiO2beads,渦旋破碎,再加入胰蛋白酶,37 ℃孵育6 h,然后超聲30 min,10 000 r/min離心10 min,收集上清液用HPLC-ICP-MS方法檢測并計算酵母胞內Se-Met含量。HPLC條件：色譜柱為 SB-C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm,Agilent),流動相A(0.1%甲酸),流動相B(乙腈),流速1.0 mL/min,洗脫程序為：0% B～50% B,0～2 min;50% B～100% B,2～4 min;100% B,4～9 min;0% B,9～10 min。ICP-MS條件：載氣流速1.0 L/min,反應氣體3.5 mL/min 氫氣,冷卻氣流15.0 L/min,同位素檢測硒分子量為77、78、80和82。

1.3.3 RNA提取、測序和分析

取酵母發(fā)酵液2 mL,4 ℃、6 000 r/min離心10 min,用TRIzol試劑盒提取其總RNA,送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行cDNA文庫構建和轉錄組測序。用Trinity軟件[9]將測序獲得的轉錄組Raw序列濾過得到Clean序列,再組裝為Unigene序列；用HTSeq方法對基因的表達量進行FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)定量[10]；利用DESeq2方法[11]對比分析不同組酵母的基因表達量,以差異倍數變化超過2倍(|log2FC|>1)且錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.01為標準,篩選果糖發(fā)酵組和葡萄糖發(fā)酵組之間的顯著DEGs；再將DEGs比對到GO數據庫和KEGG數據庫,進行DEGs的GO功能和KEGG代謝通路富集[12-13],進一步注解參與果糖代謝、硒復合物合成代謝的關鍵酶基因。

2 結果與分析

2.1 果糖濃度對多形漢遜酵母生長和Se-Met產量的影響

將H.polymorpha種子液接種含不同濃度果糖的富硒培養(yǎng)基中進行發(fā)酵,結果如圖1所示：在0～100g/L內隨著果糖質量濃度增加,酵母生長和酵母細胞胞內Se-Met含量呈上升趨勢,而當果糖質量濃度>120 g/L時,可能由于滲透壓過高,對H.polymorpha生長產生抑制作用,導致其胞內Se-Met產量降低；發(fā)酵培養(yǎng)0～12 h時,各果糖濃度組的酵母DCW與Se-Met含量無顯著差異；發(fā)酵24～48 h,80和100 g/L果糖質量濃度組的酵母DCW、Se-Met產量迅速增加,發(fā)酵48 h達到最高,隨后可能由于營養(yǎng)消耗和代謝廢物積累等因素導致DCW、Se-Met增速減緩,甚至略有下降。

a-酵母DCW；b-酵母胞內Se-Met產量

2.2 果糖和葡萄糖對酵母生長和Se-Met含量的影響

分別以葡萄糖為碳源作為對照組,果糖為碳源作為試驗組,發(fā)酵培養(yǎng)48 h時,80 g/L的葡萄糖組酵母的DCW最高,為(44.13±0.38)g/L；80 g/L果糖組酵母胞內Se-Met產量和含量分別為(34.27±0.39)mg/L和(0.87±0.04)mg/g,均高于80 g/L葡萄糖組的(34.13±0.72)mg/L和(0.77±0.01)mg/g。結果表明在濃度相同條件下,葡萄糖有利于促進酵母細胞生長,而果糖有利于酵母細胞中Se-Met的合成和積累。80與100 g/L果糖組酵母的DCW、Se-Met產量和含量無明顯差異,從生產成本綜合考慮,優(yōu)選80 g/L果糖作為發(fā)酵碳源濃度。

表1 果糖和葡萄糖對多形漢遜酵母的DCW和Se-Met的影響

2.3 轉錄組測序數據質量評估

分別取80 g/L葡萄糖發(fā)酵組(Glu組)和80 g/L果糖發(fā)酵組(Fru組)發(fā)酵48 h的培養(yǎng)液,提取總RNA并進行轉錄組測序。利用Fast QC法分析測序質量,結果如表2所示,Glu組獲得44 086 312和44 232 706個Clean reads,Fru組得到42 454 102和42 354 868個Clean reads,4個樣本轉錄組的Q30(0.1%堿基識別錯誤率)最小值為95.96%,表明轉錄組測序數據質量較高。將4個樣本Clean reads與Unigene序列進行比對,結果匹配率為84.21%～85.80%,表明測序樣本未受到污染。

表2 多形漢遜酵母的轉錄組測序質量分析

2.4 果糖與葡萄糖發(fā)酵組間的DEGs

用FPKM計算各基因表達量,以|lg2FC|>1且FDR<0.01作為標準,結果Fru組與Glu組之間有221個DEGs,其中80個DEGs表達顯著上調,141個DEGs表達顯著下調(圖2),表明果糖和葡萄糖對多形漢遜酵母的基因轉錄調控存在著顯著差別。

2.5 果糖與葡萄糖發(fā)酵組間DEGs的GO富集分析

將Fru組和Glu組之間的221個DEGs進行GO數據庫比對,共計130個DEGs獲得GO功能注釋,其中21個DEGs富集在9個生物過程中；17個DEGs富集在11個細胞組分中；92個DEGs富集在10個分子功能中。其中富集最顯著的30個GO term包括了3個分子功能、7個細胞組分和20個生物過程,主要涉及蛋氨酸生物合成(2個DEGs)、同型半胱氨酸S-甲基轉移酶活性(2個DEGs)、糖酵解(3個DEGs)、戊糖磷酸支路(1個DEGs)、氧化還原反應(24個DEGs)、谷氨酸生物合成(2個DEGs)和電子傳遞鏈(2個DEGs)等(圖3-a)。

2.6 果糖與葡萄糖發(fā)酵組間DEGs的KEGG代謝通路富集分析

將Fru組和Glu組之間的221個DEGs比對到KEGG數據庫,共計108個DEGs被KEGG數據庫注釋到52條代謝途徑中,包括5條細胞過程通路、1條環(huán)境信息處理、8條遺傳信息處理和38條代謝通路。其中富集最顯著的30條通路包括4條細胞過程、5條遺傳信息和21條代謝通路,涉及過氧化物酶體(4個DEGs)、酵母減數分裂(4個DEGs)和內吞作用(2個DEGs)等與酵母細胞的抗氧化、生長繁殖、硒攝入有關通路；糖酵解/糖異生(6個DEGs)、戊糖磷酸途徑(4個DEGs)、果糖和甘露糖代謝(3個DEGs)和N-聚糖生物合成(1個DEGs)等參與調節(jié)胞內果糖的轉化和代謝的通路；半胱氨酸和蛋氨酸代謝(5個DEGs)、硒復合物代謝(2個DEGs)和谷胱甘肽代謝(1個DEGs)等參與硒代氨基酸、硒蛋白和谷胱甘肽的代謝通路(圖3-b)。

2.7 與果糖代謝和硒代謝相關的DEGs

分析Fru組和Glu組之間的DEGs圖譜,表明在Fru組中,酵母中ECU01(EC:4.1.2.13)和MPG1(EC:2.7.7.13)顯著上調,而FBP1(EC:3.1.3.11)、GAPDH1(EC:1.2.1.12)、PGK(EC:2.7.2.3)顯著下調。其中,EC:4.1.2.13催化1,6-二磷酸果糖與3-磷酸甘油醛之間的轉換頻率[14],EC:3.1.3.11催化1,6-二磷酸果糖轉化為6-磷酸果糖[15-16],EC:1.2.1.12和EC:2.7.2.3是參與催化糖酵解的關鍵酶[15,17],EC:2.7.7.13催化1-磷酸甘露糖轉化為GDP-甘露糖和甘露聚糖的合成[18]。這些酶基因表達量的改變,可能下調果糖進入糖酵解和磷酸戊糖通路的比例,促進果糖轉化甘露糖和甘露聚糖,而作為細胞壁主要組分的甘露聚糖有利于硒的吸附和吸收[18]。此外,Fru組酵母中SAM1(EC:2.5.1.6)下調,MET6(EC:2.1.1.14)上調,有利于抑制L-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸,促進上游同型半胱氨酸積累,并依次催化硒半胱氨酸轉化為硒胱硫醚、硒同型半胱氨酸,最后合成硒代蛋氨酸[19-20]；Fru組酵母中GLT1(EC:1.4.1.13、EC:1.4.1.14)表達下調,GND1(EC:1.1.1.44)上調,有助于抑制胞內谷胱甘肽酶解為谷氨酸、甘氨酸和乙酰CoA,促進谷胱甘肽在細胞內積累；并維持谷胱甘肽的還原態(tài)[21-22],提高細胞的抗氧化能力(表3)。

表3 與果糖代謝和硒代謝相關的差異表達基因

3 結論與討論

硒是維持人體正常生命活動的必需元素,是人和動物體內谷胱甘肽過氧化物酶活性中心的必需基團,具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等多種生物功能。通過微生物富集硒元素的富硒酵母不僅活性硒含量高,而且富含谷胱甘肽、蛋白質和維生素,是一種很好的硒補充劑[1-3,23]。

本文考察了多形漢遜酵母在含有不同濃度果糖和葡萄糖的富硒培養(yǎng)基中的生長和Se-Met產量變化,發(fā)現(xiàn)與相同濃度葡萄糖發(fā)酵組相比,80 g/L果糖組酵母細胞產量略低,但其胞內Se-Met含量較高,表明葡萄糖有利于多形漢遜酵母的生長,而果糖有利于硒的吸收和Se-Met等硒復合物的合成和積累[24]。MARINESCU等[25]用果葡糖漿[m(果糖)∶m(葡萄糖)=55∶45]作為碳源,并添加30～180 mg/L Na2SeO3進行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)有機硒含量達到625.81～2 215.67 mg/g,提示可以通過優(yōu)化碳源中果糖與葡萄糖比例和含量,進一步提高酵母有機硒的轉化率。

本研究采用Illumina HiSeq 2000平臺對果糖發(fā)酵組與葡萄糖發(fā)酵組之間的轉錄組數據進行對比分析,篩選出221個DEGs,進一步KEGG富集分析表明這些DEGs主要在糖酵解、果糖和甘露糖代謝、谷氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、硒復合物代謝和谷胱甘肽代謝、氧化還原通路中顯著富集。其中MPG1(EC:2.7.7.13)、同型MET6(EC:2.1.1.14)和GND1(EC:1.1.1.44)在果糖發(fā)酵組中顯著上調,為催化合成細胞壁甘露聚糖,促進硒的吸附和吸收[18],催化硒半胱氨酸轉化合成硒代蛋氨酸和維持為谷胱甘肽的還原態(tài)[21],提高細胞的抗氧化能力提供酶促動力。

本研究部分解析了果糖對多形漢遜酵母菌硒代謝及其轉錄調控機制的影響,為進一步優(yōu)化酵母富硒發(fā)酵工藝和分子育種提供一定的參考數據。