霍照美 楊英 楊龍△ 何炯紅 夏桂玲 郭楚嫻

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽 550002)

心肌異常肥大導(dǎo)致的心室重構(gòu)是慢性充血性心力衰竭(CHF)發(fā)生、發(fā)展最主要的病理生理機(jī)制[1]。惡性室性心律失常導(dǎo)致的心臟性猝死是CHF患者主要的死亡原因[2]。心室肌細(xì)胞離子通道重構(gòu)是導(dǎo)致細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程改變，進(jìn)而引發(fā)惡性室性心律失常的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)[3]。調(diào)控心肌肥大的信號(hào)因子眾多，半胱氨酸豐富跨膜成骨蛋白調(diào)控因子(Crim1)作為血管緊張素受體1型(AT1R)下游信號(hào)通路參與大鼠心室肌細(xì)胞肥大的負(fù)性調(diào)控[4]。并且，Crim1過表達(dá)能夠抑制致肥大因子誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞膜瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)的改變[5]。但是，目前關(guān)于AT1-Crim1信號(hào)通路參與肥大心室肌細(xì)胞離子通道重構(gòu)的報(bào)道極少。內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)參與動(dòng)作電位復(fù)極后期進(jìn)程，對(duì)穩(wěn)定心肌細(xì)胞靜息電位、保障心臟復(fù)極儲(chǔ)備具有重要作用。編碼Ik1離子通道α亞基的Kir2.1基因突變可導(dǎo)致長(zhǎng)、短QT綜合征[6]。本研究旨在探討AT1-Crim1信號(hào)通路在肥大心室肌細(xì)胞Kir2.1 mRNA和蛋白表達(dá)中的作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和氯沙坦(Los)購(gòu)自Sigma公司。胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、高糖DMEM培養(yǎng)基、特優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)均為Gibco公司產(chǎn)品。兔抗鼠Crim1抗體購(gòu)于北京博奧森公司。兔抗鼠Kir2.1抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司。山羊抗兔FITC-IgG抗體、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。攜帶Crim1基因的重組腺病毒(Ad-Crim1)、腺病毒空載體(Ad-null)購(gòu)自上海ThermoFisher SCIENTIFIC公司。TransStart?Top Green qPCR SuperMix、TransStart? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其余試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。PCR儀(MJ Research)；熒光顯微鏡(Leica公司)；Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀、Bio-Rad 550酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠1 d齡乳鼠40只，雌雄不限，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證書編號(hào)15276。 本研究通過貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，倫理審查批件編號(hào)(2020)076號(hào)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1乳鼠心室肌細(xì)胞分離與培養(yǎng) 分離乳鼠左心室，保留室間隔，酶解法分離細(xì)胞，差速貼壁結(jié)合BrdU抑制成纖維細(xì)胞而獲得純化心室肌細(xì)胞[5]。

1.3.2細(xì)胞干預(yù)分組 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，更換無血清DMEM培養(yǎng)基，分組干預(yù)。干預(yù)試劑包括：腺病毒空載體(Ad-Null)，Crim1基因重組腺病毒載體(Ad-Crim1)，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ，終濃度0.1 μM)，氯沙坦(Los，終濃度10 μM)。對(duì)照組：加入MOI=50對(duì)應(yīng)量的腺病毒空載體，感染6 h后換成2倍體積新鮮無血清無雙抗DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。AngⅡ組：加入MOI=50對(duì)應(yīng)量的腺病毒空載體，感染6 h后換成2倍體積新鮮無血清無雙抗DMEM，感染24 h后加AngⅡ，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。Los+AngⅡ組：加入MOI=50對(duì)應(yīng)量的腺病毒空載體，感染6 h后換成2倍體積新鮮無血清無雙抗DMEM，感染24 h后加AngⅡ、Los，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。Crim1組：加入MOI=50對(duì)應(yīng)量的Ad-Crim1，感染6 h后換成2倍體積新鮮無血清無雙抗DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。Crim1+AngⅡ組：加入MOI=50對(duì)應(yīng)的Ad-Crim1，感染6 h后換成2倍體積新鮮無血清無雙抗DMEM，轉(zhuǎn)染24 h后加AngⅡ，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。Crim1+Los+AngⅡ組：加入MOI=50對(duì)應(yīng)的Ad-Criml，感染6 h后換成2倍體積新鮮無血清無雙抗DMEM，轉(zhuǎn)染24 h后加AngⅡ、Los，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.3.3肥大刺激有效性鑒定 RT-qPCR測(cè)定心室肌細(xì)胞β-MHC的mRNA表達(dá)。結(jié)晶紫染色細(xì)胞，拍照，軟件測(cè)量細(xì)胞面積大小。

1.3.4RT-qPCR檢測(cè)mRNA水平 Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，按TransStart?Top Green qPCR SuperMix、TransScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix的說明書步驟檢測(cè)并計(jì)算各基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因的引物序列

1.3.5Western蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè) 提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。取40 μg總蛋白上樣，電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。加兔抗大鼠GAPDH抗體(1：1 000)，兔抗大鼠Kir2.1抗體(1：1 000)或兔抗大鼠Crim1抗體(1：1 000)，4 ℃孵育過夜。充分漂洗后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h。充分漂洗后顯影、攝片并進(jìn)行條帶灰度定量測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1各組乳鼠心室肌細(xì)胞β-MHC mRNA表達(dá)水平和細(xì)胞面積比較 各組間β-MHC mRNA表達(dá)水平總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.229，P<0.001)；AngⅡ組和Crim1組β-MHC mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P均<0.001)；Los+AngⅡ組(P=0.008)、Crim1+AngⅡ組(P<0.001)和Crim1+Los+AngⅡ組(P<0.001)β-MHC mRNA表達(dá)值皆較AngⅡ組明顯下降；Crim1+Los+AngⅡ組β-MHC mRNA表達(dá)值較Los+AngⅡ組明顯下降(P<0.001)。各組心室肌細(xì)胞表面積總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.730，P<0.001)；AngⅡ組細(xì)胞表面積較對(duì)照組明顯增大(P<0.001)；Los+AngⅡ組、Crim1+AngⅡ組和Crim1+Los+AngⅡ組細(xì)胞表面積皆較AngⅡ組明顯減小(P均<0.001)；Crim1+Los+AngⅡ組細(xì)胞表面積較Los+AngⅡ組明顯下降(P=0.039)。見表2。

表2 各組心室肌細(xì)胞β-MHC mRNA表達(dá)水平和細(xì)胞表面積的比較

2.2Ad-Crim1、Los抑制AngⅡ刺激導(dǎo)致的心室肌細(xì)胞Crim1的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào) 各組心室肌細(xì)胞Crim1 mRNA表達(dá)值進(jìn)行比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=710.507，P<0.001)；AngⅡ組Crim1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.001)，而Crim1組較對(duì)照組明顯升高(P<0.001)；Los+AngⅡ組(P=0.003)、Crim1+AngⅡ組(P<0.001)和Crim1+Los+AngⅡ組(P<0.001)Crim1 mRNA表達(dá)值皆較AngⅡ組明顯增加；Crim1+Los+AngⅡ組Crim1 mRNA表達(dá)值較Los+AngⅡ組明顯增加(P=0.035)。各組心室肌細(xì)胞Crim1蛋白表達(dá)值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=198.967，P<0.001)；AngⅡ組Crim1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.001)，而Crim1組較對(duì)照組明顯升高(P<0.001)；Los+AngⅡ組(P=0.008)、Crim1+AngⅡ組(P<0.001)和Crim1+Los+AngⅡ組(P<0.001)Crim1蛋白表達(dá)值皆較AngⅡ組明顯增加；Crim1+Los+AngⅡ組Crim1 mRNA表達(dá)值較Los+AngⅡ組明顯增加(P=0.005)。見表3。

表3 各組心室肌細(xì)胞Crim1和蛋白表達(dá)水平的比較

2.3Ad-Crim1、Los抑制AngⅡ刺激導(dǎo)致的心室肌細(xì)胞Kir2.1的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào) 各組心室肌細(xì)胞Kir2.1 mRNA表達(dá)值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.823，P<0.001)；AngⅡ組Kir2.1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.001)，而Crim1組較對(duì)照組明顯升高(P<0.001)；Crim1+AngⅡ組和Crim1+Los+AngⅡ組Kir2.1 mRNA表達(dá)值皆較AngⅡ組明顯增加(P均<0.001)；Crim1+Los+AngⅡ組Kir2.1 mRNA表達(dá)值較Los+AngⅡ組明顯增加(P=0.007)。各組心室肌細(xì)胞Kir2.1蛋白表達(dá)值進(jìn)行比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=52.330，P<0.001)；AngⅡ組Kir2.1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.001)，而Crim1組較對(duì)照組明顯升高(P<0.001)；Los+AngⅡ組(P=0.004)、Crim1+AngⅡ組(P<0.001)和Crim1+Los+AngⅡ組(P<0.001)Kir2.1蛋白表達(dá)值皆較AngⅡ組明顯增加；Crim1+Los+AngⅡ組Kir2.1蛋白表達(dá)值較Los+AngⅡ組明顯增加(P=0.004)。見表4。

表4 各組心室肌細(xì)胞Kir2.1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

3 討 論

心肌肥大、心衰患者室性心律失常風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，其機(jī)制之一是存在心室電重構(gòu)[7]。離子通道重構(gòu)是這些心臟電生理變化的重要基礎(chǔ)。心肌肥大的發(fā)生機(jī)制涉及眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族成員。在壓力負(fù)荷和AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大中BMP4表達(dá)上調(diào)，而BMP4的表達(dá)能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、凋亡和心肌纖維化，并能增強(qiáng)AngⅡ所誘導(dǎo)的心肌肥大效應(yīng)[8]。Crim1是一種在心臟高表達(dá)的胚胎基因[9]。它擁有vWF-C型富含半胱氨酸重復(fù)片段(CRR)的跨細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[10]，其結(jié)構(gòu)類似于BMPs抑制劑Chordin，這樣的結(jié)構(gòu)使其成為TGF-β亞家族的調(diào)控分子[11]。Crim1通過CRR片段與BMP4、BMP7結(jié)合，對(duì)BMPs起抑制作用[12]。Crim1廣泛存在于胚胎各組織器官，并影響這些器官的發(fā)育，包括調(diào)控心臟的發(fā)育[13]。

我們的前期研究[14]發(fā)現(xiàn)，在腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心室肥大模型，心室肌組織中Crim1蛋白表達(dá)下調(diào)，AT1R阻滯劑替米沙坦干預(yù)可抑制Crim1蛋白表達(dá)下調(diào)和心室肥大。在牽張刺激誘導(dǎo)的培養(yǎng)乳鼠肥大心室肌細(xì)胞模型，Crim1的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)；AT1R特異性阻滯劑Los干預(yù)顯著抑制心室肌細(xì)胞肥大，并抑制致肥大因素誘導(dǎo)的Crim1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)[4]。通過攜帶Crim1基因的病毒感染促進(jìn)培養(yǎng)心室肌細(xì)胞Crim1蛋白表達(dá)，明顯抑制機(jī)械力牽張和苯腎上腺素刺激的細(xì)胞肥大；并且明顯抑制苯腎上腺素刺激的心室肌細(xì)胞Ito的改變[5]。以上研究結(jié)果顯示，Crim1作為AT1R下游信號(hào)通路參與大鼠心室肌細(xì)胞肥大的負(fù)性調(diào)控，并可能參與心室肌細(xì)胞膜離子通道重構(gòu)的調(diào)控。本研究通過致心肌細(xì)胞肥大因子AngⅡ刺激構(gòu)建心室肌細(xì)胞肥大模型。給予AT1R特異性阻滯劑Los干預(yù)，能顯著抑制AngⅡ刺激誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞肥大效應(yīng)及Crim1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，并抑制AngⅡ刺激誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞Kir2.1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)。給予Ad-Crim1感染心室肌細(xì)胞促Crim1 mRNA過表達(dá)干預(yù)，顯著上調(diào)Crim1蛋白表達(dá)、下調(diào)肥大基因β-MHC的mRNA表達(dá)；并明顯抑制AngⅡ刺激誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞肥大及Kir2.1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)。Los和Ad-Crim1聯(lián)合干預(yù)較Ad-Crim1單獨(dú)干預(yù)能更顯著抑制AngⅡ刺激心室肌細(xì)胞誘導(dǎo)的上述效應(yīng)。該結(jié)果顯示，Crim1作為AT1R下游因子參與心室肌細(xì)胞肥大及Kir2.1 mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)控，但其并非AT1R調(diào)控心室肌細(xì)胞肥大和Kir2.1表達(dá)的唯一的下游信號(hào)因子。

綜上所述，AT1R-Crim1信號(hào)通路參與AngⅡ誘導(dǎo)的乳鼠肥大心室肌細(xì)胞Kir2.1 mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)控。