楊朝暉，林 雅，曹學(xué)全，顧華敏，蔡小波，於櫻枝，盧洪勝

晚期惡性腫瘤是導(dǎo)致胸腔積液形成的原因之一，常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片陽(yáng)性率較低。在惡性胸腔積液中可見(jiàn)到多種類型的腫瘤細(xì)胞，由于腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性和相似性，鑒別困難，尤以惡性腫瘤易誤診[1]。晚期乳腺癌胸腔轉(zhuǎn)移病例雖常見(jiàn)，但關(guān)于乳腺癌的惡性胸腔積液細(xì)胞學(xué)形態(tài)的報(bào)道較少，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道乳腺癌胸腔積液基于免疫組化結(jié)果的分子分型改變情況，而該現(xiàn)象對(duì)臨床治療和預(yù)后判斷非常重要。本文結(jié)合細(xì)胞蠟塊和臨床資料，探討乳腺癌轉(zhuǎn)移性胸腔積液的細(xì)胞學(xué)形態(tài)、免疫細(xì)胞化學(xué)特點(diǎn)及分子分型改變。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年11月～2021年4月臺(tái)州市中心醫(yī)院(臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院)存檔的11例和溫嶺市第一人民醫(yī)院存檔的3例乳腺癌轉(zhuǎn)移性胸腔積液標(biāo)本。這些標(biāo)本原發(fā)部位的診斷均依據(jù)臨床資料、影像學(xué)和(或)病理檢查證實(shí)。

1.2 方法使用廣州安必平液基細(xì)胞沉降式制片染色機(jī)，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行制片，巴氏染色，閱片。取液基制片后剩余胸腔積液放入50 mL離心管中，離心機(jī)2 000 r/min離心5 min，棄上清；向沉淀物中加入10%中性福爾馬林5 mL，振蕩，2 000 r/min離心5 min，棄上清；向沉淀物中加入95%乙醇10 mL，振蕩，2 000 r/min離心10 min，棄上清液；將底部沉淀物包于濾紙置入包埋盒中，與常規(guī)組織一同行脫水處理，制成細(xì)胞蠟塊。

1.3 試劑免疫細(xì)胞化學(xué)染色過(guò)程所需單克隆抗體：ER、PR、HER-2、Ki-67、GATA3、p120、CK34βE12、E-cadherin、CK、PCNA、TTF-1、Napsin A、CK7、Villin、CDX-2、CA125、PAX8、AR、P504S、Calretinin和WT-1等鼠抗人單克隆抗體，均購(gòu)自福州邁新生物公司。具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定根據(jù)空白、陽(yáng)性和陰性對(duì)照的顯色情況，在確定無(wú)假陽(yáng)性和假陰性的前提下，HER-2、p120、CK34βE12、E-cadherin、CK、Napsin A、CK7、Villin、CA125和P504S蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)，ER、PR、Ki-67、GATA3、PCNA、TTF-1、CDX-2、PAX8、AR、WT-I蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核，Calretinin蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，均呈棕黃色顆粒；陽(yáng)性細(xì)胞>10%為陽(yáng)性。

乳腺癌分子分型采用免疫組化替代分型(2013年St Gallen乳腺癌會(huì)議國(guó)際共識(shí)[2])，即：ER陽(yáng)性，PR陽(yáng)性率≥20%，HER-2陰性且Ki-67增殖指數(shù)<20%定義為L(zhǎng)uminal A型；Luminal B型分兩種情況，一種為ER陽(yáng)性，HER-2陰性，Ki-67增殖指數(shù)≥20%或PR陽(yáng)性率<20%，另一種為ER陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性、PR及Ki-67增殖指數(shù)任何表達(dá)水平；HER-2過(guò)表達(dá)型定義為ER及PR陰性，HER-2陽(yáng)性；ER、PR及HER-2均陰性定義為三陰型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌轉(zhuǎn)移性胸腔積液臨床病理學(xué)特征及分子分型14例患者年齡44～74歲，平均60.36歲；其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌Ⅲ級(jí)9例(64.3%)，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌Ⅱ級(jí)3例(21.4%)，浸潤(rùn)性小葉癌2例(14.3%)；分子分型：2例術(shù)后不詳，余12例Luminal A型3例(25%)，Luminal B型7例(58.4%)，三陰型1例(8.3%)，HER-2過(guò)表達(dá)型1例(8.3%)。14例基于胸腔積液的分子分型結(jié)果：Luminal A型4例(28.6%)，Luminal B型3例(21.4%)，三陰型5例(35.7%)，HER-2過(guò)表達(dá)型2例(14.3%)；隨訪期間，生存7例，死亡6例，總生存期10個(gè)月～13年，出現(xiàn)胸水至死亡時(shí)間均在1年內(nèi)，失訪1例(表1)。

表1 14例胸腔轉(zhuǎn)移乳腺癌臨床病理學(xué)特征及分子分型

2.2 乳腺癌細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)12例細(xì)胞單個(gè)或形成不同大小的三維細(xì)胞團(tuán)，圓形、卵圓形或不規(guī)則形，可以互相疊加，又稱球形或空心球形(圖1、2)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果：Ki-67、GATA3、p120胞膜(圖3)、CK均陽(yáng)性；ER陽(yáng)性5例；PR陽(yáng)性4例。12例對(duì)應(yīng)組織學(xué)診斷均為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。12例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中HER-2基因擴(kuò)增3例，無(wú)擴(kuò)增9例。表型擴(kuò)增細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)免疫組化結(jié)果一致。

圖1 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的液基細(xì)胞學(xué)涂片，鏡下見(jiàn)圓形、卵圓形或不規(guī)則形的三維細(xì)胞團(tuán)，巴氏染色 圖2 乳腺導(dǎo)管癌的細(xì)胞蠟塊染色，鏡下見(jiàn)球形或空心球形的細(xì)胞團(tuán)，HE染色 圖3 乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞蠟塊p120胞膜陽(yáng)性，SP法 圖4 乳腺浸潤(rùn)性小葉癌的液基細(xì)胞學(xué)涂片，鏡下見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞或單層排列的細(xì)胞團(tuán)，巴氏染色 圖5 乳腺浸潤(rùn)性小葉癌的細(xì)胞蠟塊染色，鏡下見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)，HE染色圖6 p120呈細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性，SP法

2例細(xì)胞單個(gè)或形成不同大小的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞單層排列，可見(jiàn)核仁(圖4、5)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果：CK34βE12、p120胞質(zhì)(圖6)、GATA3陽(yáng)性。2例組織學(xué)診斷均為乳腺浸潤(rùn)性小葉癌。免疫組化結(jié)果：ER 1例陽(yáng)性、1例陰性；PR 1例陽(yáng)性、1例陰性。HER-2基因無(wú)擴(kuò)增。細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)免疫組化結(jié)果基本一致。

3 討論

乳腺癌已成為全球女性癌癥死亡的主要原因[3]，我國(guó)乳腺癌已成為威脅女性健康的主要惡性腫瘤。乳腺癌可以通過(guò)血行/淋巴和種植轉(zhuǎn)移，如果出現(xiàn)胸腔積液，應(yīng)考慮是胸膜、肺部轉(zhuǎn)移等造成的。很多惡性腫瘤晚期均可出現(xiàn)胸腔積液，最常見(jiàn)的為肺癌，但出現(xiàn)胸腔積液未必均出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，即使有腫瘤轉(zhuǎn)移也不一定可以在胸水中找及惡性腫瘤細(xì)胞。因此，在胸腔積液中找及惡性腫瘤細(xì)胞相對(duì)較難，細(xì)胞學(xué)檢測(cè)能及時(shí)明確診斷，可以指導(dǎo)胸腔灌注化療或配合放化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等[4]。

本組14例乳腺癌轉(zhuǎn)移性胸腔積液以浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌為主，也可以為浸潤(rùn)性小葉癌，分子分型以Luminal B型為主，隨訪期間，7例生存，6例死亡，1例失訪，總生存期10個(gè)月～13年，出現(xiàn)胸水至死亡時(shí)間均在1年內(nèi)，提示伴胸腔積液患者預(yù)后較差。有6例胸腔積液的分子分型發(fā)生改變，其中3例Luminal B型改成三陰型，1例Luminal A型改成三陰型，1例Luminal B型改成Luminal A型，1例Luminal B型改成HER-2過(guò)表達(dá)型；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ER、PR的表達(dá)發(fā)生明顯改變，有6例直接轉(zhuǎn)為陰性，3例表達(dá)減弱；HER-2表達(dá)未發(fā)生改變；Ki-67表達(dá)部分增強(qiáng)部分減弱。ER和PR分別是雌激素受體和孕激素受體，其表達(dá)與乳腺癌發(fā)生及預(yù)后有關(guān)[5]。HER-2是表皮生長(zhǎng)因子受體家族(epithelial growth factor receptor, EGFR)成員，與乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及靶向治療有關(guān)[6]，HER-2是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后和預(yù)測(cè)指標(biāo)，決定了疾病的侵襲性進(jìn)程，增加復(fù)發(fā)的機(jī)會(huì)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并縮短無(wú)瘤生存期。HER-2陽(yáng)性乳腺腫瘤對(duì)人源化單克隆抗體赫賽汀治療亦有反應(yīng)。病理醫(yī)師需要報(bào)告已知復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的HER-2和受體表達(dá)狀態(tài)。這對(duì)于確認(rèn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤的狀態(tài)通常是必要的，據(jù)報(bào)道復(fù)發(fā)性/轉(zhuǎn)移性乳腺癌與原發(fā)腫瘤的受體狀態(tài)有近36%的差異。Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，與腫瘤的惡性程度有關(guān)[6]。本組病例HER-2檢測(cè)的一致性較好，但激素受體發(fā)生明顯改變，這對(duì)于臨床選擇治療和預(yù)后判斷具有重要意義，本組5例發(fā)生激素受體表達(dá)丟失的患者均已死亡，提示激素受體表達(dá)轉(zhuǎn)陰者預(yù)后更差。

對(duì)于胸腔積液免疫表型與原發(fā)腫瘤不一致的問(wèn)題，需要進(jìn)一步分析可能的原因，以避免不必要的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，胸腔積液的保存時(shí)間、保存溫度、保存液的選擇等均有可能影響細(xì)胞學(xué)的制片結(jié)果和免疫表型[7-8]，正確收集、存儲(chǔ)、保存和處理技術(shù)的掌握程度對(duì)于確保樣品的正確處理和成功分析是必不可少的[9]。需要確保細(xì)胞蠟塊經(jīng)10%中性福爾馬林固定和石蠟包埋，并制作組織對(duì)照片[10]。

本組乳腺癌的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)因組織學(xué)類型不同而有所不同。乳腺癌細(xì)胞學(xué)制片的背景較干凈，無(wú)炎癥細(xì)胞。乳腺癌胸腔積液的細(xì)胞學(xué)形態(tài)有兩種：(1)細(xì)胞單個(gè)或形成不同大小的圓形、卵圓形或不規(guī)則形的三維細(xì)胞團(tuán)，可以互相疊加，又稱球形或空心球形。(2)排列方式為細(xì)胞單個(gè)或單層排列的細(xì)胞團(tuán)，可見(jiàn)核仁。該排列方式可見(jiàn)于任何一種乳腺癌類型，但對(duì)診斷浸潤(rùn)性小葉癌價(jià)值更大。p120連環(huán)素是catenin家族新成員，與E-cadherin具有特殊的連接性，在細(xì)胞黏附、發(fā)育和乳腺癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用[11]。細(xì)胞角蛋白CK34βE12與乳腺癌發(fā)生及組織學(xué)類型相關(guān)[12]。CK34βE12陽(yáng)性提示乳腺癌為浸潤(rùn)性小葉癌。聯(lián)合檢測(cè)ER、PR、HER-2、Ki-67、p120及CK34βE12免疫細(xì)胞化學(xué)染色及病史對(duì)診斷惡性胸腔積液乳腺來(lái)源及組織學(xué)類型非常重要。由于胸腔積液中惡性腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性和相似性，診斷乳腺癌需與肺腺癌、胃腸道腺癌、卵巢外漿液性癌、惡性間皮瘤等腫瘤進(jìn)行鑒別[13]，可通過(guò)特征性的細(xì)胞學(xué)形態(tài)及特異性免疫組化標(biāo)記進(jìn)行鑒別。

綜上，若腫瘤患者出現(xiàn)胸腔積液，尋找原發(fā)部位顯得尤為重要。女性患者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性乳腺癌通過(guò)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及免疫組化結(jié)果不難診斷，乳腺癌發(fā)生胸腔積液一般病理分級(jí)較高、預(yù)后較差，尤其發(fā)生激素受體(ER、PR)轉(zhuǎn)陰的患者，生存時(shí)間通常不超過(guò)1年。對(duì)于乳腺癌胸腔積液分子分型發(fā)生改變的標(biāo)本，需要排除各方面的影響因素進(jìn)行綜合分析，盡可能按照標(biāo)準(zhǔn)化模式制作樣本。