聶淞瑩，唐海明，汪鋆植*，王丹陽(yáng)，顏華玲，胡浩寧，黃永梅（. 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌 443000；. 湖北恒安芙林藥業(yè)股份有限公司，湖北 宜昌 44303）

木瓜又名“皺皮木瓜”“鐵腳梨”，為薔薇科植物貼梗海棠[

Chaenomeles speciosa

（Sweet）Nakai]的干燥近成熟的果實(shí)，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的作用，主要化學(xué)成分為三萜類、苯丙素類、黃酮類、有機(jī)酸類等。其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、增強(qiáng)免疫、保肝、抗胃潰瘍與腸損傷、抗腫瘤等藥理活性。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是基于中醫(yī)理論和臨床用藥，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑。由于中藥材成分復(fù)雜，且受產(chǎn)地、區(qū)域、氣候、環(huán)境、加工方式的影響，傳統(tǒng)湯劑制備工藝很難保證臨床療效的一致性和制備工藝的合理性。因此，本文采用多指標(biāo)層次分析法（AHP）計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重，并結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝參數(shù)，旨在為木瓜標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000型高效液相色譜系統(tǒng)（包括高壓輸液系統(tǒng)、二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，賽默飛科技有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TD24K離心機(jī)（湖北湘儀儀器公司），PB-10型pH計(jì)（德國(guó)賽多利斯公司）；XSE205DU型十萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），ME204T/02型萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），DTC-27型數(shù)控超聲波清洗器（湖北鼎泰高科有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸（批號(hào)：110753-202018，含量：96.1%）、原兒茶酸（批號(hào)：110809-201906，含量：97.7%）、

L

-蘋果酸（批號(hào)：190014-201302，含量：100%）（對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；莽草酸（批號(hào)：C11015240）、奎尼酸（批號(hào)：C11520221）（對(duì)照品，含量≥98%，上海麥克林生化科技有限公司）；木瓜藥材購(gòu)自湖北宜昌市長(zhǎng)陽(yáng)土家族自治縣，經(jīng)三峽大學(xué)王玉兵教授鑒定為貼梗海棠的干燥近成熟果實(shí)，符合2020年版《中國(guó)藥典》一部要求。乙腈為色譜純（湖北弗頓生化科技有限公司）；乙醇為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水（經(jīng)Milli-Q Reference系統(tǒng)凈化），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 各成分含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 采用Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相乙腈（A）-0.01%磷酸水（B），梯度洗脫（0～8 min，1%A；8～15 min，1%～8%A；15～25 min，8%～10%A；25～35 min，10%～15%A；35～40 min，15%A；40～45 min，15%～1%A；45～55 min，1%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)0～8 min：212 nm；9～55 min：280 nm；流速0.8 mL·min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液（A）及木瓜提取樣品溶液（B）的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference substance（A）and extracted C. speciosa sample（B）

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取各對(duì)照品適量，用流動(dòng)相B溶解，制成質(zhì)量濃度分別為綠原酸99.5 μg·mL、原兒茶酸18.5 μg·mL、

L

-蘋果酸 1940.0 μg·mL、莽草酸536 .0 μg·mL、莽草酸4176.0 μg·mL的儲(chǔ)備液，各精密吸取適量，用流動(dòng)相B稀釋，即得各質(zhì)量濃度分別為40.3、9.3、194.0、106.2、208.8 μg·mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取木瓜水煎液10 mL，置于50 mL量瓶中，無(wú)水乙醇定容至刻度，醇沉2 h，4000 r·min離心5 min，精密吸取上清液5 mL，蒸干，殘?jiān)尤肓鲃?dòng)相B溶液溶解，定容至10 mL，搖勻，即得，置于4℃冰箱中保存。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，流動(dòng)相B溶液配制成6種系列質(zhì)量濃度的溶液，各進(jìn)樣10 μL測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（

X

），峰面積為縱坐標(biāo)（

Y

）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分線性關(guān)系
Tab 1 Linearity of various constituents

成分 回歸方程 r 線性范圍/（μg·mL －1）綠原酸 Y＝0.3288x－0.3177 0.9998 9.9～99.5原兒茶酸 Y＝0.3303x－0.0105 0.9999 0.925～18.5 L-蘋果酸 Y＝0.0082x－0.0381 0.9996 97～1940莽草酸 Y＝0.4993x＋0.3606 0.9999 26.8～536奎尼酸 Y＝0.0053x－0.1515 0.9997 208.8～4176

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得綠原酸、原兒茶酸、

L

-蘋果酸、奎尼酸、莽草酸峰面積的

RSD

分別為0.71%、1.4%、1.2%、0.16%、1.6%，表明儀器精密度良好。2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一制備工藝下的標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得綠原酸、原兒茶酸、

L

-蘋果酸、奎尼酸、莽草酸峰面積的

RSD

分別為0.94%、1.6%、1.9%、0.62%、1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得綠原酸、原兒茶酸、

L

-蘋果酸、奎尼酸、莽草酸峰面積

RSD

分別為1.2%、0.95%、0.78%、1.4%、1.3%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5 mL，共6份，精密加入對(duì)照品溶液適量，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果綠原酸、原兒茶酸、

L

-蘋果酸、奎尼酸、莽草酸平均加樣回收率分別為96.9%、98.2%、98.6%、99.5%、99.5%，

RSD

分別為2.5%、1.8%、1.9%、0.86%、1.6%。

2.2 單因素試驗(yàn)

精密稱取木瓜飲片100 g，加入水浸泡45 min，考察加水量（6、7、8、9、10倍）、煎煮時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、煎煮次數(shù)（1、2、3次）、濃縮溫度（50、60、70、80℃）等因素，以綠原酸、原兒茶酸、

L

-蘋果酸、奎尼酸、莽草酸含量以及出膏率為指標(biāo)，通過(guò)單因素控制變量法，繪制含量動(dòng)態(tài)分布趨勢(shì)圖和出膏率動(dòng)態(tài)圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，考慮實(shí)際操作，選擇加水量8倍、煎煮30 min、煎煮2次作為響應(yīng)面法的考察水平。

圖2 各成分含量及出膏率動(dòng)態(tài)分布趨勢(shì)Fig 2 Dynamic distribution trends for various constituents content and dry extract rate

2.3 層次分析法計(jì)算權(quán)重

經(jīng)測(cè)定，木瓜水煎液中主要含有綠原酸、原兒茶酸、莽草酸、

L

-蘋果酸、奎尼酸等有機(jī)酸。根據(jù)木瓜標(biāo)準(zhǔn)湯劑藥理、藥效作用強(qiáng)弱、各成分含量并結(jié)合文獻(xiàn)將權(quán)重指標(biāo)予以量化。即將6個(gè)指標(biāo)分為4個(gè)層次，并確定指標(biāo)的優(yōu)先順序：出膏率＞綠原酸＞原兒茶酸＞

L

-蘋果酸＝奎尼酸＝莽草酸，據(jù)此進(jìn)行成對(duì)比較，構(gòu)建優(yōu)先判斷矩陣，得到相對(duì)評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表2，發(fā)現(xiàn)

CR

＜0.1，表明矩陣符合一致性檢驗(yàn)，權(quán)重系數(shù)合理有效。綜合評(píng)分

Y

＝0.2519×綠原酸含量＋0.1243×原兒茶酸含量＋0.0519×奎尼酸含量＋0.0519×莽草酸含量＋0.0519×

L

-蘋果酸含量＋0.4682×出膏率。

表2 各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)
Tab 2 Weight coefficients for various indicators

指標(biāo) 綠原酸原兒茶酸L-蘋果酸奎尼酸莽草酸出膏率權(quán)重系數(shù) CR綠原酸 1 3 5 5 5 1/3 0.2519 0.0218原兒茶酸 1/3 1 3 3 3 1/5 0.1243蘋果酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519奎尼酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519莽草酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519出膏率 3 5 7 7 7 1 0.4682

2.4 響應(yīng)面法

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素影響試驗(yàn)結(jié)果，以加水量（A）、煎煮時(shí)間（B，第二、三煎加水量為第一次加水量－1倍）、煎煮次數(shù)（C，第二、三煎煎煮時(shí)間為第一次煎煮時(shí)間－10 min）為考察因素。設(shè)計(jì)因素與水平表（見(jiàn)表3）。以綠原酸、原兒茶酸、蘋果酸、奎尼酸、莽草酸含量以及出膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平表
Tab 3 Factor and level of Box-Behnken design

水平 因素A. 加水量/倍 B. 煎煮時(shí)間/min C. 煎煮次數(shù)/次－1 7 20 1 0 8 30 2 1 9 40 3

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果
Tab 4 Design and results of response surface method

序號(hào) 加水量/倍 煎煮時(shí)間/min 煎煮次數(shù)/次 綠原酸/% 原兒茶酸/% 蘋果酸/% 奎尼酸/% 莽草酸/% 出膏率/% 綜合評(píng)分1 9 20 2 0.262 0.0389 7.09 9.83 1.19 42.22 0.2078 2 8 30 2 0.188 0.0396 7.02 10.64 1.24 40.26 0.1988 3 8 30 2 0.243 0.0445 6.77 10.58 1.20 39.18 0.1937 4 7 40 2 0.192 0.0457 7.23 10.81 1.23 37.12 0.1843 5 8 30 2 0.301 0.0428 6.49 11.10 1.24 38.48 0.1907 6 8 30 2 0.285 0.0400 7.25 11.04 1.30 38.66 0.1919 7 9 40 2 0.289 0.0371 7.84 9.18 1.11 44.35 0.2178 8 8 40 1 0.203 0.0377 9.00 10.79 1.32 27.75 0.1414 9 8 30 2 0.297 0.0381 7.50 10.25 1.27 39.18 0.1941 10 7 30 3 0.276 0.0401 6.53 10.45 1.24 43.46 0.2137 11 9 30 3 0.246 0.0451 5.72 10.57 1.20 46.48 0.2274 12 9 30 1 0.305 0.0419 8.14 12.22 1.43 28.58 0.1459 13 7 30 1 0.344 0.0406 7.53 10.66 1.22 24.55 0.1259 14 8 20 1 0.241 0.0364 8.55 10.90 1.36 28.72 0.1459 15 7 20 2 0.284 0.0412 7.20 10.79 1.25 36.18 0.1801 16 8 40 3 0.352 0.0441 7.37 9.78 1.18 48.98 0.2398 17 8 20 3 0.237 0.0390 7.72 9.71 1.21 44.11 0.2168

采用Design-Expert 10.0 軟件進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)擬合，得到方程為

Z

＝0.19＋0.012

A

＋4.087×10

B

＋0.042

C

＋1.45×10

AB

－1.575×10

AC

＋6.875×10

BC

－2.045×10

A

＋5.705×10

B

－0.014

C

（

R

＝0.9920），方差分析見(jiàn)表5，可知各因素影響程度依次為C＞A＞B；模型

P

＜0.0001，表明其達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著

P

＝0.1356＞0.05，說(shuō)明模型合適。各因素之間兩兩交互作用對(duì)木瓜標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝的影響見(jiàn)圖3。可知最優(yōu)工藝為加8.173倍水煎煮39.919 min，煎煮2.997次，結(jié)合實(shí)際操作，將其修正為加8倍水煎煮40 min，煎煮3次。

圖3 各因素交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig 3 Response surface and contour plots for interaction between factors

表5 響應(yīng)面回歸模型的方差分析
Tab 5 Variance analysis for the regression model

方差來(lái)源 平方和 自由度 均方差 F檢驗(yàn) P值模型 0.017 9 1.856×10－3 96.13 ＜0.0001 A 1.126×10－3 1 1.126×10－3 58.31 0.0001 B 1.337×10－4 1 1.337×10－4 6.92 0.0332 C 0.014 1 0.014 742.25 ＜0.0001 AB 8.410×10－6 1 8.410×10－6 0.44 0.5284 AC 9.922×10－6 1 9.922×10－6 0.51 0.4815 BC 1.891×10－4 1 1.891×10－4 9.79 0.0163 A2 1.761×10－5 1 1.761×10－5 0.91 0.3529 B2 1.370×10－4 1 1.370×10－4 7.10 0.0301 C2 7.753×10－4 1 7.753×10－4 40.16 0.0004殘差 1.352×10－4 7 1.931×10－5 － －失擬項(xiàng) 9.684×10－5 3 3.228×10－5 3.37 0.1356純誤差 3.831×10－5 4 9.578×10－6 － －總誤差 0.017 16 － － －

根據(jù)優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示3份木瓜飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的綜合評(píng)分分別為0.230、0.224、0.230，平均值為0.228，

RSD

為1.7%。與預(yù)測(cè)值0.240較為接近，說(shuō)明該工藝合理可行。取木瓜飲片適量，按照一般飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝（一煎7倍量水30 min，二煎6倍量水20 min，濃縮至5倍飲片質(zhì)量）進(jìn)行煎煮，平行3次，測(cè)得6種指標(biāo)平均值分別為0.192%、0.0457%、7.23%、9.21%、1.18%、36.15%，綜 合 評(píng) 分 為0.179。優(yōu)化后的木瓜標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝綜合評(píng)分優(yōu)于一般制備工藝。

3 討論

3.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定

指標(biāo)成分含量、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率和出膏率是評(píng)價(jià)木瓜標(biāo)準(zhǔn)湯劑的重要參數(shù)。在指標(biāo)成分含量方面，2020年版《中國(guó)藥典》是以齊墩果酸和熊果酸為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，但該類成分在提取過(guò)程中轉(zhuǎn)移率較低，且在水煎液中基本不能溶出，故不太適合作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指標(biāo)。本研究經(jīng)前期HPLC色譜定性分析，檢測(cè)到木瓜水煎液中主要包含水溶性有機(jī)酸，如綠原酸、原兒茶酸、

L

-蘋果酸、莽草酸、奎尼酸等。大量研究表明該類成分具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、保肝、抗病毒等作用。因此，本研究采用層次分析法對(duì)5種有機(jī)酸含量和出膏率得到的權(quán)重系數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)分。

3.2 有機(jī)酸穩(wěn)定性探討

在單因素試驗(yàn)中，

L

-蘋果酸、莽草酸、奎尼酸含量隨煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先增加后降低的變化，其原因是該類成分在20 min內(nèi)逐漸被提取，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪族有機(jī)酸受熱不穩(wěn)定，其含量下降。綠原酸在40 min時(shí)含量下降，該成分為咖啡酸奎尼酸內(nèi)酯，在pH 2.0～3.0或3.0～8.0時(shí)，能被酸或堿催化發(fā)生水解。木瓜標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH值介于2.9～3.6，綠原酸在此條件下易水解。且綠原酸含量與受熱溫度和時(shí)間有關(guān)，受熱溫度越高，受熱時(shí)間越長(zhǎng)，綠原酸越易分解。但在本研究中發(fā)現(xiàn)，在減壓濃縮木瓜標(biāo)準(zhǔn)湯劑時(shí)，隨溫度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，綠原酸損失率較少，并且在湯劑濃縮時(shí)，保持了濃縮的真空狀態(tài)，猜測(cè)綠原酸含量可能與空氣接觸有關(guān)。后期在制備木瓜標(biāo)準(zhǔn)湯劑的同時(shí)，應(yīng)盡量避免與空氣的接觸，可采用減壓濃縮、抽真空的制備工藝。

3.3 中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑探討

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑一直以來(lái)備受關(guān)注，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的“標(biāo)準(zhǔn)”主要包括中藥材的來(lái)源、提取加工的統(tǒng)一性以及質(zhì)量控制的嚴(yán)謹(jǐn)性，在不同來(lái)源、產(chǎn)地和提取加工方式下，其水煎液質(zhì)量也不盡相同。因此，規(guī)范中藥飲片的制備工藝成為中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的重點(diǎn)。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特性，水溶性成分并不能完全表征中藥的特性。中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是嚴(yán)格以水作為提取溶劑，不能以有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，這就限制了脂溶性成分在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的溶出。而目前研究的中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑不光是單一的中藥飲片，還延伸出了各種中藥炮制品的標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中藥煮散以及復(fù)方標(biāo)準(zhǔn)湯劑，后續(xù)關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研制是否會(huì)以醇提和水提混合制備的方式還不得而知。隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步，標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝也在不斷完善，不僅能為其配方顆粒提供標(biāo)準(zhǔn)化的制備方案，還能為其臨床應(yīng)用和相關(guān)新劑型提供理論基礎(chǔ)。