張昊，楊林杰，張騰飛，孫靜，梁振華，皮勁松，杜金平

（湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064）

皮蛋是具有悠久歷史的中國傳統(tǒng)蛋制品，由鮮鴨蛋經(jīng)5周左右腌制而成，其風味獨特，營養(yǎng)豐富。皮蛋制作不但延長了蛋品的保存期，還使其具有抗腸炎[1]、調(diào)控腸道微生物菌群等功能[2]。鴨蛋由蛋殼包裹，蛋清黏度高，且蛋清中含溶菌酶，這些特點可一定程度阻止細菌的入侵、增殖[3]。但受原料蛋品質(zhì)和加工條件和影響，某些皮蛋加工企業(yè)也會出現(xiàn)“爆蛋”現(xiàn)象?！氨啊笔怯捎谄さ皟?nèi)壓力增大，超過蛋殼承載力導致的。皮蛋加工過程出現(xiàn)“爆蛋”，往往不是單個蛋品出現(xiàn)，而是整缸或成批出現(xiàn)，對企業(yè)造成巨大損失。因此，對皮蛋“爆蛋”進行微生物溯源，提出控制“爆蛋”的有效方案具有重要產(chǎn)業(yè)意義。

麥氏弧菌（Vibrio metschnikovii）是麥契尼可夫弧菌的簡稱，是一種厭氧/兼性厭氧短桿菌，屬于非 O1群霍亂弧菌，一般不致病[4,5]，于1981年首次分離得到[6]，廣泛存在于污水[7,8]、人畜糞便[9]、水產(chǎn)品[10,11]、河流、海灣[12]和污染的水禽蛋[13]中。由于其分布廣泛、致病力不強，相關(guān)報道有限。一般認為該菌屬嗜鹽性菌，在無鹽胨水中不能生長[14]。且該菌不耐低溫，具有耐堿和膽鹽的特征[15]。目前有關(guān)于麥氏弧菌影響再制鴨蛋成品率的研究報道較少。

全基因組De novo測序也稱為從頭測序，可不依賴參考基因組序列，進行建庫測序。測序結(jié)果通過拼接組裝，繪制測序物種的完整基因組序列圖譜。基因組測序不僅可以獲得測序物種的全基因組序列圖譜，分析開放性閱讀框，確定基因數(shù)量，還可通過進一步分析，確定測序物種進化特點、生物學分類、基因功能富集情況和主要代謝通路，為特定環(huán)境適應(yīng)性等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)[16,17]。

本研究從爆蛋樣品中分離出一株革蘭氏陰性菌，命名為BD菌株。通過形態(tài)學觀察，16S rDNA序列比對，初步鑒定其為弧菌屬細菌。通過弧菌試劑盒檢測生理生化功能，確定其生長代謝特點。并確定了其最適生長溫度、耐鹽度和耐堿度，為皮蛋加工企業(yè)“爆蛋”控制方案制定提供參考。鑒于菌株生長環(huán)境特點，進一步通過De novo測序，初步解析BD菌株適應(yīng)高堿度環(huán)境的生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“爆蛋”皮蛋樣品由湖北省江夏區(qū)某皮蛋加工廠提供。

主要培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、芽孢桿菌培養(yǎng)基、MA培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

主要試劑：DP302 TIANampBateria DNA Kit，天根生化科技（北京）有限公司；KOD taq、Loading buffer、核酸染料，Transgene生物科技有限公司；弧菌科細菌生化鑒定盒（16種×5次），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；NEBNext?UltraTMDNA Library Prep Kitfor illumine試劑盒，NEB有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；Eclipse Ts2R倒置顯微鏡，尼康株式會社；LX-B35 L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；PCR儀，美國賽默飛世爾科技公司；PYL-125型生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；GelDocXR+全自動凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-red公司。

1.3 方法

1.3.1 “爆蛋”樣品細菌的分離純化

鑒于“爆蛋”皮蛋樣品蛋白無明顯變化，蛋黃內(nèi)出現(xiàn)變質(zhì)、顏色異常，因此，將“爆蛋”樣品變質(zhì)蛋黃作為菌株的分離材料，取各批次“爆蛋”蛋黃0.5 g進行后續(xù)試驗。樣品無菌條件下充分研磨后轉(zhuǎn)入加入200 mL，0.9%無菌NaCl的錐形瓶，200 r/min振蕩30 min，靜置5 min，用0.9% NaCl 10倍梯度稀釋，選擇5個稀釋梯度，各取100 μL梯度稀釋液于不同培養(yǎng)皿內(nèi)，并涂布均勻，倒置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24±2 h。根據(jù)菌落的形狀，大小和顏色等形態(tài)特征，挑取不同選擇培養(yǎng)基上單菌落進行純化，鏡檢，斜面保藏。

1.3.2 細菌形態(tài)特征的觀察

菌落特征：對菌落的顏色、大小、形狀、光滑度和透明度等進行觀察并記錄。

對菌落形態(tài)進行觀察和拍照。將分離純化后的細菌進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細菌形態(tài)特征。

1.3.3 菌株基因組DNA提取及16S rRNA基因擴增測序

將待測菌株分別使用分離菌株所采用的固體培養(yǎng)基對應(yīng)的液體培養(yǎng)基37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h獲得新鮮細胞懸浮液，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取 DNA（步驟參照說明書）。以提取的 DNA為模板，選擇細菌 16S rDNA的通用引物 27F（ 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進行 PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×FastTaq Premix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.75 μL，添加ddH2O至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，確定擴增片段長度于目標片段長度相同、無雜帶后送往武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進行純化并測序。

1.3.4 同源性及進化樹分析

擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送武漢生工生物技術(shù)有限公司進行測序，將測序進行BLAST 比對（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），綜合分析菌株16S rDNA序列比對結(jié)果。選擇同源性高的細菌序列，用 MEGAX 軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 細菌生長曲線繪制

濃度為1.0×106CFU/mL的細菌培養(yǎng)液，以1%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，分別選取0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h時間測定菌液的OD600值。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600值為縱坐標繪制細菌生長曲線，共進行3次重復試驗并統(tǒng)計分析。

1.3.6 細菌培養(yǎng)特性試驗

通過表2可知，磁性纖維素在293、303和313 K溫度下Langmuir模型的線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99，而且由Langmuir模型所得各個溫度飽和吸附容量與磁性纖維素對亞甲基藍溶液吸附容量實測值比較接近，說明磁性纖維素對亞甲基藍溶液吸附更適合用Langmuir模型描述，吸附主要為單分子層吸附，最大吸附容量為123.15 mg·g-1。

（1）細菌生長最適溫度試驗

將細菌的培養(yǎng)液接種到3.5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，分別在 15、20、25、30、35、40、45、50 ℃條件下，200 r/min培養(yǎng)過夜。次日分別測取OD600值，進行3次重復并統(tǒng)計分析。

（2）細菌耐堿試驗

將細菌的培養(yǎng)液接種到3.5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為8、9、10、11、12、13、14。接種后200 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h后，取適量樣品測OD600值。進行3次重復，統(tǒng)計分析。

（3）細菌耐鹽試驗

將細菌的培養(yǎng)液接種到3.5 mL的LB液體培養(yǎng)基中（pH 10±0.2），并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的NaCl濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，37 ℃培養(yǎng)12 h后，取適量樣品測OD600值。進行3次平行試驗，統(tǒng)計分析。

（4）細菌生化試驗

1.3.7 細菌基因組De novo測序

采用SES方法對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和完整性，利用Qubit進行定量后，對DNA樣品用超聲破碎儀隨機打斷成長約350 bp的片段。利用建庫試劑盒，經(jīng)末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟制備測序文庫。文庫構(gòu)建后，使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至2 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進行檢測，片段大小符合預期后，使用qPCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質(zhì)量。構(gòu)建好的的文庫通過 Illumina PE150平臺進行細菌框架圖測序。測序完成后，構(gòu)建細菌基因組框架圖，并對基因進行GO富集、KEGG分析等生物信息學分析。

1.3.8 統(tǒng)計分析

本試驗統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS軟件中的ANOVA方法計算均值±SD和p值。

2 結(jié)果與分析

2.1 “爆蛋”樣品分離獲得的細菌形態(tài)、菌落特征及16S rDNA序列分析

多批次樣品細菌分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“爆蛋”樣品中的微生物可在LB固體培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基中生長，菌落均呈淺黃色，表面光滑且不透明。分離純化后，菌落形態(tài)相同，均如圖1所示，在LB固體培養(yǎng)基中形成淺黃色、表面光滑、邊緣整齊且不透明的近似圓形的菌落。顯微鏡檢特點相同，菌株革蘭氏染色陰性，短桿狀，不透明菌株。單個存在，少數(shù)鏈狀排列（圖1）。

微生物的16S rDNA結(jié)構(gòu)具有保守性，可反映微生物間的親緣關(guān)系和進化特征。16S rDNA序列比對法對未知菌株種屬分類具有快速、準確、靈敏等優(yōu)點。對BD菌株的基因組DNA模板進行16S rDNA片段PCR擴增，擴增到大小約為1400 bp條帶。利用NCBI中blast工具對BD菌株16S rDNA擴增片段測序結(jié)果進行比對分析，BD菌株（Genbank accession number：MZ723937）與弧菌屬多個近緣種的16S rDNA基因相似性在 99%以上，其中與麥氏弧菌（Vibrio metschnikoviistrain KT986183.1），印第安弧菌（Vibrio injenensisstrain KC634073.2），辛辛那提弧菌（Vibrio cincinnatiensisstrain NR026122.1），需鈉弧菌（Vibrio natriegensstrain NR115679.1）的相似性分別為99.92%、99.75%、99.83%、97.76%。由于16S rDNA的保守性高，未知菌屬序列比對分析是目前確定其分類的常用手段，但對相似率極高的近緣種只能進行屬水平上的鑒定。

選取 7個同源性較高的不同種的弧菌序列，用MegaX軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，BD菌株與麥氏弧菌處于較近分支，且聚集在一起，形成一簇（圖2）。綜合序列比對結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果，初步確定 BD菌株為麥氏弧菌（Vibrio metschnikovii）。進一步利用菌株De nove測序結(jié)果的分析，可將菌株鑒定到種。

2.2 細菌生長曲線結(jié)果

供試菌在培養(yǎng)4 h后進入對數(shù)生長期，并持續(xù)到12 h左右，14 h后進入穩(wěn)定期（圖3）。在試驗組中，所有檢測點3組數(shù)據(jù)均差異不顯著（p＞0.05），重復性良好。

2.3 細菌培養(yǎng)特性試驗結(jié)果

供試菌在 15 ℃培養(yǎng)條件下，生長緩慢，當溫度達到25 ℃，即可開始生長，最適生長溫度為25～40 ℃（圖4）。供試菌株的OD600值隨pH值的增大呈先增加后下降的趨勢，其在pH 12時OD600值達到最大值，pH進一步增加，細菌則無法增殖（圖5）。供試菌培養(yǎng)基中NaCl濃度從2.5%至5%增加時，該弧菌增殖速度隨鹽濃度的提高而加快，當 NaCl濃度從 5%至7.5%繼續(xù)增加時，該弧菌增殖速度變慢（圖6）。細菌培養(yǎng)特性試驗的試驗重復性均表現(xiàn)良好。

由于該菌株多富集于水體、海鮮及動物糞便中?；贐D菌株的生長特性，加工企業(yè)應(yīng)重點關(guān)注原料蛋品收集、運輸，減少使用細菌污染的次品蛋，尤其我國南方地區(qū)在春夏之交，氣溫升高的氣候條件下更需重點關(guān)注。此外，在腌制車間內(nèi)、蛋品出缸后以及商品皮蛋在儲運、貨架期管理時，也要注意控溫，避免溫度過高，引發(fā)“爆蛋”。

2.4 生理生化特性

供試菌株蔗糖、阿拉伯糖、肌醇分解試驗結(jié)果陰性；甘露糖分解試驗結(jié)果陽性。菌株1% NaCl葡萄糖產(chǎn)氣、1% NaCl精氨酸雙水解酶試驗結(jié)果陽性；1%NaCl賴氨酸脫羧酶試驗結(jié)果陰性。低濃度（0%～6%）NaCl胨水試驗陽性，高濃度（8%～10%）NaCl胨水試驗陰性。相關(guān)試驗結(jié)果詳見（表1）。該結(jié)果表明，BD菌株除適應(yīng)高堿環(huán)境外，還具有產(chǎn)氣能力，能夠在6%的鹽濃度條件下生長。

表1 BD菌株的生理生化分析Table 1 Physiological and biochemical analysis of BD strain

2.5 細菌基因組De novo測序分析

通過對下機數(shù)據(jù)處理，序列組裝發(fā)現(xiàn)，BD菌株基因組大小為3.70 Mb，GC含量43.62%?；蚪M分析表明，BD菌株共編碼3381個基因，基因平均長度為942 bp，編碼基因長度占基因組比例為86.58%。非編碼RNA預測發(fā)現(xiàn)，BD菌株共有84個tRNA，13個sRNA。采用IslandPath-DIOMB軟件預測BD菌株基因島發(fā)現(xiàn)，BD菌株存在5個基因島，基因島總長度40270 bp，平均長度8054 bp。

選取GO、KEGG和COG三個數(shù)據(jù)庫對功能基因進行注釋。其中，GO（Gene Ontology）按照功能基因的分子功能、生物學過程和細胞組分進行聚類。GO注釋結(jié)果的分類如圖7所示，細菌生物學過程和分子功能基因活躍，其中參與細胞過程（1348條）、代謝過程（1345條）、結(jié)合（1133條）、催化活性（1262條）的基因較多。

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）從分子信號通路角度進行注釋，獲得菌株相關(guān)分子間的互作網(wǎng)絡(luò)。BD菌株KEGG代謝通路分析結(jié)果如圖8所示。從KEGG通路注釋結(jié)果表明，該菌株參與碳水化合物代謝及膜轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因數(shù)量最多，此外，參與氨基酸代謝、維生素和輔因子代謝通路的相關(guān)基因數(shù)量也較多。通過對蛋白編碼基因功能注釋表明，該菌株基因組中含有大量碳水化合物代謝通路、膜轉(zhuǎn)運功能相關(guān)通路基因。有研究表明，嗜堿細菌細胞膜上的Na+/H+轉(zhuǎn)運載體在調(diào)節(jié)細胞質(zhì)pH方面起關(guān)鍵作用[18,19]。BD菌株中的大量膜轉(zhuǎn)運相關(guān)基因可轉(zhuǎn)錄翻譯成的蛋白，以離子泵的形式保證細菌胞質(zhì)中pH值相等穩(wěn)定[20]。分離菌株基因組中同時含有較多的碳水化合物代謝通路相關(guān)基因，這些功能基因可能參與細菌利用蛋內(nèi)碳源物質(zhì)為離子轉(zhuǎn)運供能。對于GO注釋將基因富集到的基因中，雙組分傳感因子活性相關(guān)基因可能與該菌株適應(yīng)堿性環(huán)境有關(guān)[21]，甘油-3-磷酸鹽分解代謝活性相關(guān)基因可能也參與了堿環(huán)境適應(yīng)[22]。

COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果表明（圖9），BD菌株相關(guān)基因富集于氨基酸轉(zhuǎn)運代（250個）；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和起源（234個）；轉(zhuǎn)錄因子（218個），結(jié)果對GO注釋和KEGG注釋結(jié)果進行了補充和印證。

NR數(shù)據(jù)庫（Non-Redundant Protein Database）是一個非冗余的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，其特點在于內(nèi)容比較全面，同時注釋結(jié)果中會包含有物種信息，可作物種分類用。該數(shù)據(jù)庫由NCBI創(chuàng)建并維護，根據(jù)基因編碼蛋白注釋到的物種情況，統(tǒng)計注釋到的物種及蛋白數(shù)目。結(jié)果表明，BD菌株編碼的3381個蛋白，有2641個注釋到麥氏弧菌中，其富集度最高（見圖 10）。結(jié)合前期16S rDNA測序比對結(jié)果，確定從皮蛋“爆蛋”樣品中分離獲得的 BD菌株為麥氏弧菌（Vibrio metschnikovii）。

3 結(jié)論

3.1 本研究通過分離、鏡檢、染色、16S rDNA測序比對和De novo從頭測序，確定從皮蛋“爆蛋”樣品中分離獲得的 BD 菌株為麥氏弧菌（Vibrio metschnikovii）。生長特性研究發(fā)現(xiàn)其適宜生長溫度為25～40 ℃，可耐受pH≤12的堿環(huán)境，耐鹽且具有產(chǎn)氣能力。但該腐敗菌BD菌株如何侵入蛋品內(nèi)部，其代謝過程中產(chǎn)生的氣體是何種成分，還需要進一步開展相關(guān)研究。

3.2 研究分離獲得的BD菌株De novo測序分析表明，該菌株基因組中有大量參與碳水化合物代謝、膜轉(zhuǎn)運、氨基酸代謝、維生素和輔因子代謝通路的基因，通過相關(guān)基因表達來適應(yīng)高堿環(huán)境，為皮蛋“爆蛋”菌在蛋黃中的生長機制研究提供了一定基礎(chǔ)，但功能基因的挖掘和作用機制研究也有待后續(xù)試驗進行深入研究。