覃玲艷，顧冬梅，郭凌川，馬文霞，尤志群，楊紅麗

肺癌是最常見的惡性腫瘤。2018年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的肺癌發(fā)病率為11.6%，其病死率占癌癥死亡總例數(shù)的18.4%，是癌癥死亡的主要原因[1]。肺癌中大部分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，惡性胸水是中晚期NSCLC較為常見的并發(fā)癥。胸水脫落細(xì)胞學(xué)檢查具有微創(chuàng)、快捷、可重復(fù)等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于臨床病理診斷中。免疫治療是目前癌癥研究的熱點，其中程序性死亡受體-1(programmed death receptor-1, PD-1)/程序性死亡配體-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)通路在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，PD-L1是PD-1的一種配體，兩者均可影響腫瘤免疫微環(huán)境[2]。本文采用免疫組化EnVision兩步法檢測PD-L1(22C3)在149例NSCLC惡性胸水細(xì)胞蠟塊中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與NSCLC臨床病理學(xué)特征、ALK(D5F3)表達(dá)、EGFR突變及患者總生存期的關(guān)系，旨在探討PD-L1(22C3)在NSCLC惡性胸水中的檢測意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年12月～2019年12月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院診治的149例伴有惡性胸水并經(jīng)細(xì)胞蠟塊免疫組化證實為轉(zhuǎn)移性NSCLC的標(biāo)本，其中男性72例，女性77例，男女比約為1 ∶0.94，患者年齡37～92歲，中位年齡65歲；腫瘤直徑≤3 cm者93例，>3 cm者56例；吸煙者55例，非吸煙者94例。由兩名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師依據(jù)WHO(2015)呼吸系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對各病例進(jìn)行分類[3]：其中腺癌144例，鱗狀細(xì)胞癌5例；高+中分化癌79例，低分化癌70例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移76例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73例；伴遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移61例；有胸膜累及74例，無胸膜累及75例；接受放、化療54例，未接受放、化療95例。

1.2 細(xì)胞學(xué)涂片及沉渣包埋對臨床送檢的200 mL胸腔積液行常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片及沉渣包埋，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，鏡下觀察，評估細(xì)胞蠟塊腫瘤細(xì)胞數(shù)均大于100個，行后續(xù)相關(guān)檢測。

1.3 免疫組化采用全自動Benchmark XT檢測系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化EnVision兩步法染色。選擇Ep-CAM、CK7、TTF-1、Napsin A、CK5/6、p40、p63、Calretinin、Ki-67等抗體作為轉(zhuǎn)移性肺癌的診斷和鑒別診斷指標(biāo)。同時檢測ALK(D5F3)、PD-L1(22C3)的表達(dá)。所有抗體及試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。PD-L1(22C3)抗體稀釋比為1 ∶50，試劑盒購自南京大鳥生物公司，染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 基因檢測采用ARMS法(廈門艾德生物公司)檢測惡性胸水細(xì)胞蠟塊中EGFR基因18、19、20及21號外顯子的突變情況。具體檢測步驟參照試劑盒說明書。

1.5 結(jié)果判讀Ep-CAM、CK7、Napsin A、CK5/6、Calretinin陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，TTF-1、p40、p63、Ki-67陽性定位于細(xì)胞核，呈棕黃色。ALK(D5F3)判讀參照《Ventana anti-ALK(D5F3)評分解讀指南》[4]。PD-L1(22C3)評分判讀標(biāo)準(zhǔn)：只判讀活的腫瘤細(xì)胞，至少讀取100個形態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞，任何可見的線性細(xì)胞膜染色(部分或完整)及細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染色均為陽性；細(xì)胞膜無染色，僅細(xì)胞質(zhì)染色為陰性。由兩名有經(jīng)驗的病理科診斷醫(yī)師進(jìn)行ALK(D5F3)、PD-L1(22C3)結(jié)果判讀。腫瘤陽性細(xì)胞百分比TPS=(PD-L1陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。表達(dá)的差異性采用χ2檢驗、校正χ2檢驗，相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)檢驗，組間生存率采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較生存曲線的差異性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者惡性胸水中癌細(xì)胞的鑒定NSCLC惡性胸水中轉(zhuǎn)移性腺癌脫落細(xì)胞學(xué)HE染色，鏡下見癌細(xì)胞呈散在或團(tuán)片狀分布，極性紊亂，核質(zhì)比增高，胞質(zhì)豐富，含有黏液，細(xì)胞核呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形，核染色質(zhì)深染呈粗顆粒狀，部分細(xì)胞可見核仁(圖1)；胸水沉渣包埋細(xì)胞塊HE染色(圖2A)，轉(zhuǎn)移性腺癌相關(guān)免疫指標(biāo)的表達(dá)：Ep-CAM表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)(圖2B)、Napsin A表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)(圖2C)、TTF-1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞核(圖2D)、PD-L1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)(圖2E)。NSCLC惡性胸水中轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌脫落細(xì)胞學(xué)HE染色，鏡下見癌細(xì)胞大小不一，呈團(tuán)片狀分布，極性紊亂，核質(zhì)比增高，胞質(zhì)較少，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則形，核染色質(zhì)濃染呈粗顆粒狀(圖3)；胸水沉渣包埋細(xì)胞塊HE染色(圖4A)，轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)免疫指標(biāo)的表達(dá)：CK5/6表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)(圖4B)、p40表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞核(圖4C)、p63表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞核(圖4D)、PD-L1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)(圖4E)。

圖1 NSCLC惡性胸水(轉(zhuǎn)移性腺癌)的HE染色 圖2 NSCLC惡性胸水(轉(zhuǎn)移性腺癌)：A.胸水細(xì)胞塊HE染色；B.Ep-CAM呈胞膜或胞質(zhì)陽性，EnVision兩步法；C.Napsin A呈胞質(zhì)陽性，EnVision兩步法；D.TTF-1呈胞核陽性，EnVision兩步法；E.PD-L1呈胞膜和胞質(zhì)陽性，EnVision兩步法 圖3 NSCLC惡性胸水(轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌)的HE染色 圖4 NSCLC惡性胸水(轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌)：A.胸水細(xì)胞塊HE染色；B.CK5/6呈胞膜或胞質(zhì)陽性，EnVision兩步法；C.p40呈胞核陽性，EnVision兩步法；D.p63呈胞核陽性，EnVision兩步法；E.PD-L1呈胞膜和胞質(zhì)陽性，EnVision兩步法

2.2 NSCLC患者惡性胸水中PD-L1(22C3)蛋白的表達(dá)在149例NSCLC患者惡性胸水中，PD-L1(22C3)陽性定位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)，17例PD-L1(22C3)陽性率<1%(圖5A)；29例為1%～49%(圖5B)，17例≥50%(圖5C)，總陽性率為42.3%。

圖5 PD-L1(22C3)蛋白在NSCLC惡性胸水中的表達(dá)，EnVision兩步法：A.PD-L1陽性率<1%；B.PD-L1陽性率1%～49%；C.PD-L1陽性率≥50%

2.3 NSCLC惡性胸水中PD-L1(22C3)表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系在NSCLC患者惡性胸水中，PD-L1(22C3)表達(dá)與腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無其他臟器轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)；PD-L1(22C3)的陽性率區(qū)間分布與腫瘤直徑、有無其他臟器轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05，表1)。

表1 PD-L1(22C3)表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 NSCLC惡性胸水中PD-L1(22C3)表達(dá)與ALK(D5F3)表達(dá)及EGFR突變的相關(guān)性PD-L1(22C3)在NSCLC患者惡性胸水中的表達(dá)與ALK(D5F3)表達(dá)呈正相關(guān)(rs=11.49，P<0.05)，與EGFR突變無關(guān)(rs=0.004，P>0.05，表2)。

表2 NSCLC中PD-L1(22C3)的表達(dá)與ALK(D5F3)表達(dá)及EGFR突變的相關(guān)性(n=97)

2.5 NSCLC惡性胸水中PD-L1(22C3)表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系對149例伴有惡性胸水的NSCLC患者進(jìn)行隨訪，PD-L1(22C3)陽性患者與陰性患者的中位總生存期分別為6和12個月，差異有顯著性(P<0.05，圖6)。

圖6 NSCLC惡性胸水中PD-L1(22C3)表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系

3 討論

中晚期NSCLC常伴發(fā)惡性胸水，且部分患者存在基因靶向治療受限或治療后耐藥等瓶頸，預(yù)后較差[5]。免疫治療是目前癌癥研究的新領(lǐng)域，PD-1/PD-L1通路在腫瘤免疫逃逸中起主導(dǎo)作用[6]，通過對其相關(guān)通路機(jī)制的研究，可為臨床NSCLC的免疫治療提供新的理論依據(jù)。

目前，多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)，包括NSCLC、乳腺癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等。李毓飛等[7]報道，在胃癌組織中PD-L1的表達(dá)高于癌旁組織，且其表達(dá)與腫瘤直徑和分化程度相關(guān)，提示腫瘤預(yù)后不良。Lin等[8]研究證實，PD-1、PD-L1(22C3)在肺癌組織中的表達(dá)與腫瘤直徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級相關(guān)。本實驗結(jié)果表明，在149例NSCLC患者惡性胸水中，PD-L1(22C3)的總陽性率為42.3%，其表達(dá)與腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無其他臟器轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。提示PD-L1(22C3)參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展，可作為NSCLC惡性進(jìn)展和預(yù)后評估的重要分子標(biāo)志物。

隨著對NSCLC靶向治療的研究與進(jìn)展，以ALK、EGFR為驅(qū)動基因的分子靶向治療已在臨床成熟應(yīng)用，相關(guān)研究結(jié)果表明對于ALK融合蛋白陽性且EGFR基因突變的病例，采用EGFR-TKI及克唑替尼治療均表現(xiàn)為臨床獲益[9]。本實驗結(jié)果顯示，PD-L1(22C3)與ALK(D5F3)的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，而與EGFR突變無關(guān)(P>0.05)。了解基因之間的相互作用有助于理解臨床腫瘤靶向治療時出現(xiàn)的耐藥機(jī)制。

通過對抗PD-1/PD-L1通路免疫逃逸機(jī)制的研究，目前已有多種PD-1/PD-L1單克隆抗體治療性藥物問世，其中PD-L1單克隆抗體包括Nivolumb、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab等[10]。前期臨床研究結(jié)果表明在抗PD-1/PD-L1免疫治療中，腫瘤細(xì)胞PD-L1高表達(dá)患者的中位總生存期、1年生存率、客觀緩解率等比PD-L1低表達(dá)患者有明顯優(yōu)勢[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)PD-L1(22C3)陽性患者與陰性患者的中位總生存期差異有顯著性(P<0.05)，檢測PD-L1(22C3)在晚期NSCLC惡性胸水中的表達(dá)，可為臨床腫瘤免疫治療提供一定的參考依據(jù)。

綜上所述，PD-L1(22C3)參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展，其表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。行胸水細(xì)胞蠟塊PD-L1(22C3)免疫組化檢測具有簡單易行、快速實用、微創(chuàng)并可重復(fù)檢查等優(yōu)點。檢測中晚期NSCLC患者惡性胸水中PD-L1(22C3)的表達(dá)，對NSCLC患者的鞏固治療與預(yù)后監(jiān)測均具有重要的臨床應(yīng)用價值。