夏培斌，余劉洋，王超威，閆立論，劉志遠(yuǎn)，張 鐳，程 杰，崔景強(qiáng)

（1.河南省醫(yī)用高分子材料技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 長垣 453400；2. 河南駝人醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司，河南 長垣 453400；3.甘肅省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測所，甘肅 蘭州 730070）

3D生物打印是生物制造、添加劑制造、組織工程和再生醫(yī)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物。使用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件，使用機(jī)器人計(jì)算機(jī)輔助制造過程堆疊和組裝連續(xù)的生物和/或非生物材料層來設(shè)計(jì)并生產(chǎn)活的3D結(jié)構(gòu)，目的是人工開發(fā)活組織和器官的等價(jià)物，以用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和生物學(xué)的研究[1]。

生物墨水在決定生物制造過程的能力和打印結(jié)構(gòu)的分辨率方面起著關(guān)鍵作用。GelMA具有優(yōu)異的生物相容性、可調(diào)的物理特性以及易于化學(xué)或生物修飾的特性，因此成為制造各種組織或器官生物的生物墨水的一個(gè)有吸引力的選擇。GelMA是一種基于明膠的工程材料，已被證明可用于組織工程、藥物輸送、細(xì)胞培養(yǎng)和3D打印等領(lǐng)域[2]。明膠側(cè)鏈上的大量氨基可被甲基丙烯酸酐（MA）中的甲基丙烯?；〈纬筛男悦髂z，該化學(xué)修飾一般只涉及摩爾比不到5%的氨基酸殘基，這意味著大多數(shù)的功能性氨基酸基序不會(huì)受到顯著影響。GelMA不僅保持了良好的生物相容性、較低的免疫原性和促進(jìn)細(xì)胞生長的能力，而且在光引發(fā)劑的存在下，在紫外光的照射下，具有形成熱穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)的特性。基于GelMA水凝膠的生物墨水，為3D打印組織器官的研究提供了良好的平臺(tái)。

本文總結(jié)了GelMA水凝膠的合成和性能表征，以及其在3D生物打印組織工程領(lǐng)域的研究及應(yīng)用進(jìn)展，以期為GelMA在生物醫(yī)學(xué)3D打印領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 GelMA水凝膠的合成方法

已經(jīng)報(bào)道的制備GelMA的方法，基本都是在Bulcke等[3]首次報(bào)道的方法上進(jìn)行微小改變后的方法（圖1）。合成方法：將明膠加入磷酸鹽緩沖液中，50℃下攪拌至完全溶解，然后以一定的速率加入MA，反應(yīng)3h。混合溶液用 PBS 稀釋以停止反應(yīng)，透析5～7d，以完全去除具有潛在細(xì)胞毒性的低分子量雜質(zhì)。將透析液冷凍干燥后冷藏待用。調(diào)節(jié)反應(yīng)物中MA的加入量，可以實(shí)現(xiàn)不同程度的甲基丙烯酰基取代。

圖1 GelMA的合成原理（A）及水凝膠的制備（B）[4]Fig.1 Schematic of GelMA (A) and the fabrication of its hydrogels (B）

2 GelMA水凝膠的表征

2.1 取代度

取代度是指官能化氨基與原始可用氨基之間的比率。不同的取代度對GelMA水凝膠的物理及生物特性都有顯著影響。表征GelMA取代度的方法主要有2種，一種是傳統(tǒng)方法即三硝基苯磺酸（TNBS）法，另一種是1H-NMR法。

TNBS法是用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)標(biāo)記游離氨基的比色法，通過與已知甘氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，從而對游離氨基進(jìn)行定量。1H-NMR法通過計(jì)算改性氨基與原始氨基的峰面積之比，來評估甲基丙烯酰胺改性明膠的取代度。

2.2 相轉(zhuǎn)變溫度

GelMA在應(yīng)用于3D打印組織工程時(shí)，相轉(zhuǎn)變溫度在打印過程中至關(guān)重要。高于相轉(zhuǎn)變溫度打印，墨水黏度低，在擠壓打印中不成形，只有在低于相轉(zhuǎn)變溫度4℃左右時(shí)，水凝膠經(jīng)擠出剪切后，會(huì)通過物理交聯(lián)迅速自愈合，再經(jīng)紫外光固化即可具有良好的機(jī)械性能。

2.3 凝膠孔隙率及孔徑

在大多數(shù)應(yīng)用中，水凝膠的基本功能與凝膠內(nèi)的孔隙大小和孔隙分布有關(guān)，材料應(yīng)滿足一定的要求[5]。實(shí)際應(yīng)用中，需要高孔隙率來支持氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞擴(kuò)散，并從基質(zhì)中排出代謝廢物。此外，孔隙的相互連通性對促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成等也很重要[6]。水凝膠是由親水性聚合物在水中或生物液體中膨脹而形成的交聯(lián)的大分子網(wǎng)絡(luò)，在植入后，水凝膠孔隙可允許局部血管生成，這是血管化組織的關(guān)鍵要求。因此，控制支架孔隙率和孔徑大小在工程組織性能的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。

2.4 黏彈性

生物打印技術(shù)已被用于生產(chǎn)基于GelMA的具有受控結(jié)構(gòu)的3D構(gòu)造，從而應(yīng)用于各種組織工程。在基于擠出的3D生物打印中，應(yīng)該考慮的重要參數(shù)之一是生物墨水的黏度。黏度是生物油墨的基本特性，會(huì)影響印刷質(zhì)量和加工以及細(xì)胞活力[7]，對印刷適用性和生物功能有很大影響。通常，用于3D生物打印的聚合物溶液應(yīng)該具有高黏度和高觸變指數(shù)，以便在處理后能保持其形狀。

2.5 溶脹性

作為3D生物打印組織工程的支架，印刷膠體構(gòu)造物的相容性在經(jīng)歷冷凍干燥和再膨脹后，不會(huì)表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學(xué)變化，這為它們的臨床可譯性提供了新的機(jī)會(huì)?；谒z的生物材料通常面臨與儲(chǔ)存性和滅菌相關(guān)的挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)可以通過將這些材料加工成冷凍干燥的結(jié)構(gòu)來克服，從而使其能夠“現(xiàn)成”應(yīng)用。

2.6 降解性

不受控制的快速降解是GelMA在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的主要挑戰(zhàn)[8]。組織支架的基本職責(zé)，是在整個(gè)結(jié)構(gòu)的預(yù)期使用壽命內(nèi)保持細(xì)胞增殖和所需的細(xì)胞分布。許多情況下，支架的壽命應(yīng)一直持續(xù)到降解完成。因此，在再生醫(yī)學(xué)水凝膠的設(shè)計(jì)中，一個(gè)要考慮的重要因素，是支架在生物降解和愈合過程中的功能依賴性在支架和新生組織之間的轉(zhuǎn)變。

2.7 力學(xué)性能

由于不同的自然組織對機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)不同，理想的植入材料應(yīng)與目標(biāo)組織的力學(xué)性能密切匹配。作為修復(fù)和再生各種器官和組織的材料，GelMA的機(jī)械性能的可調(diào)性至關(guān)重要?；|(zhì)環(huán)境的力學(xué)性能已被證明會(huì)影響細(xì)胞的功能和分化。

3 3D生物打印組織工程的研究進(jìn)展

組織工程提供了巨大的潛力，以克服器官移植短缺和藥物篩選。在研究分子現(xiàn)象時(shí)會(huì)涉及一些生物功能，如組織形態(tài)發(fā)生、傷口愈合、炎癥反應(yīng)等。然而，傳統(tǒng)的微加工技術(shù)無法創(chuàng)建復(fù)雜的多尺度結(jié)構(gòu)，如血管內(nèi)皮與周圍結(jié)締組織和薄壁細(xì)胞之間的界面[9]等。為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，生物打印成為一種能夠在工程組織構(gòu)建中創(chuàng)建高度有序的三維血管網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)，以促進(jìn)氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和廢物的運(yùn)輸。

3.1 血管

由創(chuàng)傷或疾病引起的血管損傷具有嚴(yán)重的發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)。雖然人造血管移植物已成功應(yīng)用于臨床，但它們目前只適用于大直徑血管（6mm）。在世界范圍內(nèi)，小直徑血管的置換仍然面臨著重大的臨床挑戰(zhàn)。

Zhou等人設(shè)計(jì)了一種由明膠甲基丙烯酰（Gel-MA）、聚乙二醇二丙烯酸酯、海藻酸鹽、裂解酶的VSMCs等組成的新型生物墨水，利用先進(jìn)的同軸3d生物繪圖儀平臺(tái)，創(chuàng)建了可仿生2種不同的細(xì)胞層[血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）和血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）]的新型、可調(diào)節(jié)的小直徑血管。分別在血管基質(zhì)和管腔中，對通常與血管生成現(xiàn)象相關(guān)的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和分化簇31標(biāo)記物進(jìn)行染色，結(jié)果直觀地證實(shí)了細(xì)胞的增殖，并通過基因分析對結(jié)果進(jìn)行了定量驗(yàn)證，結(jié)果表明制備的小直徑血管有良好的新生血管表達(dá)。

Jia等人[10]報(bào)告了一種多功能3D生物打印血管。首先設(shè)計(jì)了一種特殊細(xì)胞響應(yīng)型的生物墨水，該墨水由GelMA、海藻酸鈉及四臂聚（-乙二醇）四丙烯酸酯（PEGTA）組成，與多層同軸擠壓系統(tǒng)結(jié)合使用，可實(shí)現(xiàn)直接3D生物打印。這種混合生物墨水顯示出良好的生物學(xué)特性，支持被包裹的內(nèi)皮細(xì)胞和干細(xì)胞在生物打印結(jié)構(gòu)中的擴(kuò)散和增殖，可促進(jìn)生物相關(guān)的、高度組織的、可灌注血管的形成。這種新型3D生物打印技術(shù)可用于制造可灌注血管，性能優(yōu)于傳統(tǒng)的微制造或犧牲模板方法。

Lee等人[11]提出了一種高度生物相容的重組人彈性蛋白生物墨水，可用于復(fù)雜軟組織的3D生物打印。該生物墨水由GelMA及甲基丙烯酰胺取代的重組人彈性蛋白（MeTro）組成，可在可見光下交聯(lián)。兩種生物聚合物的協(xié)同結(jié)合，使得高分辨率打印具有很大的細(xì)胞活力，打印的心肌細(xì)胞具有內(nèi)皮屏障功能和心肌細(xì)胞的自發(fā)性搏動(dòng)，這是心肌組織在體內(nèi)的重要功能。此外，在皮下移植大鼠體內(nèi)的研究中，打印的結(jié)構(gòu)引起最小的炎癥反應(yīng)，并被證明在體內(nèi)可有效地生物降解。

3.2 仿生器官

隨著人口老齡化的加速，移植器官的來源不足已經(jīng)成為一項(xiàng)亟需解決的社會(huì)問題，生物3D打印是解決該問題的最佳途徑。在政策與資本的推動(dòng)下，3D打印技術(shù)得到蓬勃發(fā)展，但是受限于生物材料技術(shù)的發(fā)展，生物活性仿生組織器官3D打印技術(shù)的發(fā)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后。通過一種快速和直接的方法，發(fā)展具有血管網(wǎng)絡(luò)的工程組織或器官是組織再生的一個(gè)重要方向。近幾年，大尺寸器官的體外重建及長期功能化培養(yǎng)，成為一個(gè)研究重點(diǎn)?？偟膩碚f，器官打印及替換是生物3D打印研究的長期目標(biāo)，需要科研工作者開展進(jìn)一步的深入研究。

Mao等人[12]設(shè)計(jì)制造了一種具有內(nèi)齒輪狀結(jié)構(gòu)的新型肝組織，該組織具有更大的體表面積，以促進(jìn)肝臟功能的恢復(fù)。該方法將GelMA與去細(xì)胞化的肝細(xì)胞外基質(zhì)（dECM）結(jié)合，制備了肝臟特異性生物墨水，并將人誘導(dǎo)的肝細(xì)胞（hiHep細(xì)胞）封裝成負(fù)載細(xì)胞的生物墨水，采用基于DLP的生物打印技術(shù)制備了肝臟顯微組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GelMA生物墨水中加入肝臟dECM后，hiHep細(xì)胞在肝臟微組織中可擴(kuò)散得更遠(yuǎn)，具有更好的肝細(xì)胞特異性功能（白蛋白和尿素分泌）。這將是一種潛在的肝組織工程產(chǎn)品，可幫助恢復(fù)肝臟功能。

Marie等人[13]利用GelMA水凝膠，混合Huh7和HepaRG這2個(gè)肝細(xì)胞系，通過開發(fā)的三維擠壓生物打印過程，打印了一個(gè)復(fù)雜的肝臟模型。打印的結(jié)構(gòu)顯示了長期的生存能力（28d）、增殖能力、相關(guān)的肝細(xì)胞表型和功能，與使用標(biāo)準(zhǔn)DMSO處理的2D結(jié)構(gòu)性能相當(dāng)或更好。

3.3 皮膚修復(fù)

對于現(xiàn)有的生物打印技術(shù)來說，制造適合移植的器官仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，原因主要是無法再現(xiàn)器官復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)、機(jī)械特性和生物功能。全層皮膚缺損的治療在臨床中仍然是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。三維生物打印技術(shù)為制造皮膚替代品提供了一種很有前途的方法。Jin等人[14]成功制備了脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（ADM）和GelMA的生物墨水，并提出了一種新的3D結(jié)構(gòu)以模擬天然全層皮膚，其中20%的GelMA以HaCaTs為表皮層，1.5%的ADM以成纖維細(xì)胞為真皮層，10%的GelMA mesh以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）為血管網(wǎng)絡(luò)和框架。結(jié)果表明，該3D生物打印功能皮膚模型（FSM）不僅能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，還能支持體外表皮重建。在體內(nèi)移植后，F(xiàn)SM可維持細(xì)胞活力至少1周。此外，F(xiàn)SM可促進(jìn)創(chuàng)面愈合和上皮再生，刺激真皮ECM分泌和血管生成，可提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。

Zhou等人[15]利用新設(shè)計(jì)的基于GelMA水凝膠的仿生生物墨水，以及基于數(shù)字光處理（DLP）的3D打印技術(shù)，開發(fā)了一種打印功能性活膚（FLS）的新方法。FLS具有相互連接的微通道，可促進(jìn)細(xì)胞的遷移、增殖和新組織的形成。該生物墨水具有快速的凝膠動(dòng)力學(xué)、可調(diào)諧的力學(xué)性能、良好的生物相容性和組織黏附性?；贒LP的3D打印技術(shù)，提供了一種快速精確定位簇狀人皮膚成纖維細(xì)胞（HSFs）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的方法，具有較高的細(xì)胞活力，可形成FLS。FLS通過模擬天然皮膚的生理結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)皮膚再生和新生血管的高效形成，并具有較強(qiáng)的機(jī)械和生物黏附性能，易于操作和植入創(chuàng)面。體內(nèi)研究結(jié)果表明，活體皮膚具有即時(shí)防御功能，在促進(jìn)大型動(dòng)物皮膚附肢真皮再生方面具有突出的表現(xiàn)。

4 結(jié)語

GelMA以天然高分子明膠為原料，通過化學(xué)改性制備。光交聯(lián)甲基丙烯?；〈囊?，使得在光引發(fā)劑存在的情況下，GelMA暴露在光照射下時(shí)可方便和快速地凝膠化。雖然GelMA水凝膠的研究報(bào)道很多，但在臨床應(yīng)用中，保證3D生物打印植入人體后細(xì)胞能增殖分化，仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。此外，GelMA的明膠來源、合成方法、植入后的安全性評價(jià)等，仍沒有健全的標(biāo)準(zhǔn)。展望未來，隨著研究工作的不斷深入，基于GelMA水凝膠的生物材料一定會(huì)在3D生物打印領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。