梁 敏，蘆殿榮*，何理玉，馮 利

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京 100021）

骨骼是腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞主要的目標(biāo)器官之一[1]，轉(zhuǎn)移率僅次于肺和肝[2]。乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、肝癌等是常見(jiàn)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤[3]。疼痛是骨轉(zhuǎn)移癌較早出現(xiàn)的臨床癥狀，給患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響。多數(shù)患者最初經(jīng)歷間歇性的鈍痛，但隨著病情的進(jìn)展，疼痛逐步轉(zhuǎn)化為持續(xù)性的鈍痛或刀割樣痛，活動(dòng)時(shí)加劇[4]。75%的病人忍受著由癌癥引起的致殘性骨痛，開(kāi)發(fā)新的藥物及尋找更好的治療方法是目前研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)[5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益腎骨康方在治療癌性軀體痛方面具有更好的止痛效果，改善患者生活質(zhì)量，不良反應(yīng)更低[6-9]。本研究通過(guò)建立大鼠骨轉(zhuǎn)移癌痛模型，觀(guān)察益腎骨康方（專(zhuān)利號(hào)：ZL2013 1 0582907.9，專(zhuān)利權(quán)人：馮利）及其拆方對(duì)模型大鼠骨質(zhì)破壞的影響，評(píng)價(jià)益腎骨康方治療骨轉(zhuǎn)移癌痛的止痛以及骨保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 48 只SPF 級(jí)雌性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20 ）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于中央民族大學(xué)中藥學(xué)院動(dòng)物研究中心，符合動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定。大鼠飼養(yǎng)溫度（25±0.5）℃，自由飲食、飲水，于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠乳腺癌MRMT-1 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司，于液氮中保存。

1.2 藥物 益腎骨康方中藥購(gòu)自中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院門(mén)診中藥房，原方劑量120 g，大鼠和人的等效劑量按7 倍換算，成人的體質(zhì)量設(shè)為60 kg。益腎骨康方高劑量組是成人常規(guī)劑量的2 倍，低劑量組為成人常規(guī)劑量的1/2 倍，再分別折算成大鼠的等效劑量。解毒化瘀組、扶正組分別為益腎骨康方原方根據(jù)方意拆方而來(lái)。中藥提前浸泡30 min，放入鍋中煎煮約1 h，濃縮，得到4 組中藥生藥終濃度。分別是益腎骨康方高劑量組：2.80 g/mL；益腎骨康方低劑量組：0.70 g/mL；解毒化瘀組：0.58 g/mL；扶正組：0.82 g/mL。

1.3 主要試劑與儀器 DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：C11995500BT）、胰酶溶液（批號(hào)：T1300）、胎牛血清（批號(hào)：11011-8611）、青霉素/鏈霉素混合液（批號(hào)：P1400），均購(gòu)自北京索寶萊科技有限公司；Forma 370型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo 公司；Motic AE2000 型倒置光學(xué)顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；BME404型電子式機(jī)械測(cè)痛儀，天津伯爾尼科技有限公司。

1.4 骨轉(zhuǎn)移癌大鼠模型建立 取雌性SD 大鼠，體質(zhì)量為（200 ±20 ）g，用0.3%戊巴比妥鈉，1 mL/100 g，腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉成功后，固定于鼠板，右側(cè)后肢剃毛，碘伏消毒，于脛骨內(nèi)側(cè)面脛骨平臺(tái)下切開(kāi)長(zhǎng)度約1 cm 的切口，鈍性分離肌肉，暴露骨面，用22 G 針頭在脛骨平臺(tái)下約0.5～1 cm 處鉆孔，先垂直于骨面鉆，然后再傾斜45°鉆孔，待鉆孔成功后，用10 uL 微量注射器抽取10 uL 大鼠乳腺癌MRMT-1 細(xì)胞懸液（1×107/mL）注入骨髓腔（對(duì)照組注射等量生理鹽水），針頭停留2 min，拔出后，迅速用骨蠟封孔。生理鹽水沖洗溢出的腫瘤細(xì)胞，縫合，碘伏消毒，用紅霉素軟膏涂于創(chuàng)面。

1.5 分組與給藥 將48 只大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為益腎骨康方高劑量組、益腎骨康方低劑量組、扶正組、解毒化瘀組、對(duì)照組、模型組，每組8 只。除對(duì)照組外其余各組建立大鼠骨轉(zhuǎn)移癌痛模型，于造模后第2天開(kāi)始給藥，各中藥組大鼠給予對(duì)應(yīng)的中藥湯藥，對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，均按1 mL/100 g進(jìn)行灌胃，每日1 次，連續(xù)2 周。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，以 α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 大鼠骨癌痛模型行為學(xué)觀(guān)察

2.1 一般狀態(tài) 造模后每日觀(guān)察大鼠飲食、飲水、精神狀態(tài)、創(chuàng)面愈合情況。于造模前、造模后第3、7、14 天測(cè)量體質(zhì)量。

2.2 腫瘤體積 建模第15 天，引頸處死大鼠，剪下右后肢，并將后肢皮膚和肌肉組織剝離，暴露出帶有轉(zhuǎn)移腫瘤的脛骨，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑。腫瘤體積=（腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2）/ 2。

2.3 病理學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 取材 建模第15 天，每組隨機(jī)抽取3 只大鼠取右側(cè)脛骨，將脛骨放于4%多聚甲醛中常溫固定。使用EDTA 脫鈣45 d，每3 日換1 次，EDTA 濃度為10%，pH 7.0～7.4，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片。

2.3.2 HE 染色 80°烤片1 h 后，將切片置于二甲苯中脫蠟3 次，每次10 min；分別于100%、95%乙醇中梯度脫水5 min，各2 次；流水沖洗2 min 后蘇木素染色5 min；依次進(jìn)行1%鹽酸酒精溶液分化5～10s；自來(lái)水返藍(lán)25 min；0.5%伊紅染色2 min；95%、100%乙醇中梯度脫水5 min，各2 次；二甲苯中透明2 次，每次5 min，染色結(jié)束后委托北大三院病理科進(jìn)行鏡下觀(guān)察。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較 對(duì)照組體質(zhì)量從建模前到建模后第 14 天呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)；各建模組大鼠從建模后第7 天開(kāi)始，體質(zhì)量持續(xù)降低；與對(duì)照組比較，建模后第 7 天、第 14 天，各建模組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）；建模后第14 天，扶正組（P=0.03）、低劑量組（P=0.023）體質(zhì)量高于模型組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，解毒化瘀組、高劑量組體質(zhì)量均高于模型組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較（，n =8）g

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較（，n =8）g

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

3.2 腫瘤體積 由于對(duì)照組沒(méi)有接種腫瘤細(xì)胞，所以腫瘤體積為（0.00±0.00），與模型組及各給藥組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說(shuō)明腫瘤接種成功。與模型組比較，各給藥組平均腫瘤體積有減小趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與個(gè)體差異較大有關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腫瘤體積比較（，n =8）

表2 各組大鼠腫瘤體積比較（，n =8）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05

3.3 病理學(xué)評(píng)價(jià) 對(duì)照組骨髓腔內(nèi)未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，骨皮質(zhì)發(fā)育良好，骨皮質(zhì)厚薄程度基本均一，骨小梁排列緊密。模型組骨組織被嚴(yán)重破壞，腫瘤細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)骨髓腔，腫瘤細(xì)胞占骨組織的百分比約50%～60%，可見(jiàn)大片腫瘤性壞死，并向骨外侵襲，骨小梁受損及其明顯，骨皮質(zhì)破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)骨皮質(zhì)變薄。解毒組及扶正組骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)少量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，骨小梁輕微破壞或完整，骨皮質(zhì)約0.5～0.6 μm，受損程度較模型組減輕。低劑量組及高劑量組骨皮質(zhì)較完整，骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞灶狀浸潤(rùn)，骨小梁受損較輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠脛骨圖片（HE 染色，×20）

4 討論

臨床上骨轉(zhuǎn)移癌常以自發(fā)性骨痛和局部壓痛為首發(fā)癥狀，骨轉(zhuǎn)移引起的疼痛是骨轉(zhuǎn)移癌癥患者較早出現(xiàn)、常見(jiàn)、難忍受的癥狀之一，常伴隨功能障礙、病理性骨折等骨相關(guān)事件。目前臨床上對(duì)于骨癌痛的治療策略主要集中在放射治療和阿片類(lèi)藥物，但阿片類(lèi)藥物會(huì)引起一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)，往往對(duì)治療效果和患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，臨床仍需要積極尋找可持續(xù)替代的新藥[10]。近年來(lái)，中醫(yī)藥豐富的治療手段如湯劑內(nèi)服、中藥外敷、針灸、穴位注射等治療取得了良好的臨床療效，起效快，且不良反應(yīng)小，易被患者接受，在治療癌性軀體痛方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[11-13]。

骨轉(zhuǎn)移屬中醫(yī)學(xué)“骨瘤”“骨蝕”“骨瘺瘡”“壞死”“骨痹”等范疇。明代《醫(yī)學(xué)入門(mén)》云：“腎主骨，勞傷骨水，不能榮骨而為腫曰骨瘤?！鼻宕锻饪谱C治書(shū)》曰：“有骨瘤，骨生，甚痛?！敝嗅t(yī)理論研究疼痛有虛實(shí)兩個(gè)方面，即“不通則痛”和“不榮則痛”，前者多因?qū)嵭圆±懋a(chǎn)物所致，后者多見(jiàn)于虛證。清代名醫(yī)吳謙在《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣·癭瘤》曰：“骨瘤尤宜補(bǔ)腎散堅(jiān)，行瘀利竅”。骨轉(zhuǎn)移癌疼痛的病機(jī)為腎陰不足，不能養(yǎng)髓生骨，脾氣不足，氣血不能濡養(yǎng)筋脈導(dǎo)致“不榮則痛”，加之氣滯、血瘀、痰凝、熱毒、寒凝等阻礙氣血運(yùn)行形成“不通則痛”。益腎骨康方具 有補(bǔ)腎健脾，解毒化瘀，滲濕消腫，抗癌止痛的功效，適用于骨轉(zhuǎn)移癌痛患者。

惡病質(zhì)常見(jiàn)的病因是惡性腫瘤，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，患者表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦，體質(zhì)量比原始體質(zhì)量（診斷時(shí)）下降≥7.5%，或體質(zhì)量指數(shù)＜80%，體質(zhì)量是評(píng)價(jià)放化療臨床獲益的重要指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠體質(zhì)量從建模前到建模后第 14 天呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，而各建模組大鼠從建模后第7 天開(kāi)始體質(zhì)量持續(xù)降低，建模后第14 天，扶正組、低劑量組體質(zhì)量下降不明顯，扶正組拆方和低劑量組可緩解大鼠體質(zhì)量進(jìn)行性的下降。與模型組相比，各給藥組平均腫瘤體積有減小趨勢(shì)，說(shuō)明各給藥 組在一定程度上可抑制腫瘤的進(jìn)展，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與個(gè)體差異較大有關(guān)。

惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，預(yù)防和減少骨質(zhì)破壞是其關(guān)鍵治療手段。本研究中從大鼠脛骨病理組織學(xué)上可以看出，模型組骨組織被嚴(yán)重破壞，腫瘤細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)骨髓腔，并向骨外侵襲，骨小梁受損明顯，骨皮質(zhì)破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)骨皮質(zhì)變薄。解毒組及扶正組骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)少量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，骨小梁輕微破壞或完整，骨皮質(zhì)受損程度較模型組減輕。低劑量組及高劑量組骨皮質(zhì)較完整，骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞灶狀浸潤(rùn)，骨小梁受損較輕，其中解毒化瘀組和扶正組效果較明顯，說(shuō)明解毒化瘀類(lèi)中藥和扶正類(lèi)中藥聯(lián)合運(yùn)用能夠協(xié)同發(fā)揮止痛和骨保護(hù)的作用。