陳 凡,丁能水,李奕雅,汪小東,許弟群

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建 漳州 363000；2.福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司,福建 漳州 363000；3.閩南師范大學(xué)體育學(xué)院,福建 漳州 363000）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase cain reaction，PCR）是一種指數(shù)級(jí)擴(kuò)增微量基因片段的核酸檢測(cè)技術(shù)，擁有極高的靈敏度，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖等多個(gè)領(lǐng)域.以常規(guī)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，衍生出諸如多重PCR（Multiplex PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）、巢式PCR（Nested PCR）等技術(shù)，又進(jìn)一步擴(kuò)大了PCR 技術(shù)的應(yīng)用范圍[1].自2020年初新冠疫情爆發(fā)以來(lái)，基于PCR 技術(shù)的“核酸檢測(cè)”，更是作為確診COVID-19 的“金標(biāo)準(zhǔn)”，為人們所熟知[2].實(shí)際應(yīng)用中，由于PCR 及其衍生技術(shù)具有極高的靈敏度，故其反應(yīng)過(guò)程特別是試劑混合與加樣步驟特別容易受到污染物（如陽(yáng)性DNA 氣溶膠等）的干擾，得出假陽(yáng)性結(jié)果.且假陽(yáng)性的產(chǎn)生原因極難排查，更難以徹底解決，長(zhǎng)期以來(lái)不斷困擾著廣大檢驗(yàn)人員和科技工作者[3-4].因此，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的污染物控制一直是相關(guān)檢測(cè)穩(wěn)定性的重要影響因素.

一般情況下，若PCR 反應(yīng)體系中存在dUTP，則dUTP 能與dTTP 產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中，形成帶有尿嘧啶（U）的DNA 分子.而尿嘧啶-DNA 糖基化酶（Uracil-DNA Glycosylase，UDG）能特異性地切斷DNA 分子中尿嘧啶堿基與脫氧核糖間的N-糖苷鍵，移去尿嘧啶，生成無(wú)堿基位點(diǎn)，在DNA 片段上挖開缺口[5].帶有缺口的DNA在隨后的PCR循環(huán)中，將無(wú)法作為完整的模板被擴(kuò)增.基于這一特性，UDG被用于PCR反應(yīng)中的污染控制，且效果得到了肯定[6-10].

近年來(lái)，PCR 預(yù)混液試劑盒得到普遍應(yīng)用，使用時(shí)僅需加入適量引物、模板和水即可進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，簡(jiǎn)化了操作，也減少了操作過(guò)程中可能導(dǎo)致的污染.因此，在常規(guī)和定量PCR 實(shí)驗(yàn)中，預(yù)混試劑盒已經(jīng)占據(jù)了主導(dǎo)地位.然而，此類試劑盒中的酶和dNTP 以預(yù)混方式存在，濃度不可自由調(diào)節(jié)，若要向其中添加dUTP，實(shí)現(xiàn)抗污染效果，則與傳統(tǒng)試劑盒相比，其反應(yīng)條件的優(yōu)化更加困難.實(shí)際使用中，若體系中dUTP含量過(guò)高，則DNA 聚合酶活性將受到抑制，導(dǎo)致擴(kuò)增效率（檢測(cè)靈敏度）降低甚至完全無(wú)法擴(kuò)增模板；若dUTP 含量過(guò)低，則不能保證PCR 產(chǎn)物中摻入足量的尿嘧啶，對(duì)UDG 活性的發(fā)揮不利[10].因此，本研究以PCR產(chǎn)物中A-T占比存在較大差異的鯉魚浮腫病病毒（CEV）和羅非魚湖病病毒（TiLV）核酸檢測(cè)為例，對(duì)使用PCR 預(yù)混液時(shí)，dUTP 的添加量及對(duì)應(yīng)條件下UDG 的去污染效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)研究，以期為該條件下UDG抗污染手段的應(yīng)用和優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和使用效果的量化參考.

1 材料與方法

1.1 感受態(tài)細(xì)胞、工具酶與試劑

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5α（E.coliDH5α，轉(zhuǎn)化效率>5×108cfu/μg）購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司.San-Prep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，4S Red Plus核酸染色劑，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker（100～5 000 bp），瓊脂糖，SanTaq Plus PCR 擴(kuò)增試劑盒（下文簡(jiǎn)稱“SanTaq”），SGExcel UltraSYBR Master 預(yù)混液，SGExcel GoldStar TaqMan Master 預(yù)混液等，購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司.2×Rapid Taq Master Mix（下文簡(jiǎn)稱“RapidTaq”），E.coliUDG（5 U/μL），dUTP（100 mM）等，購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司.2×HLingene PCR Master Mix（下文簡(jiǎn)稱“HLTaq”）購(gòu)于上?；萘枭锛夹g(shù)有限公司.引物合成與質(zhì)粒測(cè)序委托蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行.若無(wú)特殊說(shuō)明，各試劑使用時(shí)均嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)的說(shuō)明書要求進(jìn)行操作或設(shè)置反應(yīng)條件.

1.2 陽(yáng)性質(zhì)粒與引物

陽(yáng)性質(zhì)粒pUC19-CEV和pUC19-TiLV均由本課題組構(gòu)建并保存.CEV陽(yáng)性質(zhì)粒包含鯉魚浮腫病病毒的P4a 蛋白基因保守序列以及5′UTR 序列[11]，TiLV 陽(yáng)性質(zhì)粒包含羅非魚湖病病毒基因的保守序列[12].質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及檢測(cè)中使用的引物結(jié)合位點(diǎn)與擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如圖1所示，對(duì)應(yīng)的引物序列如表1所示.質(zhì)粒提取過(guò)程嚴(yán)格按照抽提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.以TE緩沖液溶解純化后的質(zhì)粒分子，并采用NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì)（thermo fisher）測(cè)定其濃度.

表1 本研究使用的引物Tab.1 Primers used in this study

圖1 本研究使用的陽(yáng)性質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及對(duì)應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)示意圖Fig.1 Schematic representation of the positive plasmid structures and corresponding primer binding sites used in this study

1.3 PCR條件與步驟

本研究使用的PCR 反應(yīng)條件為，（1）常規(guī)PCR（SanTaq、HLTaq、RapidTaq）：95 ℃（120 s）→95 ℃（15 s）→55 ℃（15 s）→72 ℃（SanTaq 和HLTaq 為1 000 bp/min，RapidTaq 固定為5 s，35 循環(huán)）→72 ℃（120 s）→10 ℃（Hold）；（2）染料法qPCR（SGExcel UltraSYBR）：95 ℃（180 s）→95 ℃（15 s）→55 ℃（20 s）→72 ℃（30 s，40循環(huán)）；（3）探針?lè)╭PCR（SGExcel GoldStar TaqMan）：95 ℃（180 s）→95 ℃（20 s）→60 ℃（30 s，40循環(huán)）.其中常規(guī)PCR 使用GE9612T-S 基因擴(kuò)增儀（杭州柏恒科技有限公司）完成，熒光定量PCR 使用QuantStudio?6實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）完成.

巢式PCR步驟，（1）CEV：使用“BF+BR”引物組擴(kuò)增模板中的528 bp片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)能夠擴(kuò)增出特異性DNA 條帶的樣品，以TE 緩沖液將第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1 000 倍，作為第二輪反應(yīng)的模板.再使用“IF+IR”擴(kuò)增第二輪模板中的478 bp 片段，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳（1.5%，下同）檢測(cè)特異性條帶.若第一輪擴(kuò)增后無(wú)法檢測(cè)到特異性條帶，則直接使用該產(chǎn)物（不稀釋）作為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增并檢測(cè).（2）TiLV：除引物外，檢測(cè)與模板準(zhǔn)備步驟與CEV一致，第一輪使用引物組“Nested ext-1+ME1”，擴(kuò)增產(chǎn)物共415 bp；第二輪使用引物組“ME1+ME2”，擴(kuò)增產(chǎn)物共250 bp.

熒光定量PCR：取待測(cè)DNA 作為模板，直接通過(guò)SYBR Green 染料法或TaqMan 探針?lè)ㄟM(jìn)行定量檢測(cè)，每個(gè)樣品使用3個(gè)復(fù)孔.此外，為便于數(shù)據(jù)比較并提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，在各標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立過(guò)程中，均以全長(zhǎng)質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板.

1.4 Taq酶對(duì)dUTP的耐受性檢驗(yàn)

向PCR反應(yīng)體系中添加不同濃度的dUTP溶液，形成特定的dUTP濃度梯度，再利用各PCR預(yù)混液對(duì)pUC19-CEV 和pUC19-TiLV 質(zhì)粒的巢式第一輪陽(yáng)性片段進(jìn)行擴(kuò)增，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，以確認(rèn)dUTP濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響.

1.5 UDG反應(yīng)條件

按照特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將同一擴(kuò)增條件下得到的PCR 產(chǎn)物分裝若干份，并向每份PCR 產(chǎn)物中添加一定量的UDG，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行漩渦混勻，再將混合液以2 000 g離心15 s，隨后轉(zhuǎn)移到水浴鍋或PCR 儀內(nèi)，37 ℃孵育10 min，使UDG 充分發(fā)揮作用，降解底物.最后將孵育溫度提升至95 ℃，維持2 min，對(duì)UDG 進(jìn)行滅活處理.經(jīng)UDG 處理后的PCR 產(chǎn)物，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行半定量評(píng)價(jià)，或以TE 緩沖液稀釋1 000倍后，以qPCR法對(duì)降解效果進(jìn)行定量評(píng)價(jià).

1.6 UDG對(duì)模板DNA降解效果的評(píng)價(jià)

電泳法：使用PCR預(yù)混液以及不同的巢式引物對(duì)CEV和TiLV陽(yáng)性片段進(jìn)行擴(kuò)增.隨后參照方法1.5，使用不同的UDG濃度對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理.再對(duì)處理后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

染料法qPCR：使用特定PCR 預(yù)混液和引物組擴(kuò)增pUC19-CEV（擴(kuò)增用引物組為“BF+BR”）或pUC19-TiLV（擴(kuò)增用引物組為“Nested-ext1+ME1”）質(zhì)粒中的陽(yáng)性DNA 片段，再采用不同濃度的UDG 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行降解，最后將降解產(chǎn)物以TE緩沖液稀釋1 000倍，作為qPCR模板，配合巢式引物上機(jī)檢測(cè).檢測(cè)時(shí)使用基于SYBR Green的熒光染料和ROX參比作為熒光定量依據(jù).

探針?lè)╭PCR：使用特定的PCR 預(yù)混液和引物組擴(kuò)增pUC19-CEV（擴(kuò)增用引物組為“BF+BR”）或pUC19-TiLV（擴(kuò)增用引物組為“SF+SR”）中的陽(yáng)性DNA 片段，并采用不同濃度的UDG 對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行降解，再將降解產(chǎn)物以TE緩沖液稀釋1 000倍后，作為qPCR模板，配合探針?lè)ㄒ锷蠙C(jī)檢測(cè).檢測(cè)時(shí)使用基于FAM-BHQ1的探針和ROX參比作為熒光定量依據(jù).

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)使用Minitab v17.0 軟件進(jìn)行數(shù)值統(tǒng)計(jì).熒光定量PCR 復(fù)孔檢測(cè)結(jié)果的Ct 值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示（由于qPCR 數(shù)據(jù)的平均值遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)差，使各檢測(cè)結(jié)果的CV 值均小于1%，故圖5-6 不對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行繪制），利用線性回歸得到不同模板添加量對(duì)應(yīng)的回歸方程與決定系數(shù)后，根據(jù)回歸方程反推待測(cè)樣品中的模板含量并進(jìn)行相互比較與計(jì)算.

2 結(jié)果與討論

2.1 Taq酶對(duì)dUTP的耐受性分析

不同Taq酶對(duì)dUTP作為反應(yīng)底物的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.由圖中的電泳條帶可見：SanTaq和HLTaq的擴(kuò)增產(chǎn)量均隨著反應(yīng)體系中dUTP濃度的增加而呈現(xiàn)降低趨勢(shì).更為明顯的是，RapidTaq對(duì)體系中dUTP 的存在完全不耐受，僅向反應(yīng)體系中添加100 μmol/L 的dUTP 即可完全抑制其活性.因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再以RapidTaq為實(shí)驗(yàn)材料展開進(jìn)一步探討.反觀SanTaq和HLTaq對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)：在檢測(cè)CEV基因時(shí)，若dUTP濃度達(dá)到400 μmol/L，則SanTaq的擴(kuò)增效率顯著降低；若dUTP濃度達(dá)到800 μmol/L，則HLTaq 的擴(kuò)增性能也有明顯下降.而檢測(cè)TiLV 基因時(shí)，dUTP 對(duì)兩種酶特別是HLTaq 擴(kuò)增性能的影響則相對(duì)較小.這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能在于：CEV模板中A-T堿基的占比為68.4%，遠(yuǎn)高于TiLV的50.6%（圖1），導(dǎo)致CEV模板擴(kuò)增過(guò)程中Taq酶與dUTP的相互作用更為頻繁.

圖2 三種Taq酶對(duì)dUTP的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Experiment results of the dUTP tolerance with three Taq DNA polymerase

為確保PCR 體系中加入的dUTP 不對(duì)擴(kuò)增效率產(chǎn)生較大干擾，本研究以近年來(lái)參與全國(guó)水生動(dòng)物防疫系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，計(jì)算得到：標(biāo)準(zhǔn)核酸抽提手段下，病魚樣本中能夠提取到的CEV陽(yáng)性DNA模板濃度最小值約等價(jià)于pUC19-CEV質(zhì)粒0.022 pg/μL；病魚中的TiLV陽(yáng)性RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，對(duì)應(yīng)的DNA模板濃度最小值約等價(jià)于pUC19-TiLV質(zhì)粒0.007 pg/μL.因此，本研究考察了陽(yáng)性質(zhì)粒用量0.2 pg/μL 以及0.002 pg/μL 情況下，dUTP 濃度梯度對(duì)兩種Taq 酶擴(kuò)增效果的影響，結(jié)果（圖3）表明：（1）dUTP用量不超過(guò)200 μmol/L時(shí)，兩種酶在高低兩種模板濃度下的擴(kuò)增效果受dUTP影響較小；（2）dUTP用量不超過(guò)800 μmol/L時(shí)，即使在低模板濃度下，兩種酶也能通過(guò)PCR擴(kuò)增準(zhǔn)確判斷陽(yáng)性模板的存在.其中，HLTaq 在dUTP 濃度達(dá)到1 800 μmol/L的情況下，對(duì)低濃度模板依然有效.為便于橫向比較，后續(xù)統(tǒng)一以200 μmol/L的dUTP濃度為基本反應(yīng)條件，展開進(jìn)一步研究.

2.2 UDG用量對(duì)模板降解效果的影響（電泳法）

UDG 用量對(duì)模板降解效果的影響如圖4所示.通過(guò)對(duì)圖4A-D 組結(jié)果的分析，可知：（1）UDG 對(duì)不含U 的底物不產(chǎn)生降解，可認(rèn)為UDG 在本研究使用的反應(yīng)條件下無(wú)非特異活性；（2）不同UDG 濃度對(duì)含U的底物均產(chǎn)生了極其顯著的降解效果，且可以認(rèn)為：隨著UDG 濃度的升高，降解效果愈發(fā)理想（降解產(chǎn)物的分子量均一性逐漸提高）.但對(duì)比圖中展示的各電泳結(jié)果，也能看出：UDG 用量超過(guò)0.2 U/10 μL 時(shí)（即試劑說(shuō)明書推薦的最低用量），降解效果未隨用量的提高而發(fā)生顯著變化.

圖4 不同UDG濃度對(duì)各PCR產(chǎn)物的降解效果Fig.4 Amplicon degradation by UDG concentration gradient

2.3 UDG用量對(duì)模板降解效果的影響（染料法qPCR）

以qPCR（染料法）對(duì)UDG的降解效果進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖5所示（因同組實(shí)驗(yàn)中任意兩個(gè)數(shù)據(jù)均存在顯著差異，故圖中不再額外標(biāo)記）.當(dāng)使用0.05、0.2、1 U/10 μL 三種濃度的UDG 處理同一PCR 產(chǎn)物時(shí)，不論擴(kuò)增模板是CEV 還是TiLV 陽(yáng)性片段，也不論使用了何種預(yù)混液，UDG 均表現(xiàn)出良好的降解效果.僅在0.05 U/10 μL的用量下，其模板的平均降解水平就可達(dá)99.9%左右；若提高UDG用量至1 U/10 μL，則平均降解水平可上升至99.98%左右.

從本組結(jié)果可推導(dǎo)如下結(jié)論：（1）UDG 對(duì)幾種含U 模板均有顯著降解效果，若使用0.2 U/10 μL 的UDG，則降解效率通常在99.95%以上.（2）從降解效率分析，與0.2 U/10 μL 的UDG 濃度相比，若僅使用0.05 U/10 μL，其作用效果明顯下降；若使用1 U/10 μL 的UDG 濃度，則效率提高有限或不提高.（3）使用SanTaq 擴(kuò)增的產(chǎn)物，其降解效率普遍高于HLTaq，其原因可能在于：1)同條件下，SanTaq 可能更容易將dUTP 摻入終產(chǎn)物，有利于UDG 發(fā)揮作用；2)SanTaq反應(yīng)體系的配方（如緩沖液濃度、pH 值等）對(duì)UDG 的活性更為友好；3)SanTaq擴(kuò)增效率較HLTaq更低，在酶活相同的情況下，更低的底物濃度對(duì)反應(yīng)完全更為有利.但具體由哪個(gè)因素主導(dǎo)，仍有待進(jìn)一步研究.

2.4 UDG用量對(duì)模板降解效果的影響（探針?lè)╭PCR）

以qPCR（探針?lè)ǎ?duì)UDG的降解效果進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示（因同組實(shí)驗(yàn)中任意兩個(gè)數(shù)據(jù)均存在顯著差異，故圖中不再額外標(biāo)記），當(dāng)使用由低到高三種UDG濃度處理同一PCR產(chǎn)物時(shí)，其結(jié)果與圖5相似——不同的UDG濃度均能在本組實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出對(duì)模板的降解效果.

圖5 不同UDG濃度對(duì)不同PCR產(chǎn)物降解效果的定量分析(qPCR染料法)Fig.5 SYBR Green based quantitative evaluation of amplicon degradation by UDG concentration gradient

圖6 不同UDG濃度對(duì)不同PCR產(chǎn)物降解效果的定量分析(qPCR探針?lè)?Fig.6 TaqMan based quantitative evaluation of amplicon degradation by UDG concentration gradient

與染料法qPCR檢測(cè)不同的是：利用qPCR（探針?lè)ǎz測(cè)特定目標(biāo)時(shí)，為保證擴(kuò)增效率，通常要求擴(kuò)增的片段小于200 bp[16].但更短的片段意味著更低的尿嘧啶摻入概率，勢(shì)必對(duì)UDG的作用效果產(chǎn)生影響.因此，本組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果明顯可見：（1）與圖5所示數(shù)據(jù)相比，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物較短時(shí)（探針?lè)–EV 產(chǎn)物為76 bp，TiLV產(chǎn)物為67 bp），UDG對(duì)潛在污染物的降解效率有明顯下降.即便使用較高的UDG濃度，其CEV模板降解效率也只能達(dá)到99.9%左右，相比染料法的結(jié)果降低了約10 倍，且這一現(xiàn)象在TiLV 模板的降解中（最高降解率僅98.438%）更為明顯.因此，可認(rèn)為過(guò)短的產(chǎn)物對(duì)UDG的降解作用不利.（2）使用探針?lè)z測(cè)時(shí)，CEV模板（A-T：65.8%）降解效率明顯高于TiLV模板（A-T：50.7%），可見底物的A-T含量對(duì)UDG活性的影響很大，含量越高則UDG 作用效果越好.（3）本組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示HLTaq 擴(kuò)增產(chǎn)物的降解效率高于SanTaq，與圖5所示結(jié)論相反.推測(cè)其原因可能在于：探針?lè)z測(cè)過(guò)程中，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱不單取決于擴(kuò)增反應(yīng)本身，探針?lè)肿优c模板的結(jié)合能力也至關(guān)重要.且探針?lè)肿又荒苓x擇性地結(jié)合DNA雙鏈中的某一鏈，故探針?lè)肿又邢汆堰剩ˋ，能夠與模板中的T或U配對(duì)）的數(shù)量與分布就可能對(duì)反應(yīng)過(guò)程中的熒光信號(hào)產(chǎn)生較大影響.而通過(guò)分析CEV 探針（qProbe）和TiLV 探針（TiLV-P1）的序列，可以發(fā)現(xiàn)其中A 的占比均小于整個(gè)陽(yáng)性模板的均值.特別是TiLV-P1 中，A 占比僅5.6%，遠(yuǎn)低于探針?lè)〝U(kuò)增區(qū)域中的20.9%，故檢測(cè)時(shí)可能呈現(xiàn)出與染料法不一致的結(jié)果.因此，在UDG 對(duì)底物的降解效率評(píng)價(jià)中，染料法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能更具有參考價(jià)值.（4）HLTaq擴(kuò)增產(chǎn)物，在UDG用量為0.05 U/10 μL時(shí)，降解效率遠(yuǎn)不及0.2 U/10 μL以上的條件，也從另一方面佐證了SanTaq的反應(yīng)體系配方對(duì)UDG活性的表達(dá)更為有利，即使用HLTaq擴(kuò)增檢測(cè)模板時(shí)，需使用較高（過(guò)量）的UDG濃度，才能達(dá)到理想的效果.

3 結(jié)語(yǔ)

UDG 屬于生物進(jìn)化過(guò)程中較為保守的DNA 修復(fù)酶系，是由六個(gè)亞家族組成的蛋白質(zhì)超家族.除了其自身獨(dú)特的生物學(xué)功能外，在PCR反應(yīng)中，UDG通常被用于DNA殘留污染的清除.

（1）UDG 的實(shí)際作用效果受到擴(kuò)增產(chǎn)物大小、產(chǎn)物中A-T 堿基比例，以及Taq 酶自身對(duì)反應(yīng)體系中dUTP濃度耐受的影響.總體而言，擴(kuò)增產(chǎn)物越長(zhǎng)，產(chǎn)物中A-T堿基對(duì)越多，Taq對(duì)dUTP耐受性越好的情況下，越有利于UDG 的抗污染作用.故使用UDG 作為抗污染試劑前，建議根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)材料，首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索得到較好的反應(yīng)條件后，再鋪開后續(xù)的研究或檢測(cè)工作.

（2）使用SanTaq 和HLTaq 兩種PCR 預(yù)混液試劑盒作為檢測(cè)工具時(shí)，向反應(yīng)體系中添加200 μmol/L 的dUTP，并使用0.2 U/10 μL 的UDG 濃度清除潛在陽(yáng)性污染物，是一種比較適宜的條件（僅使用HLTaq，則dUTP濃度可進(jìn)一步提高）.在這一條件下，若進(jìn)行常規(guī)PCR，則UDG對(duì)污染物的清除效率在99.9%以上，且多數(shù)情況高于99.95%.若實(shí)驗(yàn)環(huán)境中僅存在輕度污染，UDG 能夠較好地發(fā)揮作用.若使用qPCR（探針?lè)ǎ┳鳛闄z測(cè)手段，則同樣條件下污染物的清除率只能達(dá)到96.5%以上，對(duì)于高靈敏度的qPCR體系，這一清除率則略顯不足.但值得注意的是：研究中使用了陽(yáng)性片段的降解產(chǎn)物作為模板進(jìn)行定量評(píng)價(jià).事實(shí)上，此類降解產(chǎn)物中仍不乏能夠正常結(jié)合引物或探針的片段，只是模板斷裂后擴(kuò)增效率大幅下降而已，但其仍具備誘導(dǎo)產(chǎn)生熒光信號(hào)的能力.故可認(rèn)為：本研究中UDG 的降解效率實(shí)際上優(yōu)于qPCR 法的定量檢測(cè)結(jié)果.若需要更為準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)UDG的作用效果，則必須借助數(shù)字PCR等更為先進(jìn)的檢測(cè)工具.

（3）鑒于UDG 的作用特點(diǎn)，若污染物不含或少含尿嘧啶堿基，則其難以發(fā)揮作用.因此，在實(shí)際操作中，其抗污染能力是有一定限度的，操作人員除了添加dUTP和UDG作為抗污染手段外，更應(yīng)該注意養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣，并注意加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化管理，才能確保檢測(cè)的準(zhǔn)確度.

本研究系統(tǒng)地分析了以PCR預(yù)混液試劑盒為檢測(cè)工具時(shí)，UDG 酶在CEV 和TiLV 檢測(cè)中的抗污染作用，一方面總結(jié)得出了檢測(cè)時(shí)較為適宜的dUTP和UDG 用量，另一方面也為特定條件下UDG 對(duì)污染性模板的清除率做了定量統(tǒng)計(jì)，能為該技術(shù)的具體應(yīng)用與進(jìn)一步優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).