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基于JAK2/STAT3信號(hào)通路探討參茸地黃湯調(diào)控自噬改善糖尿病的作用機(jī)制*

2022-03-28 02:31金美英潘韋韋崔鎮(zhèn)海
關(guān)鍵詞:黃湯鹽酸肝臟

金美英,潘韋韋,崔鎮(zhèn)海**

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院 長春 130117;2.長春醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校健康學(xué)院 長春 130031)

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM)是一組以高血糖為特征由胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞缺陷共同形成的代謝紊亂綜合征[1]。其發(fā)病隱匿,病程長,容易被人忽視,致使糖尿病患者較正常人發(fā)生嚴(yán)重危及生命事件的風(fēng)險(xiǎn)大大增加,且給患者及社會(huì)帶來較重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[2],因此防治糖尿病已經(jīng)成為刻不容緩的重大問題。

中醫(yī)學(xué)將T2DM稱之為消渴病,又名“脾癉”、“消中”、“消癉”,《金匱要略》首以“消渴”為篇名,以腎虛辨治消渴,認(rèn)為腎虛是消渴病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵,先天稟賦不足,腎精虧虛,腎陰陽虛衰,封藏失司,上不能蒸騰津液于肺,下不能氣化達(dá)于膀胱,開闔失司,氣不化津,故見消渴諸癥,腎精虧損日久,精血難生,脈道不充,加之氣血津液不行,脈道瘀阻,結(jié)而成瘀,因此本研究以“腎虛血瘀”理論為基礎(chǔ),擬參茸地黃湯,本方由鹿茸、熟地、丹參、山藥、山萸肉、黃連、茯苓、牡丹皮、骨碎補(bǔ)組成,以補(bǔ)腎活血,添精益腎。

JAK2/STAT3信號(hào)通路是參與機(jī)體分化、代謝、血管再生與侵襲的重要信號(hào)通路[3],對(duì)氧化應(yīng)激及細(xì)胞自噬、增殖、凋亡等發(fā)揮重要作用[4]。內(nèi)源性酪氨酸激酶2(ja-nus kinase signal transducers 2,JAK2)是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduc-ers and activators of transcription 3,STAT3)為其受體,JAK2/STAT3信號(hào)通路的啟動(dòng)需要IL-6、TNF-α等炎癥因子的參與,其中IL-6等TH2族細(xì)胞因子抑制自噬,TNF-α等TH1族細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)自噬[5]。同時(shí),該通路的活化又可促進(jìn)大量炎癥因子的釋放,形成瀑布式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6]。當(dāng)炎癥基因表達(dá)的水平過高時(shí),通過激活自噬可抑制炎癥因子水平[7],減少組織損傷。自噬是存在于真核細(xì)胞中的一種程序化降解機(jī)制。自噬失衡參與了T2DM的發(fā)生發(fā)展[8-11]。Liang等[12]首次證實(shí)Beclin-1是一種自噬標(biāo)志性蛋白質(zhì),Beclin-1屬于酵母Atg6基因的同源物,為第一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的自噬基因[13],當(dāng)Beclin-1蛋白質(zhì)的BH3結(jié)構(gòu)與凋亡抑制蛋白質(zhì)B細(xì)胞淋巴瘤類蛋白質(zhì)的結(jié)合可抑制自噬的發(fā)生,而當(dāng)?shù)蛲鲆种频鞍譈淋巴瘤類蛋白質(zhì)從Beclin-1上脫落時(shí),自噬可被誘導(dǎo)[14]。微管相關(guān)蛋白 1A/1B-輕鏈 3(Microtubuleassociated protein 1A/1B-light chain 3,LC3)屬于自噬體膜上標(biāo)志性蛋白,其修飾對(duì)自噬體的形成至關(guān)重要[15-16],LC3的存在是胞漿到空泡靶向囊泡的必要條件[17],其表達(dá)情況在一定程度上可以反應(yīng)自噬體的數(shù)量,這與證實(shí)自噬存在具有密切相關(guān)性[18]。研究表明:細(xì)胞自噬是細(xì)胞器功能和胰島素信號(hào)的重要調(diào)節(jié)因子[19],抑制自噬能減緩因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而導(dǎo)致的胰島素受體水平減少[20]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)是胰島素敏感組織的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要介導(dǎo)胰島素作用下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),在肝臟組織葡萄糖利用中發(fā)揮限速作用[21],GLUT4在2型糖尿病小鼠的肝臟中表達(dá)降低,是肝臟胰島素抵抗的重要原因之一[22],自噬可通過胰島素信號(hào)通路達(dá)到對(duì)GLUT4蛋白的轉(zhuǎn)位(從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細(xì)胞膜)和GLUT4儲(chǔ)存囊泡釋放的影響[23]?;诖?,本研究基于JAK2/STAT3信號(hào)通路,探討參茸地黃湯影響自噬治療2型糖尿病的可能作用機(jī)制,為中醫(yī)藥防治2型糖尿病尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SCXK(吉)2018-0007。體質(zhì)量180-220 g,共80只,飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特殊病原體動(dòng)物(SPF)級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)室(許可證號(hào):SYXK(吉)2018-0013)。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

SD大鼠普通維持飼料購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SCXK(吉)2015-0005,成分:18%粗蛋白+4%粗脂肪+5%粗纖維+8粗灰分+1%鈣+0.6%磷+10%水分+0.82%賴氨酸+0.53%(蛋氨酸+胱氨酸);高脂飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0003,成分:67%維持飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉。

1.3 藥物及試劑

參茸地黃湯由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供,保存于4℃冰箱,參茸地黃湯藥物組成:鹿茸10 g、熟地20 g、丹參20 g、山藥20 g、山萸肉15 g、黃連15 g、茯苓15 g、牡丹皮15 g、骨碎補(bǔ)20 g。按比例混合中藥,水煎濾渣取汁,制成中藥溶液。鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H20023371)。鏈脲佐菌素(美國Sigma公司,貨號(hào)WXBC2044V);JAK2抗體(Proteintech,貨號(hào)17670-1-AP);STAT3抗體(Proteintech,貨號(hào)60199-1-1g);LC3抗體(Proteintech,貨號(hào) 14600-1-AP);Beclin-1抗體(Proteintech,貨號(hào)11306-1-AP);GLUT2抗體(Proteintech,貨號(hào)20436-1-AP );β-actin抗體(Proteintech,貨號(hào)600008-1-lg);WB羊抗兔IgG HRP標(biāo)記(Proteintech,貨號(hào)SA00001-2)。

1.4 儀器

全自動(dòng)生化分析儀(深圳雷杜生命科技,型號(hào)Chemray 800);病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司,型號(hào)RM2016);包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司;型號(hào)JB-P5);-80℃冰箱(深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司,型號(hào)DW-86L490J);高速冷凍離心機(jī)(DRAGONLAB,型號(hào)D3024R);電泳儀(BIOTED;型號(hào)1704486);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司;型號(hào)Tanon-1600R);電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;SQP)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,10只SD大鼠予普通維持飼料,其余70只SD大鼠予高脂飼料,所有SD大鼠均自由進(jìn)食水,高脂飼料喂養(yǎng)4周后,予進(jìn)食高脂飼料的70只SD大鼠禁食不禁水12 h,予鏈脲佐菌素(STZ)40 mg·kg-1單次腹腔注射,72 h后用羅氏血糖儀(ACCU-CHEK)及試紙測大鼠空腹尾靜脈血糖≥16.7 mmol·L-1[12],即為造模成功。

2.2 分組及給藥

10只SD大鼠為對(duì)照組,造模成功的2型糖尿病SD大鼠隨機(jī)分為4組,即模型組(12只)、參茸地黃湯低劑量組(12只)、高劑量組(12只),鹽酸二甲雙胍組(12只)??瞻讓?duì)照組SD大鼠予維持飼料,模型組、參茸地黃湯低、高劑量組、鹽酸二甲雙胍組大鼠繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng),各組大鼠均自由進(jìn)食水。分組后,模型組與對(duì)照組大鼠以等體積蒸餾水灌胃,參茸地黃湯低劑量組灌胃劑量為1.5 g·kg-1·d-1,高劑量組灌胃劑量為4.5 g·kg-1·d-1,鹽酸二甲雙胍組以鹽酸二甲雙胍片研磨成粉末,溶于蒸餾水配置鹽酸二甲雙胍藥物溶液,給藥劑量為 0.15 g·kg-1·d-1,各組每日固定時(shí)間灌胃,每日1次,均灌胃4周。

2.3 樣本制備

各組大鼠灌胃4周后,禁食不禁水12 h,大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL·100 g-1)腹腔注射麻醉,經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈取血,于10 mL離心管中靜置2 h,3500 r·min-1低溫高速離心15分min,取上層血清,放入2.5 mL離心管,置于-80℃冰箱保存待后續(xù)檢測。處死SD大鼠后,冰上取材,暴露SD大鼠腹腔及肝臟組織,迅速用鑷子及剪刀分離并取出肝臟組織,取出離體的肝臟組織迅速置于4%多聚甲醛固定液中固定,部分放入凍存管置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 檢測方法

2.4.1 一般狀態(tài)及體質(zhì)量檢測

觀察各組大鼠的活動(dòng)狀態(tài)、皮毛色澤及精神狀態(tài),從藥物干預(yù)第1周開始,每周測1次各組SD大鼠的體質(zhì)量,觀察各組SD大鼠體質(zhì)量變化。

2.4.2 血清學(xué)檢測

全自動(dòng)生化儀檢測空腹血糖(FBG)、糖化學(xué)清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、游離脂肪酸(FFA)??崭寡逡葝u素(INS),計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

2.4.3 HE染色

將大鼠肝臟組織切片用二甲苯、無水乙醇和酒精進(jìn)行脫蠟,脫蠟后用蒸餾水清洗,然后進(jìn)行蘇木素染色及伊紅染色,染色完成后進(jìn)行透明處理,并用中性樹膠封片。最后用顯微鏡鏡檢觀察SD大鼠肝臟組織形態(tài),并圖像采集分析。

2.4.4 Western blot法檢測 JAK2、STAT3、Beclin-1、LC3、GLUT2蛋白的表達(dá)

大鼠肝臟組織用預(yù)冷PBS清洗后分成小塊,置于勻漿管中,加入蛋白酶抑制劑,加入RIPA裂解液進(jìn)行勻漿。后放入裂解液讓肝臟組織完全裂解并以12000 r·min-14℃離心10 min得到總蛋白溶液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測取未變性的蛋白溶液濃度。蛋白質(zhì)溶液加入5×還原型蛋白上樣緩沖液,并置于沸水浴中15 min變性,然后在-20℃冰箱中保存。配置5%的濃縮膠,加入TEMED后立即混合均勻并灌膠,膠制備好后,準(zhǔn)備電泳。準(zhǔn)備好濾紙和PVDF膜,甲醇活化2 min,在盆里放入轉(zhuǎn)移液,300 mA恒流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜30 min。轉(zhuǎn)模時(shí)設(shè)備放入冰水中降溫。孵育槽中加入TBST,將轉(zhuǎn)印完的膜放入其中,清洗后,加入的脫脂奶粉,然后進(jìn)行封閉。按說明書稀釋并加入一抗、二抗,反復(fù)用TBST洗膜直至干凈。將PVDF膜的蛋白面朝上置于兩膜之間,進(jìn)行顯影和定影,根據(jù)不同的發(fā)光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布又符合方差齊性,使用單因素ANOVA分析,不符合正態(tài)分布,使用Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異有顯著意義。繪圖應(yīng)用GraphPad Prism 7軟件。

3 結(jié)果

3.1 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量的影響

3.1.1 參茸地黃湯對(duì)大鼠的一般狀態(tài)的影響

對(duì)照組SD大鼠精神狀態(tài)良好,反應(yīng)靈敏,皮毛有光澤;模型組的2型糖尿病SD大鼠倦怠嗜睡,動(dòng)作遲緩,皮毛脫落無光澤,參茸地黃湯低、高劑量組及鹽酸二甲雙胍組2型糖尿病SD大鼠活動(dòng)狀態(tài)、皮毛色澤以及精神狀態(tài)方面,均較模型組2型糖尿病SD大鼠改善,精神狀態(tài)好轉(zhuǎn),動(dòng)作靈敏度增加,皮毛脫落減少,整體狀況優(yōu)于模型組。

3.1.2 參茸地黃湯對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

造模成功后,予2型糖尿病SD大鼠參茸地黃湯低、高劑量及鹽酸二甲雙胍藥物干預(yù),從繪制的各組SD大鼠體質(zhì)量折線圖可以看出,對(duì)照組SD大鼠體質(zhì)量平穩(wěn)上升,模型組、參茸地黃湯低、高劑量組及鹽酸二甲雙胍組大鼠體質(zhì)量均呈下降趨勢,但各給藥組大鼠體質(zhì)量下降幅度均較模型組減慢(表1)。

3.2 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠糖、脂代謝的影響

3.2.1 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠糖代謝的影響

藥物干預(yù)4周后,與對(duì)照組比較,模型組大鼠FBG、GSP、FINS均顯著上升(P<0.05,P<0.01),參茸地黃湯低、高劑量組及鹽酸二甲雙胍組可顯著降低2型糖尿病大鼠FBG、GSP、FINS水平(P<0.05,P<0.01),計(jì)算大鼠HOMA-IR,與對(duì)照組比較,模型組大鼠HOMAIR顯著上升,參茸地黃湯低、高劑量組及鹽酸二甲雙胍組顯著下降(P<0.01)(表2)。

3.2.2 參茸地黃湯對(duì) SD 大鼠脂代謝的影響

藥物干預(yù)4周后,與對(duì)照組比較,模型組大鼠TG、CHO、LDL-C、FFA均顯著上升(P<0.05,P<0.01),參茸地黃湯低、高劑量組及鹽酸二甲雙胍組可顯著降低2型糖尿病大鼠TG、CHO、LDL-C、FFA水平(P<0.05,P<0.01)。與對(duì)照組比較,模型組大鼠HDL-C顯著下降,參茸地黃湯及鹽酸二甲雙胍組可提高HDL-C水平(P<0.01)(表3)。

3.3 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響

對(duì)照組SD大鼠肝臟組織整體結(jié)構(gòu)完整清晰,細(xì)胞排列緊密有序、大小均勻;模型組SD大鼠肝臟組織細(xì)胞排列散亂,可見大量脂肪空泡,細(xì)胞間隙擴(kuò)大;與模型組大鼠比較,參茸地黃湯低、高劑量組及鹽酸二甲雙胍組大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均有改善(圖1)。

3.4 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠肝臟組織JAK2、STAT3、Beclin-1、LC3、GLUT4蛋白表達(dá)的影響

3.4.1 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠肝臟組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組SD大鼠肝臟組織JAK2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),與模型組比較,參茸地黃湯低、高劑量組及鹽酸二甲雙胍組JAK2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),中藥高劑量組升高較西藥組更為明顯(P<0.01)(圖2)。

表1 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠體質(zhì)量的影響(,g)

表1 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠體質(zhì)量的影響(,g)

注:中藥組即參茸地黃湯;西藥組即鹽酸二甲雙胍;與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;給藥組與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;中藥組與西藥組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

給藥第4周410.42±7.33 307.21±8.84**329.83±15.06**351.08±16.56**#337.70±8.98**組別對(duì)照組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組西藥組例數(shù)10 8 9 1 0 10給藥第1周330.37±4.19 370.40±8.07**364.50±5.74**360.91±8.92**353.46±9.95*給藥第2周355.80±4.44 334.12±8.02*345.72±6.68 352.02±8.74 345.32±9.20給藥第3周386.40±5.35 321.82±8.01**330.50±8.53**345.40±14.57*337.59±10.83**

表2 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠糖代謝的影響()

表2 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠糖代謝的影響()

注:中藥組即參茸地黃湯;西藥組即鹽酸二甲雙胍。與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。給藥組與模型組比較,#P<0.05,##P < 0.01,參茸地黃湯組與鹽酸二甲雙胍組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

HOMA-IR 1.81±0.08 11.83±1.35**6.76±0.79**##6.29±1.16**##7.16±0.96**##組別對(duì)照組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組西藥組例數(shù)10 8 9 1 0 10 FBG(mmol·L-1)5.53±0.27 24.36±1.17**19.20±1.73**#14.91±2.59**##17.17±2.11**##GSP(mmol·L-1)1.58±1.12 2.42±0.17*1.96±0.17#1.97±0.12#1.94±0.15#FINS(mU·L-1)7.88±0.12 11.86±0.74**8.91±0.39#8.47±0.56##9.40±1.19#

表3 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠脂代謝的影響(,mmol·L-1)

表3 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠脂代謝的影響(,mmol·L-1)

注:中藥組即參茸地黃湯;西藥組即鹽酸二甲雙胍;與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。;給藥組與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;參茸地黃湯組與鹽酸二甲雙胍組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

FFA 0.85±0.14 1.46±0.15*1.05±0.09#0.93±0.07##1.24±0.13*組別對(duì)照組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組西藥組例數(shù)10 8 9 1 0 10 TG 0.91±0.12 1.45±0.22*1.06±0.08 1.05±0.07 1.05±0.20 CHO 1.97±1.13 4.72±0.33**3.22±0.14**##3.19±0.11**##3.43±0.16**##HDL-C 1.62±0.20 0.87±0.06**1.05±0.06**▲1.46±0.05##1.49±0.16##LDL-C 0.41±0.05 1.35±0.14*0.62±0.10##0.56±0.4##0.66±0.14##

與對(duì)照組相比,模型組SD大鼠肝臟組織STAT3顯著降低(P<0.01),與模型組比較,參茸地黃湯低、高劑量組及鹽酸二甲雙胍組STAT3顯著升高(P<0.01),其中西藥組升高較中藥組明顯(P<0.01,P<0.05)(圖2)。

3.4.2 參茸地黃湯對(duì) SD 大鼠肝臟組織Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組SD大鼠肝臟組織Beclin-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),與模型組比較,參茸地黃湯高劑量組及鹽酸二甲雙胍組Beclin-1蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01,P<0.05),鹽酸二甲雙胍組Beclin-1蛋白表達(dá)水平下降與中藥組有顯著差異(P<0.01)(圖3)。

與對(duì)照組相比,模型組SD大鼠肝臟組織LC3Ⅱ/Ⅰ顯著升高(P<0.01),與模型組比較,參茸地黃湯低、中劑量組及鹽酸二甲雙胍組LC3II/I顯著降低(P<0.01),參茸地黃湯低、中劑量組的LC3II/I降低較鹽酸二甲雙胍組更為明顯(P<0.01)(圖3)。

3.4.3 參茸地黃湯對(duì)SD大鼠肝臟組織GLUT4蛋白表達(dá)的影響

圖1 各組SD大鼠肝臟組織HE染色(×200)

圖2 各組SD大鼠肝臟組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)情況

圖3 各組SD大鼠肝臟組織Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)情況

圖4 各組SD大鼠肝臟組織GLUT4蛋白表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組SD大鼠肝臟組織GLUT4蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),與模型組比較,參茸地黃湯低、高劑量組及鹽酸二甲雙胍組GLUT4蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),鹽酸二甲雙胍組GLUT4蛋白表達(dá)水平與中藥組比差異顯著(P<0.01)(圖4)。

4 討論

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種慢性代謝性疾病,發(fā)病早期癥狀不明顯,往往被人忽視,導(dǎo)致致殘、致死率不容樂觀[24]?!锻馀_(tái)秘要·消渴消中》中記載:“…腎氣虛耗故也,下焦生熱,熱則腎燥,腎燥則渴?!蹦I氣虧耗是消渴病的主要病機(jī),日久氣血虛損,脈道不充,氣機(jī)運(yùn)行無力,化而為瘀,以致上無法散布津液潤澤于肺,下不能氣化于膀胱,因此常表現(xiàn)為多飲多食多尿。本研究以“腎虛血瘀”理論指導(dǎo)擬參茸地黃湯以補(bǔ)腎活血,組方鹿茸10 g、熟地20 g、丹參20 g、山藥20 g、山萸肉15 g、黃連15 g、茯苓15 g、牡丹皮15 g、骨碎補(bǔ)20 g,且其中多味藥被證實(shí)有良好的改善2型糖尿病的作用[25-30]。鹿茸性甘、咸、溫,歸肝腎經(jīng),補(bǔ)腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨,熟地性甘,微溫,入心肝腎經(jīng),滋腎陰、補(bǔ)精血,二藥合用以補(bǔ)腎益髓,共為君藥。丹參苦、微寒,入心肝經(jīng),活血通絡(luò),山藥甘、溫、平,入肺脾腎經(jīng),健脾補(bǔ)肺,固腎益精,山萸肉性酸、澀、微溫,入肝腎經(jīng),補(bǔ)益肝腎,收澀固脫,黃連味苦,性寒、歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng),清熱燥濕,瀉火解毒?!睹t(yī)別錄》:“止消渴,利骨”。山藥、山萸肉補(bǔ)益三臟之陰,丹參、黃連活血祛瘀,且使補(bǔ)而不滯,五藥共為臣藥;茯苓入脾腎經(jīng),利水滲濕,健脾寧心,牡丹皮入肝、腎經(jīng),清熱涼血,活血化瘀,二藥共為佐藥;骨碎補(bǔ)入肝、腎經(jīng),補(bǔ)腎強(qiáng)骨,入腎經(jīng),引諸藥入腎,為本方之使,全方陰陽并補(bǔ),補(bǔ)中有散,共奏補(bǔ)腎活血之效。

鹽酸二甲雙胍屬于雙胍類降糖藥物,通過減少糖異生、增加肝糖原儲(chǔ)存來治療糖尿病,研究表明,二甲雙胍具有明確的調(diào)控自噬的作用[31]。本研究中,STZ聯(lián)合高脂飼料誘導(dǎo)的2型糖尿病SD大鼠的肝臟組織JAK2、STAT3蛋白水平表達(dá)下降,予參茸地黃湯及鹽酸二甲雙胍后,JAK2、STAT3表達(dá)水平上升,其中JAK2蛋白表達(dá)參茸地黃湯高劑量組優(yōu)于鹽酸二甲雙胍組(P<0.01),STAT3蛋白表達(dá)鹽酸二甲雙胍組優(yōu)于參茸地黃湯組(P<0.05),實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠的肝臟組織Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)升高,自噬水平增強(qiáng),而予參茸地黃湯及鹽酸二甲雙胍后,大鼠Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平下降,鹽酸二甲雙胍組Beclin-1蛋白表達(dá)下降較參茸地黃湯組明顯(P<0.01),參茸地黃湯組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)下降優(yōu)于鹽酸二甲雙胍組(P<0.01),各給藥組肝臟組織的過度自噬均緩解。在本研究中,模型組大鼠肝臟組織GLUT4表達(dá)下降,參茸地黃湯及鹽酸二甲雙胍給藥干預(yù)后,各給藥組GLUT4表達(dá)均提高(P<0.01),鹽酸二甲雙胍組優(yōu)于參茸地黃湯組(P<0.01),提示糖尿病大鼠肝臟組織的胰島素抵抗得到改善。

以上研究表明,參茸地黃湯治療2型糖尿病的機(jī)制可能是通過干預(yù)JAK2/STAT3信號(hào)通路,緩解2型糖尿病SD大鼠肝臟組織的過度自噬,提高GLUT4表達(dá)水平,改善胰島素抵抗實(shí)現(xiàn)的,為中醫(yī)防治2型糖尿病的現(xiàn)代化研究提供參考,但其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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