＊林曉宇 甘莉 陳祖亮

（福建師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院福建省污染控制與資源循環(huán)利用重點實驗室 福建 350007）

在自然環(huán)境中，重金屬不能自行降解，會長期以各種形式存在并滲入到環(huán)境中，不斷累積遷移，造成危害[1]。由于礦產(chǎn)資源開采以及養(yǎng)殖業(yè)中使用添加劑等原因?qū)е聫U水中常有銅、鋅的存在。作為重金屬的一員，他們即使在低濃度下也具有危害和強毒性。水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水帶來的銅和鋅污染，會通過生物積累沿著食物鏈不斷放大。人們食用被重金屬污染的食物后，會導(dǎo)致有毒物質(zhì)進入人體，對自身健康造成影響。硝酸鹽普遍存在于水環(huán)境、生物體與食物中。廢水中的硝酸鹽化合物大多數(shù)是可溶的，因此硝酸鹽能夠在水體和土壤中迅速遷移擴散，導(dǎo)致大規(guī)模的污染。各種含有大量硝酸鹽的食物被人食用后會在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽會和人體內(nèi)的血液反應(yīng)形成高鐵血紅蛋白，使得血液失去攜氧的能力，對人體健康造成嚴(yán)重影響[2]。

近年來，隨著工業(yè)和經(jīng)濟的快速發(fā)展，水體硝酸鹽污染日益嚴(yán)重，含有硝酸鹽廢水的處理也愈發(fā)受到人們的重視[3]。我國東南沿海地區(qū)的水產(chǎn)品總產(chǎn)量居全國前列，然而養(yǎng)殖業(yè)的迅速崛起也帶來了一系列污染源[4]。氮、磷等物質(zhì)以無機或者有機污染的形式進入養(yǎng)殖水體，隨著養(yǎng)殖時間的增加，污染物不斷累積，最終導(dǎo)致水體硝酸鹽含量的增加[5]。此外，還有相關(guān)研究表明，水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的重金屬濃度遠大于非養(yǎng)殖區(qū)。水體硝酸鹽污染和重金屬污染的累加會對水產(chǎn)品的質(zhì)量和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的負(fù)面影響，最終危害人類的生存環(huán)境[6]。

目前，處理養(yǎng)殖廢水的傳統(tǒng)方法包括電解、離子交換和化學(xué)沉淀等方法。相比于傳統(tǒng)方法，微生物法因為經(jīng)濟、高效而得到廣泛應(yīng)用。近年來，有學(xué)者研究了重金屬與硝酸鹽共存時反硝化菌對兩者的去除效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)重金屬離子達到一定濃度時，能夠抑制微生物的生長。在相同濃度下，重金屬的毒性大小為Cu2+＞Cd2+＞Zn2+＞Ni2+，不同重金屬在不同濃度水平下對各種反硝化菌的生長和脫氮性能的影響不同[7]。在重金屬沖擊對反硝化菌影響的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)Zn2+對菌株的生長影響較小，甚至略微有促進作用，同時對硝酸鹽降解過程的影響也較小，而Cu2+和Cd2+對硝酸鹽的降解有很強的抑制作用[8]。同樣的，不同重金屬之間也存在協(xié)同、競爭及加和等作用，復(fù)合重金屬污染中各組分會對微生物法處理廢水產(chǎn)生一系列影響。

利用微生物法處理硝酸鹽和重金屬污染具有高效低耗的特點。然而，對于重金屬和硝酸鹽共存時各自的去除效率、重金屬對硝酸鹽去除的影響以及不同重金屬之間的相互影響還缺乏系統(tǒng)研究。因此，本文在銅、鋅兩種重金屬離子和硝酸鹽共存的情況下，對反硝化脫氮副球菌Paracoccus sp.YF1的脫氮過程展開研究。

1.材料與方法

(1)實驗試劑和儀器

①實驗試劑：氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硝酸鉀和葡萄糖（AR）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母膏和蛋白胨（BR）購自北京奧博星生物科技有限公司；磺胺、氯化鋅和氯化銅（AR）購自西隴科學(xué)股份有限公司；鹽酸、磷酸和乙醇（AR）購自廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心。

②試驗儀器：紫外可見分光光度計（UV 9000）：上海元析儀器有限公司；火焰原子吸收光譜儀（PinAAcle 900F）：美國珀金埃爾默儀器有限公司；手提式高壓蒸汽滅菌器（DSX-30L-I）：上海申安醫(yī)療器械廠；立式雙層智能全溫型培養(yǎng)搖床（BSD-YX2400）：上海博訊實業(yè)有限公司；凈化工作臺（SW-CJ-EF）：上海博訊實業(yè)有限公司。

(2)菌株的培養(yǎng)

從來自某污水處理廠反硝化段的污泥樣品中分離得到一株脫氮菌株YF1，經(jīng)16srDNA和生理生化鑒定，認(rèn)為其屬于脫氮副球菌屬。將菌株YF1在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，經(jīng)離心洗滌后，通過紫外分光光度計在600nm處測量細胞培養(yǎng)液的光密度，用無菌水將其稀釋到吸光度為0.7的菌懸液備用。LB富集培養(yǎng)基配方為：含有5.0g/L酵母膏、10.0g/L蛋白胨和10.0g/L的NaCl；脫氮培養(yǎng)基的配方為：含有1.0g/L的KH2PO4、1.0g/L的K2HPO4、0.49g/L的MgSO4、0.51g/L的KNO3、4.0g/L的C6H12O6以及不同濃度的重金屬離子。按體積比1.5%的接種量將YF1的菌液（OD600=0.7）接種到脫氮培養(yǎng)基中。

(3)實驗方法

為了探究不同濃度重金屬對菌株YF1脫氮的影響，進行了不同影響因素的批量實驗。按照預(yù)定時間，分別在0h、8h、16h、24h和32h的時候，在UV 9000紫外分光光度計上測定相應(yīng)脫氮培養(yǎng)基中細胞培養(yǎng)液的光密度值（OD600）。利用火焰原子吸收光譜儀分別檢測溶液中重金屬Cu(II)和Zn(II)的剩余含量，利用紫外分光光度法測定溶液中硝酸鹽的含量。相關(guān)計算公式為：

其中，C0為培養(yǎng)基內(nèi)初始的重金屬或硝態(tài)氮的濃度；Ct為微生物脫氮后培養(yǎng)基內(nèi)剩余的重金屬或硝態(tài)氮的濃度。批量實驗在含有25mL脫氮培養(yǎng)基的50mL錐形瓶中進行。使得脫氮培養(yǎng)基中硝酸鹽的初始濃度固定為1.0mM，脫氮培養(yǎng)基中Cu(II)的初始濃度固定為0.02mM，脫氮培養(yǎng)基中Zn(II)的初始濃度分別為0.1mM、0.3mM和0.5mM。將接種了Paracoccus sp.YF1菌體的錐形瓶放置于150rpm，30℃的恒溫培養(yǎng)搖床上，分別在0h、8h、16h、24h和32h各取一次樣，測定相應(yīng)時間段的細胞光密度值，硝酸鹽濃度以及Zn(II)的剩余含量。

2.結(jié)果與討論

(1)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用凍融法提取細菌YF1的基因組，再利用16SrDNA的特異引物對菌株YF1的總DNA進行PCR擴增，獲得了長為1421bp的有效目標(biāo)片段。將擴增后得到的菌株YF1的序列在NCBI上進行BLAST程序比對。如圖1所示，基于16SrDNA基因序列，利用MAGE X程序構(gòu)建了菌株YF1的系統(tǒng)發(fā)育樹。通過比較數(shù)據(jù)庫中序列的相似性，發(fā)現(xiàn)菌株YF1與Paracoccus sp.JF2（MK542823.1）的基因序列同源性高達100%。結(jié)合前期對菌株YF1的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定，初步鑒定該菌株屬于脫氮副球菌屬，將其命名為Paracoccus sp.YF1。

圖1 利用16S rRNA構(gòu)建的Paracoccus sp.YF1的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

(2)不同濃度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存條件下Paracoccus sp.YF1的生長情況

不同濃度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存條件下對Paracoccus sp.YF1的生長影響見圖2?？梢园l(fā)現(xiàn)0～8h菌株處于適應(yīng)期，在8～16h，菌株處于對數(shù)生長期，16h之后菌株進入平穩(wěn)期。從圖中可以看出，在只添加Zn(II)的情況下，菌株生長狀況良好，增長量略高于控制組，說明低濃度的Zn(II)可以促進菌株YF1的生長。然而，在添加Zn(II)的情況下再加入0.2mM的Cu(II)，吸光度明顯下降，說明混合金屬對反硝化菌的生長存在較強的抑制作用。

圖2 不同濃度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存條件下菌株YF1的生長曲線

(3)不同濃度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存條件下對菌株除鋅的影響

圖3是不同濃度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存條件下Paracoccus sp.YF1對除鋅的影響。在單獨存在Zn(II)的條件下，該菌對Zn(II)的去除率普遍較低，其中，當(dāng)Zn(II)為0.3mM時，菌體生長狀況最好，其去除Zn(II)的能力也相對其它兩組高，此時鋅的最高去除率為14.2%。而當(dāng)Cu(II)、Zn(II)共存時，Paracoccus sp.YF1對Zn(II)的去除率有所增高，其中，0.3mM Zn(II)和0.02mM Cu(II)共存的情況，Paracoccus sp.YF1對Zn(II)的去除率最高，達到了17.3%。不同金屬混合后，微生物的吸附量會大于單組份的吸附量。實驗結(jié)果也表明，0.02mM Cu(II)協(xié)調(diào)作用會促進Paracoccus sp.YF1對0.3mM Zn(II)的去除。

圖3 不同濃度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存條件下對YF1除鋅的效果

(3)不同濃度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存條件下對菌株脫氮的影響

由圖2可見，不含Cu(II)、Zn(II)的控制組在0～8h有緩慢降解的趨勢，硝態(tài)氮去除率為2.71%，8～16h菌體對硝態(tài)氮的去除率呈遞增狀態(tài)，并在32h達到了86.0%的去除率。在不同濃度Zn(II)存在的情況下對硝態(tài)氮的降解趨勢與控制組類似，當(dāng)Zn(II)濃度為0.3mM時，硝態(tài)氮去除率相較于其它幾組較大，達到了91.4%，而隨著Zn(II)濃度上升到0.5mM濃度時，硝態(tài)氮去除率有所降低，為77.9%。這說明Zn(II)在菌株YF1的生長和代謝中起著非常重要的作用，在存在微量Zn(II)時，Zn(II)可作為微生物生長的營養(yǎng)元素，在促進反硝化菌Paracoccus sp.YF1的生長的同時提高其降解硝態(tài)氮的能力。然而，當(dāng)Zn(II)超過一定濃度時，菌體的生長和脫氮就受到了抑制，這可能與菌株耐受Zn(II)的能力有關(guān)。

圖4 不同濃度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存條件下對菌株降解硝態(tài)氮的影響

在不同濃度Zn(II)存在的情況下，加入共存Cu(II)（0.02mM），探究其對菌株降解硝態(tài)氮的影響?？梢园l(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮去除率有所下降，在0～8h，反硝化菌Paracoccus sp.YF1幾乎對硝態(tài)氮沒有降解作用，8～16h對硝態(tài)氮的去除率呈上升趨勢，16～32h趨于平穩(wěn)。Cu(II)到達一定的濃度時會對反硝化菌的生長產(chǎn)生抑制作用，且Cu(II)對反硝化菌生長的抑制作用明顯強于Zn(II)[9]。在0.3mM Zn(II)和0.02mM Cu(II)共存時，硝態(tài)氮去除率達到最高，為54.0%。但相較于單獨Zn(II)存在的情況下，加入0.02mM Cu(II)，會降低菌株對硝態(tài)氮的降解能力。

3.結(jié)論

（1）在單獨存在Zn(II)的情況下，Paracoccus sp.YF1對Zn(II)的去除效果不佳，最高去除率僅為14.2%。在添加了0.02mM Cu(II)后，可以提高Zn(II)的去除效率。當(dāng)0.02mM Cu(II)與0.3mM Zn(II)共存的情況下，菌株對Zn(II)的去除率最高，達到了17.3%。

（2）低濃度Zn(II)可以促進菌株對硝態(tài)氮的去除效率，當(dāng)Zn(II)濃度為0.3mM時，硝態(tài)氮去除率達到91.4%；在加入0.02mM Cu(II)后菌株去除硝態(tài)氮受到抑制影響。一定濃度的Cu(II)對菌體有毒害作用，會降低Paracoccus sp.YF1對硝態(tài)氮的降解能力，在Cu(II)存在下，32h去除率最高為54.0%，與單獨存在0.3mM Zn(II)時相比，硝態(tài)氮的去除率下降了37.5%。

本研究探究了重金屬和硝酸鹽共存時各自的去除率以及不同重金屬間的相互影響，對反硝化菌Paracoccus sp.YF1脫氮的實際應(yīng)用研究提供了一定參考意義。