桂 春，明小芳，鄒 雪，楊曉利，張秀橋，鄭 新

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065）

據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)報道，2020年全世界有1900余萬新發(fā)癌癥病例，其中女性新發(fā)癌癥病例約占一半[1]。由于全球人口老齡化、環(huán)境污染、肥胖等原因，預(yù)計到2040年，癌癥新發(fā)病例將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)增長50%，惡性腫瘤對人類健康的危害非常大[1]。其中乳腺癌新發(fā)病例呈爆發(fā)式增長，已取代肺癌成為全球發(fā)病第一的惡性腫瘤，發(fā)病率約30%[2]。中國每年確診惡性腫瘤患者中有近9%為乳腺癌病人，由此可見乳腺癌對人類生命健康的危害越來越大[2]。

1963年比利時克里斯蒂安提出“自噬”概念，到2016年日本學(xué)者大禹良點(diǎn)因發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞自噬的生物學(xué)機(jī)制而獲得諾貝爾生理獎[3]，自此開啟了細(xì)胞自噬在生命學(xué)科熱門研究的高峰時期[4]。近年來，中草藥提取物或其有效成分在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自噬及信號通路等相關(guān)方面的研究持續(xù)增加，且在乳腺癌方面的報道也越來越多。如澤瀉醇A、粉防己堿、常山酮、麥冬皂苷等均可通過自噬途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞死亡[5]。

現(xiàn)代研究表明中藥能通過多靶點(diǎn)、多途徑治療乳腺癌，彌補(bǔ)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方式治療所產(chǎn)生的耐藥性、毒副作用大等問題，發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢[6]。雄黃為礦物藥硫化物類雄黃族雄黃，具有解毒殺蟲、燥濕祛痰、截瘧等功效，主要成分為二硫化二砷（As2S2）。因其具有較大的毒性、較低的溶解度和生物利用度等缺點(diǎn)，在臨床上的使用受到較大限制[7]。將雄黃納米化后，不僅可以減少用藥量，而且可以提高其溶解度及生物利用度[8]。研究表明納米雄黃具有治療白血病、抗肺癌和抗肝癌作用[9-10]；納米雄黃顆?？赏ㄟ^抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和血管生成來抑制乳腺癌小鼠腫瘤的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。課題組前期制備了納米雄黃酸飛品（Acid Cleaning-Realgar Nanoparticles，NRPP），并對其抗腫瘤活性進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖[12-14]。為進(jìn)一步探究NRPP對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，本論文選擇了三種乳腺癌細(xì)胞做活性篩選，并分別從凋亡和自噬角度初步開展其機(jī)制研究，以期為今后開發(fā)治療乳腺癌的藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231及MDAMB-435S購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 藥物與試劑

礦物藥雄黃購自湖南石門，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)張秀橋教授鑒定為硫化物類雄黃族雄黃。

CCK-8（批號：67120500，Biosharp公司）；Hoechst 33258染料（批號：B2883，Sigma公司）；電鏡固定液和812包埋劑購自美國SPI公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號：SA00001-2，Proteintech公司）；LC3抗體（批號：14600-1-AP，Proteintech公司）、GAPDH抗體（批號：8884S，CST公司）、p62抗體（批號：39749S，CST公司）、p-Akt抗體（批號：4060Ss，CST公司）、p-mTOR抗體（批號：5536s，CST公司）、p-PI3K抗體（批號：ab182651，abcam公司）、COXIV抗體（批號：11242-1-AP，Proteintech公司）。

1.3 儀器

iMark酶標(biāo)儀、電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Tecnai G2 20 TWIN型透射電子顯微鏡（美國FEI公司）；FluorChem FC3型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（美國Proteinsimple公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 NRPP的制備

將雄黃藥材研磨成細(xì)粉，過200目篩。采用高能球磨機(jī)對雄黃粉體進(jìn)行球磨，得到納米雄黃生品，繼續(xù)酸水飛法重復(fù)操作10次，合并所有懸液并傾去上清液，將沉淀抽濾并真空干燥即得NRPP。用PBS配成濃度為2.0 mg·mL-1的NRPP藥物母液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，于4℃儲存?zhèn)溆肹11]。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清和100 U·mL-1青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7、MDA-MB-231及MDAMB-435S細(xì)胞，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80%左右，消化傳代培養(yǎng)，每隔2-3 d傳代一次。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個·mL-1。設(shè)置NRPP濃度為0、10、20、40、80 μg·mL-1，分別給藥12、24和48 h。藥物作用相應(yīng)的時間后每孔加入CCK-8試劑10 μL避光孵育1 h，450 nm波長下用酶標(biāo)儀測量各孔光密度（OD），并計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=[1-（OD(加藥)-OD（調(diào)零組））（/OD（空白）-OD（調(diào)零組））]×100%。

2.4 Hoechst 33258法染色前后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×105個·mL-1接種于6孔板中，設(shè)置NRPP濃度為0、20、40、60、80 μg·mL-1，藥物作用12 h后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，拍照記錄。各組加入細(xì)胞固定液固定，PBS潤洗，33258染液室溫下染色再潤洗，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2.5 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105個·mL-1接種于培養(yǎng)皿中，設(shè)置對照組和NRPP給藥組（40 μg·mL-1），藥物作用9 h，電鏡固定液固定、離心，用含鋨酸的PBS固定，依次用乙醇及丙酮脫水、包埋、切片，染色常溫干燥過夜，透射電子顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞自噬及通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×105個·mL-1接種于培養(yǎng)皿中，藥物作用適當(dāng)時間；加入裂解液提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉后加入稀釋后的一抗于4℃孵育過夜，用TBST洗滌后加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL顯色后使用凝膠成像系統(tǒng)顯影，并采用Image J v1.51軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參（GAPDH）的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 NRPP對MDA-MB-435S細(xì)胞增殖的影響

3.1.1 NRPP 對 MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，在NRPP終濃度10-120 μg·mL-1內(nèi)，NRPP對3種乳腺癌細(xì)胞的抑制率隨著藥物濃度或作用時間的增加逐漸增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），且具有劑量依賴性。當(dāng)藥物干預(yù)時間為12 h和24 h時，MDA-MB-231細(xì)胞IC50值最小，分別為43.84±2.63 μg·mL-1、34.61±1.72 μg·mL-1，當(dāng)藥物干預(yù)時間為48 h時，MDA-MB-435S細(xì)胞的IC50值最小，為23.06±1.29 μg·mL-1，如表1所示。結(jié)果提示：NRPP可抑制MDA-MB-435S細(xì)胞增殖。

3.1.2 NRPP對MDA-MB-435S細(xì)胞形態(tài)的影響

結(jié)果如圖2所示，在熒光顯微鏡下觀察，藥物干預(yù)24 h，對照組細(xì)胞貼壁生長，排列緊密且形態(tài)良好呈正常梭形；隨著NRPP（10、20、40、80 μg·mL-1）作用濃度的增大，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞間間隙增大，細(xì)胞逐漸皺縮、變圓、破碎。結(jié)果提示：NRPP可抑制MDAMB-435S細(xì)胞增殖。

3.2 NRPP對MDA-MB-435S細(xì)胞凋亡的影響

3.2.1 NRPP對MDA-MB-435S細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響

結(jié)果如圖3所示，在熒光倒置顯微鏡下觀察，藥物干預(yù)12 h，對照組細(xì)胞貼壁生長，排列緊密且形態(tài)良好呈正常梭形；隨著NRPP（10、20、40、80 μg·mL-1）作用濃度的增大，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞間間隙增大，有呈現(xiàn)亮藍(lán)色皺縮的細(xì)胞，但未見明顯的細(xì)胞凋亡小體。結(jié)果證實(shí)：NRPP可抑制MDA-MB-435S細(xì)胞增殖，凋亡現(xiàn)象不明顯。

表1 NRPP對3種乳腺癌細(xì)胞干預(yù)12、24和48 h的IC50

圖1 NRPP對MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-435S細(xì)胞增殖的影響

圖2 熒光顯微鏡下觀察MDA-MB-435S細(xì)胞形態(tài)（×100）

3.2.2 NRPP對MDA-MB-435S細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖4所示，當(dāng)藥物作用時間為9 h，隨著NRPP（0、10、20、40、80 μg·mL-1）劑量增大，cleaved-PARP蛋白相對表達(dá)量上升趨勢不明顯，且無顯著性；Bcl-2蛋白相對表達(dá)量變化不明顯。當(dāng)NRPP劑量為80 μg·mL-1，隨著作用時間（0、1、3、6、9 h）的延長，cleaved-PARP蛋白相對表達(dá)量變化不明顯；Bcl-2蛋白相對表達(dá)量呈下降趨勢（P＜0.01）。結(jié)果提示：NRPP誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象不明顯。

3.3 NRPP對MDA-MB-435S細(xì)胞自噬的影響

3.3.1 NRPP對MDA-MB-435S細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖3 熒光倒置顯微鏡下觀察MDA-MB-435S細(xì)胞凋亡現(xiàn)象（×200）

圖4 NRPP對凋亡蛋白Bcl-2和cleaved-PARP表達(dá)水平的影響

結(jié)果如圖5所示，在透射電鏡下觀察，對照組細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體等結(jié)構(gòu)良好；NRPP（40 μg·mL-1組）細(xì)胞器明顯減少，線粒體空泡化，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)許多呈散在分布的囊泡樣結(jié)構(gòu)，包裹許多內(nèi)源性物質(zhì)，并可見囊泡樣的膜結(jié)構(gòu)，形成自噬體。結(jié)果提示：NRPP可能誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞發(fā)生自噬。

3.3.2 NRPP對MDA-MB-435S細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖6所示，當(dāng)藥物作用時間為9 h，隨著NRPP（0、10、20、40、80 μg·mL-1）劑量增大，p62蛋白相對表達(dá)量逐漸下降（P＜0.01）；LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達(dá)量逐漸上升。當(dāng) NRPP 劑量為 80 μg·mL-1，隨著作用時間（0、1、3、6、9 h）的延長，p62蛋白相對表達(dá)量呈下降趨勢（P＜0.05）；LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達(dá)量逐漸上升（P＜0.01）。結(jié)果提示：NRPP可誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞發(fā)生自噬。

3.3.3 NRPP對MDA-MB-435S細(xì)胞自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖7所示，當(dāng)藥物作用時間為9 h，隨著NRPP（0、10、20、40、80 μg·mL-1）劑量增大，p-PI3K和p-Akt蛋白相對表達(dá)量變化不明顯，且無顯著性；p-mTOR蛋白相對表達(dá)量有下降趨勢（P＜0.01）。當(dāng)NRPP劑量為80 μg·mL-1，隨著作用時間（0、1、3、6、9 h）的延長，p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量變化均不明顯，且無顯著性。結(jié)果提示：NRPP誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞自噬與PI3K/Akt/mTOR信號通路關(guān)系不明顯。

結(jié)果如圖8所示，藥物作用時間為9 h，隨著NRPP（0、20、40、80 μg·mL-1）劑量增大，COXIV蛋白相對表達(dá)量逐漸下降（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果提示：NRPP可能通過線粒體自噬誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞死亡。

圖5 透射電鏡下觀察MDA-MB-435S細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×1700和×5000）

圖6 NRPP對p62和LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平的影響

圖7 NRPP對PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)水平的影響

圖8 NRPP對線粒體自噬蛋白C OXIV表達(dá)水平的影響

4 討論

細(xì)胞自噬與凋亡控制著生物體內(nèi)細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)，是細(xì)胞程序性死亡的兩種方式，為人體生命活動不可或缺的過程。隨著現(xiàn)代生物醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，納米技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，目前關(guān)于將雄黃納米化來提升其生物利用率、減毒增效、增強(qiáng)靶向性等優(yōu)點(diǎn)已得到多研究的證實(shí)。王濤[15]研究發(fā)現(xiàn)相較于原藥雄黃，親水性納米雄黃制劑在水中的分散性更高，生物利用度增大；以小鼠三陰性乳腺癌（T41細(xì)胞和巨噬細(xì)胞RW264.7）移植瘤模型和慢性髓系白血病為對象進(jìn)行藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示親水性納米雄黃制劑可有效降低白血病細(xì)胞存活率，促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期；王勝玫等[9]通過實(shí)驗(yàn)證明雄黃納米化后增加了其水溶性，提高了生物利用率；隨著納米雄黃濃度的升高，對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用加強(qiáng)。本課題組前期研究并制備了納米雄黃（NRPP），在急性毒性、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、抗腫瘤活性等方面開展了系列研究[8,10-12]，證實(shí)了將雄黃納米化后其溶解度提高，毒性降低，致使乳腺癌細(xì)胞對其更加敏感。

為進(jìn)一步確定NRPP對乳腺癌細(xì)胞活性的影響并探究其作用機(jī)理，本論文中首先采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測了NRPP對3種人源性乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NRPP對三種乳腺癌細(xì)胞增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，且在干預(yù)細(xì)胞48 h時，對MDA-MB-435S細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，且藥物對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50值較低。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以MDA-MB-435S細(xì)胞為受試對象，進(jìn)一步探索NRPP抗乳腺癌的作用機(jī)制，尋找作用靶點(diǎn)，為后期深入信號通路研究奠定基礎(chǔ)。

采用Hoechst 33258染色，觀察NRPP對MDAMB-435S細(xì)胞增殖的影響，以及凋亡發(fā)生時的形態(tài)學(xué)現(xiàn)象，Western blot法檢測凋亡標(biāo)志性蛋白cleaved-PARP和抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平。結(jié)果顯示NRPP對MDA-MB-435S細(xì)胞增殖有較顯著的抑制作用，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，但凋亡現(xiàn)象不明顯，未見明確的凋亡小體；提示NRPP抑制MDA-MB-435S細(xì)胞增殖的作用靶點(diǎn)可能不是凋亡途徑。為繼續(xù)尋找NRPP抗乳腺癌的作用靶點(diǎn)，作者從細(xì)胞自噬的角度展開研究，分別對細(xì)胞自噬形態(tài)學(xué)、標(biāo)志性自噬蛋白、信號通路方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

采用透射電子顯微鏡觀察自噬形態(tài)學(xué)現(xiàn)象，給藥組實(shí)驗(yàn)結(jié)果中觀察到線粒體空泡、死亡細(xì)胞數(shù)量增多、受損傷的線粒體及自噬體等現(xiàn)象，提示NRPP可以誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞自噬死亡。微管相關(guān)蛋白輕鏈LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)量大小可作為自噬的標(biāo)志物來反映細(xì)胞內(nèi)自噬活性，在自噬形成時LC3-Ⅰ會酶解轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，LC3Ⅱ/Ⅰ比值大小與自噬活性呈正相關(guān)[16-18]。p62為一種泛素結(jié)合蛋白，在LC3作用域（LIR）內(nèi)與LC3蛋白結(jié)合，還可作為自噬體與底物之間的適配蛋白，參與自噬調(diào)節(jié)過程[19-21]，在細(xì)胞發(fā)生自噬過程中扮演重要角色。故文中運(yùn)用Western blot法檢測自噬金標(biāo)桿蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白過表達(dá)，提示NRPP可通過誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞發(fā)生自噬，從而抑制細(xì)胞的增殖。

NRPP通過何種信號通路誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞發(fā)生自噬。查閱文獻(xiàn)可知PI3K/Akt/mTOR途徑為細(xì)胞自噬經(jīng)典途徑[22]，當(dāng)信號通路被抑制時激活自噬。Yang等[23]研究發(fā)現(xiàn)納米雄黃可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路來抑制肺癌干細(xì)胞增殖，且從體內(nèi)外兩個方面驗(yàn)證了該結(jié)果；丹參酮Ⅰ可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導(dǎo)卵巢癌A2780和ID-8細(xì)胞凋亡并促進(jìn)自噬，進(jìn)而抑制腫瘤生長[24]。故本論文首先檢測了PI3K/Akt/mTOR的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示磷酸化p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量變化均不顯著。納米雄黃的主要成分為As2S2，是一種砷劑。砷暴露能使線粒體空泡化，嵴腫脹、破裂和消失，有研究表明線粒體自噬可不依賴于PI3K/Akt/mTOR途徑產(chǎn)生[25]。則我們考慮NRPP不通過經(jīng)典途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，而是通過線粒體自噬呢？結(jié)合前期熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察MDA-MB-435S細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化，已觀察到NRPP干預(yù)后細(xì)胞出現(xiàn)線粒體空泡、線粒體受損，提示NRPP可能通過線粒體自噬誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞死亡，故繼續(xù)開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證此推測。

COX Ⅳ蛋白是一種呼吸鏈復(fù)合物，位于線粒體內(nèi)膜上[26-27]。當(dāng)線粒體受損傷時，COX Ⅳ脫離線粒體，表達(dá)水平下降[28]。故COX Ⅳ常被作為線粒體自噬的標(biāo)志蛋白。Western blot實(shí)驗(yàn)提示隨著NRPP作用濃度的升高，COX Ⅳ表達(dá)逐漸降低，并呈現(xiàn)濃度依賴性（P＜0.05），證實(shí)NRPP可通過線粒體自噬誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞死亡。

綜上所述，本論文探究NRPP抑制三種乳腺癌細(xì)胞的增殖，找到了相對敏感的細(xì)胞株MDA-MB-435S；然后對NRPP抑制MDA-MB-435S細(xì)胞增殖的作用靶點(diǎn)展開研究，發(fā)現(xiàn)其可以通過自噬誘導(dǎo)死亡而非凋亡；進(jìn)而對其自噬的信號通路深入研究，發(fā)現(xiàn)NRPP誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞發(fā)生可能是線粒體自噬而非PI3K/Akt/mTOR自噬經(jīng)典途徑。

本文從抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和自噬3個方面進(jìn)行了研究，明確了NRPP可通過線粒體自噬途徑誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞自噬性死亡，該結(jié)果為本課題組后續(xù)展開進(jìn)一步體內(nèi)驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)，為今后NRPP抗乳腺癌新藥研發(fā)提供了依據(jù)。