李思怡 ，麥偉柵 ，林琨洋 ，林澤龍 ，羅敏怡 ，潘華峰 ＊＊

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所 廣州 510006；2.教育部中醫(yī)藥防治腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 廣州 510006；3.深圳大學(xué)體育學(xué)院 深圳 518000；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心 廣州 510006；5.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 廣州 510515）

胃癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一[1]，在我國(guó)，胃癌的發(fā)生率和死亡率高居惡性腫瘤第二位[2]。胃癌前病變（Gastric precancerous lesions，GPL）是慢性胃炎演變成胃癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是指胃黏膜萎縮基礎(chǔ)上合并異型增生的病理改變[3]，該病理階段包含不同程度的胃黏膜損傷，臨床以胃脘疼痛、飽脹、痞悶、噯氣、納呆等為主要表現(xiàn)，屬中醫(yī)“痞滿”、“胃痞”以及“虛痞”等范疇。但研究表明，GPL表現(xiàn)為細(xì)胞退化變性和增殖長(zhǎng)期共存，但具有一定的可逆性[4-6]。GPL常由慢性萎縮性胃炎發(fā)展而來(lái)，大量研究證實(shí)，脾虛是慢性萎縮性胃炎和GPL的發(fā)病基礎(chǔ)[7]。中醫(yī)理論認(rèn)為GPL的病位在脾胃，基本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，即“脾虛、血瘀、夾毒”[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，脾虛證大鼠胃黏膜萎縮變薄，免疫功能低下及黏膜微血管新生等結(jié)構(gòu)改變，病理切片可見(jiàn)胃黏膜固有腺體萎縮，常伴腸上皮化生以及異型增生等[9]。目前西醫(yī)對(duì)GPL主要為對(duì)癥支持治療，而中醫(yī)對(duì)于GPL治療多從“虛”和“瘀”論治[10]?！堵晕秆字嗅t(yī)診療專家共識(shí)意見(jiàn)》認(rèn)為GPL以氣陰兩虛和氣滯血瘀多見(jiàn)[11]。中醫(yī)辨證論治不僅可明顯改善GPL臨床癥狀，具有明顯的“既病防變”作用，在抑制或逆轉(zhuǎn)腸上皮化生及異型增生方面取得了良好的療效[9]。

課題組前期通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，健脾化瘀解毒方可能通過(guò)白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等核心治療靶點(diǎn)，作用于 PI3K-AKT（PI3K：Phosphatidylinositide 3-kinases；AKT：又 稱 PKB（protein kinase B））、HIF-1（Hypoxia inducible factor 1）及 MAPK（Mitogen-activated protein kinase）等信號(hào)通路，發(fā)揮防治胃癌前病變的作用[2]。另外，健脾化瘀解毒方源自于四君子湯，以“健脾益氣，化瘀解毒”立法，是課題組長(zhǎng)期臨床治療慢性萎縮性胃炎-GPL的經(jīng)驗(yàn)方，前期研究證實(shí)健脾化瘀解毒方能顯著改善GPL患者的臨床癥狀、內(nèi)鏡表現(xiàn)以及病理學(xué)改變，具有明確的臨床療效[13]。缺少參考文獻(xiàn)序號(hào)12，請(qǐng)核實(shí)并修改。參考文獻(xiàn)需按照在正文中出現(xiàn)的順序依次標(biāo)號(hào)，請(qǐng)全文核實(shí)并修改。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，健脾化瘀解毒方可抑制SPF級(jí)同窩野生型小鼠和Atp4a-/-小鼠PI3K/AKT/HIF-1α信號(hào)通路的激活，抑制細(xì)胞惡性增殖與腸上皮化生，進(jìn)而發(fā)揮修復(fù)受損胃黏膜的作用[7]，但其對(duì)于胃癌前病變小鼠脾虛癥狀的改善作用及潛在機(jī)制尚不明確。有研究說(shuō)明，中醫(yī)“四季脾旺不受邪”所涵蓋的內(nèi)容包括西醫(yī)脾臟、胃腸道等器官的免疫功能[8]，說(shuō)明對(duì)脾臟、胃腸道等器官的觀察可能進(jìn)一步反映中醫(yī)“脾”的功能。

因此，本研究基于AKT、p38蛋白磷酸化調(diào)控氧化應(yīng)激理論，通過(guò)構(gòu)建胃癌前病變小鼠脾虛證模型，探索了健脾化瘀解毒方治療胃癌前病變脾虛證的作用機(jī)制，豐富了中醫(yī)藥治療胃癌前病變的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2018-0034）。飼養(yǎng)環(huán)境：廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)小鼠的處理已獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

1.2 儀器

JJ3000動(dòng)物電子秤（公司）、自動(dòng)真空組織脫水機(jī)（Leica公司）、石蠟包埋機(jī)（Leica公司）、RM2135石蠟切片機(jī)（Leica公司）、正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）、3K30離心機(jī)（SIGMA公司產(chǎn)品）、垂直電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）以及蛋白凝膠成像儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

1.3 藥物與試劑

健脾化瘀解毒方（黃芪20 g，太子參15 g，白術(shù)10 g，茯苓 12 g，三七粉 3 g，莪術(shù) 10 g，白花蛇舌草15 g，猴菇菌提取物15 g）；N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）（日本東京株氏會(huì)社）；無(wú)水乙醇、甲醇、二甲苯、鹽酸及中性樹(shù)脂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；石蠟（Leica公司）；蘇木素、伊紅染色試劑盒（南京建成）；GAPDH兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)）；p-p38、P38、p-AKT、AKT兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)）；HRP標(biāo)記的抗兔IgG二抗（Cell Signaling Technology，美國(guó)）；HRP標(biāo)記的抗鼠IgG二抗（Cell Signaling Technology，美國(guó)）。

2 方法

2.1 造模方法

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用對(duì)致癌因子敏感的C57近交系小鼠BALB/c自由飲用MNNG復(fù)制GPL脾虛證小鼠模型。取50只健康SPF級(jí)雄性成年BALB/c小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，記錄體質(zhì)量變化，并進(jìn)行適應(yīng)性飲用MNNG溶液，將體質(zhì)量差異較大的小鼠淘汰，留取40只小鼠，通過(guò)隨機(jī)數(shù)表法將其分為空白組（n=8）、模型組（n=8）、健脾化瘀解毒方低劑量組（n=8）、健脾化瘀解毒方高劑量組（n=8）、陽(yáng)性藥組（n=8），連續(xù)造模14周。

2.2 干預(yù)方法

SPF級(jí)4周齡，雄性，體質(zhì)量20-22 g的BALB/c小鼠共40只，分為正常組（8只）及造模組（32只），模型組8只，維生素B12組8只，健脾化瘀解毒方高低劑量組各8只。正常組小鼠予正常飲食，造模組通過(guò)MNNG自由飲用復(fù)制GPL脾虛證小鼠模型，連續(xù)造模14周，造模劑MNNG飲用濃度為150 μg·mL-1。并于造模第6周聯(lián)合灌胃給藥，健脾化瘀解毒方低（MNNG+JPHYJD 3.75 g·kg-1·d-1）、高劑量組（MNNG+JPHYJD 15 g·kg-1·d-1），每日給藥1次，持續(xù)給藥8周。正常對(duì)照組和模型組以等量蒸餾水灌胃。并于末次給藥前12 h開(kāi)始禁食（不禁水），取血后取材。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 小鼠整體情況觀察

定期記錄小鼠的體質(zhì)量及攝食情況，觀察各小鼠的體質(zhì)量及攝食變化。

2.3.2 臟器指數(shù)

臟器指數(shù)為動(dòng)物臟器與其體質(zhì)量的比值，脾臟和胸腺作為重要的免疫器官，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)對(duì)了解小鼠免疫功能有重要意義。取材時(shí)，分離小鼠的脾臟和胸腺，稱重并記錄。脾臟指數(shù)（mg/g）=脾臟重量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g），胸腺指數(shù)（mg/g）=胸腺重量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

2.3.3 脾臟的病理形態(tài)觀察

在脾臟取0.5 cm×0.5 cm組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，固定后用純水沖洗、修剪后放入自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水透明，脫水的步驟是：80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇分別浸泡2 h和二甲苯（2道透明各30 min），石蠟包埋、切片，然后進(jìn)行染色。按脫蠟、梯度乙醇復(fù)水、蘇木素和伊紅染色、梯度乙醇脫水、透明、封固的順序完成HE染色后，置于顯微鏡下觀察脾臟組織結(jié)構(gòu)。

2.3.4 小鼠胃黏膜組織AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白與基因的表達(dá)

Western blot法檢測(cè)小鼠胃黏膜上皮細(xì)胞p-p38、p38、AKT以及p-AKT等蛋白的表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用 one-way ANOVA，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義，應(yīng)用GraphPad 9.0軟件作圖。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體質(zhì)量增長(zhǎng)與攝食變化

每組小鼠體質(zhì)量在14周后均有明顯增長(zhǎng)，其中體質(zhì)量增加最多的是空白組，模型組的小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯低于正常組（P＜0.001）。通過(guò)健脾化瘀解毒方及陽(yáng)性藥干預(yù)后，各組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)出現(xiàn)增多趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，健脾化瘀解毒方高劑量組及陽(yáng)性藥組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)顯著高于模型組小鼠（P＜0.01）。這初步提示健脾化瘀解毒方可改善MNNG所誘導(dǎo)的脾虛證小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢和攝食功能減弱，發(fā)揮改善小鼠脾虛癥狀的作用。請(qǐng)正文合適的位置補(bǔ)充見(jiàn)圖1。

3.2 臟器指數(shù)

圖1 各組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)與攝食變化對(duì)比

圖2 各組小鼠臟器指數(shù)對(duì)比

圖3 空白組脾臟組織

圖4 模型組脾臟組織

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組的脾臟指數(shù)明顯低于空白組（P＜0.05），健脾化瘀解毒方高劑量組和陽(yáng)性藥組的脾臟指數(shù)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。在胸腺指數(shù)方面，各組之間胸腺指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這提示MNNG誘導(dǎo)胃癌前病變脾虛證小鼠，對(duì)其脾臟功能可能具有影響，進(jìn)而促進(jìn)脾虛癥狀加重，而健脾化瘀解毒方可能對(duì)脾臟功能具有保護(hù)作用。

3.3 脾臟組織病理形態(tài)觀察

如圖所示，空白組小鼠脾臟組織小梁明顯，白髓和紅髓的邊界清晰，白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞豐富，見(jiàn)圖3；而模型組小鼠脾臟組織紅白髓無(wú)明顯邊界，小梁消失，可見(jiàn)血竇出血明顯，淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少，提示脾臟功能減弱，但未出現(xiàn)不可逆器質(zhì)性病變，見(jiàn)圖4。與模型組相比，健脾化瘀解毒方低劑量組白髓、紅髓邊界比較清晰，血竇出血較模型組少，淋巴細(xì)胞增生，見(jiàn)圖5；健脾化瘀解毒方高劑量組和陽(yáng)性藥組邊界清晰，淋巴細(xì)胞明顯增多，血竇出血明顯減少，提示健脾化瘀解毒方可能對(duì)脾虛證小鼠脾臟組織修復(fù)具有促進(jìn)作用，見(jiàn)圖6、7。

圖5 健脾化瘀解毒方低劑量組脾臟組織

圖6 健脾化瘀解毒方高劑量組脾臟組織

圖7 陽(yáng)性藥組

圖8 胃黏膜p-p38、p38、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)結(jié)果

3.4 胃黏膜p-p38、p38、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)結(jié)果

與空白組相比，模型組的p-p38、p-AKT灰度顯著高于空白組，p-p38、p-AKT表達(dá)量明顯增多，p38及AKT蛋白表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化，模型組p-p38/p38及p-AKT/AKT灰度比值均顯著高于空白組，提示p38及AKT發(fā)生了磷酸化。與模型組相比，健脾化瘀解毒方高低劑量組及陽(yáng)性藥組p38及AKT蛋白磷酸化程度降低，高劑量組和陽(yáng)性藥組的表達(dá)量降低更明顯，與空白組的表達(dá)量相似。提示健脾化瘀解毒方可能通過(guò)抑制p38及AKT發(fā)生磷酸化，進(jìn)而抑制AKT/p38信號(hào)通路。

4 討論

課題組前期運(yùn)用BALB/c小鼠自由飲用復(fù)制GPL小鼠模型，可見(jiàn)小鼠胃黏膜出現(xiàn)萎縮，伴有腸上皮化生及異型增生，而健脾化瘀解毒方可明顯改善該動(dòng)物模型的胃黏膜病理組織惡變[14]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)對(duì)其進(jìn)行脾虛證評(píng)價(jià)、以方測(cè)證及顯效機(jī)制探討，發(fā)現(xiàn)該模型伴有脾虛證候表現(xiàn)，同時(shí)以脾臟功能變化引起機(jī)體免疫功能變化，進(jìn)一步闡明了健脾化瘀解毒方改善脾虛證GPL的分子生物學(xué)機(jī)制。

4.1 構(gòu)建GPL-脾虛證病證結(jié)合小鼠模型

本研究通過(guò)觀察GPL小鼠的體質(zhì)量及攝食情況，發(fā)現(xiàn)該GPL小鼠模型具有體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢、攝食減少表現(xiàn)，符合《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》中對(duì)脾氣虛證主癥為食少納呆的表現(xiàn)[15]。脾臟與胸腺器官相對(duì)質(zhì)量的變化，取決于其中淋巴細(xì)胞增殖的程度，可反應(yīng)機(jī)體免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，具有健脾功效的中藥可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，達(dá)到治療脾虛的作用，其顯效機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)吸收作用[16]。因此，本研究檢測(cè)該模型小鼠脾臟及胸腺指數(shù)、HE染色結(jié)合光鏡下觀察脾臟病理組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該GPL小鼠模型伴有脾臟指數(shù)降低、脾臟病理組織結(jié)構(gòu)改變，提示該GPL小鼠模型脾臟功能也出現(xiàn)下降。另一方面，該小鼠模型胸腺指數(shù)變化不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該模型變化可能與胸腺引起的免疫功能下降無(wú)關(guān)，脾臟引起的免疫功能可能參與該GPL小鼠脾虛證發(fā)生。通過(guò)以上方法，對(duì)GPL-脾虛證進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，構(gòu)建了GPL-脾虛證的病證結(jié)合模型。

4.2 健脾化瘀解毒方對(duì)GPL脾氣虛證具有顯著療效

在模型構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，通過(guò)健脾化瘀解毒方干預(yù)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)健脾化瘀解毒方可明顯改善該GPL小鼠模型體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢、攝食減少情況，并在一定程度上，可提高M(jìn)NNG誘導(dǎo)所引起的脾臟指數(shù)下降，改善其誘導(dǎo)的脾臟病理組織結(jié)構(gòu)紊亂。方中君藥黃芪為健脾益氣代表藥，臣以太子參益氣生津、健脾滋陰的太子參，同時(shí)助長(zhǎng)黃芪補(bǔ)中益氣，佐以健脾化濕的白術(shù)、茯苓，配合行氣消食的猴頭菇，佐以三七粉、莪術(shù)活血化瘀，再益以解毒抑癌的白花蛇舌草，此五藥相合，既能補(bǔ)脾氣、振脾陽(yáng)，又能補(bǔ)胃氣、養(yǎng)胃陰[3]。全方以胃癌前病變的共同證型基礎(chǔ)——脾虛證為核心，發(fā)揮健脾益氣為主、活血化瘀解毒為輔的作用，從而發(fā)揮改善該GPL小鼠模型脾虛證及脾臟指數(shù)、病理組織結(jié)構(gòu)的作用。

4.3 健脾化瘀解毒方通過(guò)抑制p-38/AKT改善GPL脾虛證

AKT是對(duì)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活及代謝有重要作用的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，PI3K激活后與AKT的PH結(jié)構(gòu)域相互識(shí)別，導(dǎo)致AKT發(fā)生轉(zhuǎn)移和構(gòu)象改變，進(jìn)而通過(guò)磷酸化的方式調(diào)控下游信號(hào)分子，可見(jiàn)AKT是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的核心蛋白[17]。p38MAPK是MAPK超家族成員的重要組成部分，其可受氧化應(yīng)激激活，磷酸化成為p-p38MAPK，發(fā)揮其生物學(xué)活性[18]。p-AKT、p-p38可以通過(guò)激活下游細(xì)胞受體或效應(yīng)器來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞凋亡、血管生成和細(xì)胞周期等[7]，AKT和p38的活化都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]，而且與多種腫瘤患者預(yù)后差密切相關(guān)[19-22]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，健脾化瘀解毒方可抑制Atp4a-/-小鼠PI3K/AKT/HIF-1α信號(hào)通路的激活，進(jìn)而發(fā)揮修復(fù)受損胃黏膜的作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)健脾化瘀解毒方可能通過(guò)抑制AKT及p38的磷酸化，調(diào)控p38/AKT信號(hào)通路。因此，健脾化瘀解毒方調(diào)控該通路，發(fā)揮對(duì)改善消瘦、攝食減少等GPL小鼠脾虛癥狀及脾臟病理組織結(jié)構(gòu)的作用，進(jìn)而促進(jìn)受損胃黏膜的修復(fù)，可能與AKT及p38的磷酸化相關(guān)。

本研究通過(guò)構(gòu)建GPL小鼠模型，結(jié)合脾虛證候分析，初步建立胃癌前病變小鼠的脾虛證病證結(jié)合評(píng)價(jià)體系，為篩選GPL脾虛證特色中藥新藥提供了載體，并結(jié)合以方測(cè)證法，明確了健脾化瘀解毒方對(duì)脾虛證GPL的療效，初步探討了p-38/AKT信號(hào)通路激活與脾虛證的關(guān)系，豐富了健脾化瘀解毒方治療GPL的理論依據(jù)，從脾虛證角度，以p38/AKT的磷酸化為切入點(diǎn)，為研究GPL病證結(jié)合及闡明中藥復(fù)方顯效機(jī)制提供了思路。