李小紅, 梁勝婷, 茍 琰, 郭 力, 郭曉強(qiáng),耿 昭, 周 闖

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 四川 成都 611137; 2. 成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 四川 成都 610106; 3. 四川食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院, 四川 成都 611731； 4. 成都大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 610106;)

著名川產(chǎn)道地藥材川貝母為百合科(Liliaceae)貝母屬(Fritillaria)的干燥鱗莖,歷來(lái)被認(rèn)為是潤(rùn)肺止咳的要藥[1].現(xiàn)代研究表明,川貝母具有廣泛的藥理作用,包括鎮(zhèn)咳、抗炎、祛痰、平喘、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等,被認(rèn)為是貝母類(lèi)藥材中最具藥用價(jià)值的復(fù)合群.其藥效成分除生物堿、皂苷、萜類(lèi)、甾體、脂肪酸等有機(jī)化合物外,還富含多種無(wú)機(jī)元素[2-7].無(wú)機(jī)元素對(duì)中藥材質(zhì)量具有重要的影響,一方面其易與生物體內(nèi)含氮、氧、硫的配體形成配位鍵對(duì)藥效發(fā)揮著協(xié)同作用,但另一方面重金屬及有害元素又能與人體中的蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)致使其生化功能改變或者喪失,是中藥材最主要的有害污染物質(zhì),也是中藥材進(jìn)出口的重要檢測(cè)指標(biāo)之一[8].同時(shí),川貝母的基源較為復(fù)雜,《中國(guó)藥典》(2015年版一部)收載的川貝母包括6個(gè)藥用植物來(lái)源,即卷葉貝母(F.cirrhosaD.Don)、暗紫貝母(F.unibracteataHsiao et K.C.Hsia)、甘肅貝母(F.przewalskiiMaxim.)、梭砂貝母(F.delavayiFranch.)、太白貝母(F.taipaiensisP.Y.Li)和瓦布貝母 [F.unibracteataHsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C. Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.chen][9],它們的地理分布相互重疊,特別是前3種在橫斷山區(qū)北部和中部地區(qū)可同時(shí)出現(xiàn),且生長(zhǎng)環(huán)境完全一致,通常難以鑒別[10].本研究采用ICP-MS對(duì)共計(jì)80批川貝母藥材的無(wú)機(jī)元素含量進(jìn)行測(cè)定,建立了川貝母藥材的無(wú)機(jī)元素指紋圖譜,并用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)及相關(guān)性分析,并通過(guò)對(duì)不同基源川貝母藥材中含量差異顯著的元素進(jìn)行逐步判別分析,以期對(duì)川貝母藥材的質(zhì)量控制、安全性評(píng)價(jià)和品種鑒別提供更多的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù).

1 分析設(shè)備與材料

設(shè)備：X2電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；MARS6微波消解萃取儀(美國(guó) CEM 公司)；CPA225D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；Millipore Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Merck公司)；各種規(guī)格的移液器(德國(guó)Eppendorf公司).

材料：各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液均為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品，購(gòu)于國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心,質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL，內(nèi)標(biāo)溶液的單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度1 000 μg/mL),購(gòu)于國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，標(biāo)號(hào)如表1；MOS級(jí)HNO3(CNW,德國(guó)).

共計(jì)80批的川貝母樣品.其中,暗紫貝母13批、甘肅貝母7批、卷葉貝母14批、梭沙貝母15批、瓦布貝母21批、太白貝母10批,樣品采自各地藥材種植基地、專(zhuān)業(yè)中藥材市場(chǎng)、醫(yī)院及藥房等,收集時(shí)間為2017年12月至2018年5月.所有樣品均經(jīng)四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院黎躍成主任藥師鑒定,符合《中國(guó)藥典》2015年版相關(guān)規(guī)定.

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備分別精確量取上述各單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% HNO3定容至100 mL,搖勻,作為對(duì)照品貯備溶液(各元素質(zhì)量濃度為10 μg/mL).精確量取不同體積的上述對(duì)照品貯備液稀釋后,配成不同質(zhì)量濃度的多元素混合對(duì)照品溶液.根據(jù)各元素在樣品中含量的具體情況,選取不同的線性范圍.

2.2 供試品溶液的制備取供試品約0.5 g,精確稱(chēng)定,置微波消解罐中,加HNO37 mL,放置60 min,密閉,放入微波消解儀中,按設(shè)定的消解程序處理：從室溫5 min升至120 ℃,保持10 min,再7 min升至160 ℃,保持15 min,再5 min 升至180 ℃,保持25 min.消解完畢后,冷卻取出,揮去濃煙,用去離子水將消解液轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中,用少量去離子水洗滌消解罐3次,洗液并入量瓶中,用去離子水稀釋至刻度,搖勻,即得,供含量較低的元素測(cè)定.對(duì)于含量過(guò)高的Na、Al、K、Ca和Fe元素,取上述供試品溶液再稀釋50倍即得.

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備取7Li、45Sc、73Ge、115In、209Bi作為內(nèi)標(biāo)溶液,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% HNO3稀釋,制成每1 mL各含10 ng的混合溶液.

2.4 測(cè)定條件ICP-MS測(cè)定條件：射頻功率為1 400 W,采樣深度114 step,載氣流速0.91 L/min,輔助氣流量0.84 L/min,冷卻氣流速13 L/min,蠕動(dòng)泵采集時(shí)轉(zhuǎn)速30 r/min,積分時(shí)間40 s.測(cè)定9Be和11B時(shí),以7Li作為內(nèi)標(biāo)；測(cè)定23Na、27Al、39K、44Ca、52Cr、55Mn和56Fe時(shí),以45Sc作為內(nèi)標(biāo)；測(cè)定60Ni、65Cu、75As、82Se和95Mo時(shí),以72Ge作為內(nèi)標(biāo)；測(cè)定111Cd、118Sn、121Sb、137Ba、159Tb和163Dy時(shí),以115In作為內(nèi)標(biāo)；測(cè)定208Pb時(shí),以209Bi作為內(nèi)標(biāo).

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系考察 按2.1配備系列混合元素對(duì)照品溶液,按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定,以各元素質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)(X),相應(yīng)儀器響應(yīng)值(ICPS)為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,各元素標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍結(jié)果見(jiàn)表2.

2.5.2檢出限 線性實(shí)驗(yàn)前取空白溶液按上述條件,連續(xù)測(cè)定11次,以測(cè)定元素的信號(hào)響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(δ)的3倍所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限,結(jié)果見(jiàn)表2,各元素的檢出限范圍為0.003～2.221 ng/mL；以3.3倍檢出限作為定量限,各元素的檢出限范圍為0.010～7.410 ng/mL.

2.5.3精密度考察 取質(zhì)量濃度為50 ng/mL的上述各元素混合對(duì)照品溶液照上述方法進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄各元素響應(yīng)值,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表2.

2.5.6穩(wěn)定性考察 取質(zhì)量濃度為50 ng/mL的上述各元素混合對(duì)照品溶液,置0～5 ℃保存,照上述方法分別在第0、24 h進(jìn)行測(cè)定,記錄各元素響應(yīng)值,考察對(duì)照品溶液穩(wěn)定性,結(jié)果見(jiàn)表2.各元素兩次測(cè)定結(jié)果RSD為0.21%～1.94%.表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定,該測(cè)定方法穩(wěn)定性好.

2.5.7重復(fù)性考察 取樣品粉末約0.5 g,精確稱(chēng)定,按2.2的方法,平行制備 6 份,按上述方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算各元素含量和RSD,結(jié)果見(jiàn)表2.大多數(shù)元素的RSD均小于5%(Se、Pb因濃度過(guò)低,RSD大于5%),表明方法重復(fù)性較好.

2.5.8準(zhǔn)確度考察(加樣回收) 取樣品粉末約0.25 g,精確稱(chēng)定,分別加入適量已測(cè)定的各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液.按2.2的方法制備供試品溶液,分別平行制備6份,測(cè)定,計(jì)算各元素回收率和RSD,結(jié)果見(jiàn)表2.

表 2 21種元素的線性回歸方程、檢出限、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率

2.6 無(wú)機(jī)元素的測(cè)定不同基源的川貝母樣品,精確稱(chēng)定,按2.2的方法制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算80批樣品中各元素的含量,結(jié)果見(jiàn)表3.

結(jié)果表明川貝母藥材中含有豐富的無(wú)機(jī)元素,幾種不同藥用植物來(lái)源的無(wú)機(jī)元素種類(lèi)組成差異性不大,但含量差異較大.

所測(cè)常量元素中,平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是K(4 027.363 μg/g),其次為Ca(586.725 μg/g)、Fe(191.273 μg/g)、Al(124.729 μg/g)、Na(104.235 μg/g)元素的總含量占本研究所測(cè)21種元素含量的99.60%(圖 1).

微量元素中平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)由高到低為Mn(9.354 μg/g)、Ba(3.321 μg/g)、Cu(2.601 μg/g)、B(2.089 μg/g)、Ni(1.061 μg/g)、Cr(0.924 μg/g)、Mo(0.269 μg/g)、Pb(0.133 μg/g)、Cd(0.094 μg/g)、As(0.091 μg/g)、Se(0.044 μg/g)、Sn(0.004 μg/g)和Dy(0.002 μg/g),其中Sn、Sb、Be僅在個(gè)別樣品中有微量檢出,所有川貝母藥材樣品均未檢出Tb元素.重金屬及有害元素中,僅有一批太白貝母樣品中Cu元素含量超出《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》限量指標(biāo)(w(Cu)≤20 μg/g),其余所有樣品均符合要求.

表 3 川貝母樣品中21種無(wú)機(jī)元素含量測(cè)定結(jié)果

注：“-”表示未檢出； “ ”表示超出限度；樣品用去離子水稀釋 50 倍以測(cè)定 Na、Al、K、Ca 和 Fe

圖 1 川貝母中各元素的占比分析

2.7 無(wú)機(jī)元素指紋譜的建立將所有樣品按各自所屬的基源,取其無(wú)機(jī)元素含量的均值,根據(jù)定量測(cè)定的結(jié)果,篩選出16種元素建立指紋圖譜,為了繪制過(guò)程方便,將一些含量懸殊的元素同時(shí)縮小或擴(kuò)大一定的倍數(shù)至同一數(shù)量級(jí)(K縮小1 000倍,Ca縮小100倍,Na、Al、Fe縮小10倍,Cr、Ni、Mo、Cd、Pb放大10倍,As、Se放大100倍),繪制結(jié)果見(jiàn)圖2.該指紋圖譜表明,不同基源川貝母藥材中的Fe、Al、As、Mo、Ba具有相似峰形,且Fe>Al>As>Mo≈Ba,可作為川貝母與其它藥材的無(wú)機(jī)指紋圖譜的區(qū)別特征.而各基源的川貝母藥材中的無(wú)機(jī)元素差異,可根據(jù)相應(yīng)的特征曲線來(lái)區(qū)分.

圖 2 6種不同基源川貝母無(wú)機(jī)元素指紋譜

2.8 無(wú)機(jī)元素間的主成分分析(PCA)為了闡明川貝母藥材中無(wú)機(jī)元素的關(guān)聯(lián)關(guān)系,應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)川貝母中的16種無(wú)機(jī)元素進(jìn)行主成分分析(PCA).

主成分的特征值及貢獻(xiàn)率是選擇主成分的依據(jù),表4描述了主成分分析初始解對(duì)原有變量的總體描述情況.從中可以看出,前6個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)71.78%,它們代表了川貝母藥材中大多數(shù)無(wú)機(jī)元素的信息.

表 4 特征值及貢獻(xiàn)率

KMO統(tǒng)計(jì)量與Bartelett球形檢驗(yàn)結(jié)果顯示,KMO統(tǒng)計(jì)量=0.674,球形檢驗(yàn)卡方統(tǒng)計(jì)量=762.040,P<0.01,適于因子分析.

由因子載荷矩陣表(表5)可以看出,第1個(gè)主成分和K、Mo、B呈正相關(guān),第2個(gè)主成分和Al、Fe、Pb呈正相關(guān),第3個(gè)主成分和Se、Mn呈正相關(guān),第4個(gè)主成分和Cd呈正相關(guān),第5個(gè)主成分和Cr呈正相關(guān),第6個(gè)主成分和Na呈正相關(guān).因?yàn)榭偡讲畹?1.78%的貢獻(xiàn)來(lái)自于前6個(gè)主成分,因此可以認(rèn)為K、Mo、B、Al、Fe、Pb、Se、Mn、Cd、Cr、Na是川貝母藥材的特征無(wú)機(jī)元素.

2.9 無(wú)機(jī)元素量間的相關(guān)性分析應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,各無(wú)機(jī)元素含量間相關(guān)性結(jié)果見(jiàn)表6.結(jié)果顯示,有22對(duì)元素極顯著正相關(guān)(P<0.01),10對(duì)元素為正相關(guān)(P<0.05)；有5對(duì)元素極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)：B-Ba、Ca-Ba、K-Ba、Mo-Ba、Ni-Mo；4對(duì)元素為負(fù)相關(guān)(P<0.05)：Al-K、K-Ni、Ca-Ni、Mn-Fe.上述顯正相關(guān)的元素對(duì)可能有一定相互協(xié)調(diào)、促進(jìn)吸收的關(guān)系,而顯負(fù)相關(guān)的元素對(duì)則可能有一定相互拮抗、阻礙吸收的關(guān)系,其結(jié)果可為進(jìn)一步開(kāi)展川貝母藥材在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生理生化機(jī)制及施肥策略提供參考.

表 5 旋轉(zhuǎn)變換后的因子矩陣

表 6 川貝母藥材無(wú)機(jī)元素含量間相關(guān)性分析

*:P<0.05;**:P<0.01

2.10 依據(jù)無(wú)機(jī)元素含量對(duì)其品種的判別分析為進(jìn)一步分析川貝母藥材中元素特征和各品種之間的相關(guān)性,本實(shí)驗(yàn)對(duì)16種含量差異顯著的元素進(jìn)行了逐步判別分析,篩選出對(duì)川貝母藥材品種判別有效的變量,建立數(shù)學(xué)判別模型.分析結(jié)果表明,Na、K、Cr、Se、Cd 5種元素被篩選出來(lái)并用于建立判別函數(shù)模型,線性判別方程系數(shù)見(jiàn)表7.

表 7 Fisher線性判別函數(shù)

對(duì)建立的模型進(jìn)行回代檢驗(yàn)和交叉檢驗(yàn),典型判別函數(shù)散點(diǎn)圖見(jiàn)圖3,判別結(jié)果見(jiàn)表8.結(jié)果表明,80批樣品中回代檢驗(yàn)和交叉檢驗(yàn)的整體判別正確率分別為76.3%和71.3%,這說(shuō)明多種元素含量對(duì)川貝母藥材品種的判別有較好的判別效果.其中,對(duì)梭砂貝母和太白貝母的正確判別率高達(dá)90%以上；其次為甘肅貝母和瓦布貝母,均為71.4%；而卷葉貝母和暗紫貝母的組質(zhì)心距離很近,導(dǎo)致判別率偏低.

圖 3 典型判別函數(shù)散點(diǎn)圖

表 8 判別分析的分類(lèi)結(jié)果

3 討論

中藥中無(wú)機(jī)元素對(duì)其藥材本身而言,可影響其植物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)吸收及生理代謝過(guò)程,進(jìn)而影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成和累積；對(duì)人體而言,可與體內(nèi)的多種配體形成配位鍵,進(jìn)而參與體內(nèi)的代謝過(guò)程或協(xié)調(diào)體內(nèi)物質(zhì)平衡[8].因此,無(wú)機(jī)元素是評(píng)價(jià)藥材品質(zhì)的重要指標(biāo)之一.電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)是無(wú)機(jī)元素的測(cè)定方法之一,因其具有線性范圍寬、靈敏度高、分析速度快、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用在食品和藥品等領(lǐng)域的多元素同時(shí)分析測(cè)定[11-15].

本研究采用ICP-MS對(duì)80批川貝母藥材中21種無(wú)機(jī)元素進(jìn)行了測(cè)定及分析.同時(shí),對(duì)川貝母樣品微波消解條件進(jìn)行了篩選,最終選擇7 mL硝酸按文中的消解程序進(jìn)行消解,該消解程序是經(jīng)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期摸索得到的,經(jīng)過(guò)多個(gè)中藥品種、長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)證明,能夠滿(mǎn)足大多數(shù)中藥品種的消解.試驗(yàn)結(jié)果表明,川貝母藥材中K、Ca、Fe、Al、Na的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過(guò)100 μg/g；Mn、Ba、Cu、B、Ni、Cr、Mo、Pb、Cd、As、Se、Dy的含量相對(duì)較低；Sn、Be、Sn的檢出率低；Tb未檢出；參照《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》重金屬及有害元素的限量標(biāo)準(zhǔn),僅有一批川貝母藥材(太白貝母)中的Cu含量超標(biāo).根據(jù)不同基源川貝母無(wú)機(jī)元素指紋譜圖可以看出,雖然不同基源的川貝母藥材無(wú)機(jī)元素含量有一定差異,但其元素分布規(guī)律基本呈相似的趨勢(shì).主成分分析結(jié)果表明,K、Al、Mo、B、Al、Fe、Pb、Se、Mn、Cd、Cr、Na是川貝母藥材的特征無(wú)機(jī)元素.相關(guān)性分析結(jié)果表明,有27對(duì)元素極顯著相關(guān),正或負(fù)相關(guān)性元素對(duì)表明這些無(wú)機(jī)元素在累積吸收過(guò)程中可能具有一定的協(xié)同或拮抗作用.采用逐步判別分析法表明,本研究所建判別函數(shù)模型對(duì)梭砂貝母和太白貝母的正確判別率高達(dá)90%以上,為川貝母的基源鑒別提供了新的參考方法.

綜上所述,本研究建立了ICP-MS法同時(shí)分析川貝母藥材中無(wú)機(jī)元素含量的方法,對(duì)不同品種基源的川貝母藥材進(jìn)行比較分析,獲得了其無(wú)機(jī)元素含量測(cè)定的準(zhǔn)確數(shù)據(jù),同時(shí)建立了不同基源川貝母藥材的無(wú)機(jī)元素指紋譜,并用SPSS 25.0進(jìn)行了相關(guān)性分析、主成分分析,從而為市售川貝母藥材或飲片的質(zhì)量控制及安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)的參考依據(jù).

致謝成都大學(xué)?；痦?xiàng)目(2017XJZ03) 、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2018CC25)對(duì)本文給予了資助,謹(jǐn)致謝意.