朱 斌，鄭錦麗，梁 犇，史 娟，郭少波

（陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723001）

糖尿病是一種臨床常見(jiàn)病，2017年的調(diào)查顯示，中國(guó)Ⅱ型糖尿病人約有1.14億，預(yù)測(cè)到2035年，該病例數(shù)將增加到約5.92億人次，糖尿病的發(fā)病人群逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1-2]。目前臨床針對(duì)Ⅱ型糖尿病的治療方案仍以藥物治療為主，包括胰島素及類似物、磺酰脲類促泌劑、二甲雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑等。其中，α-葡萄糖苷酶抑制劑通過(guò)抑制小腸黏膜刷狀緣的α-葡萄糖苷酶，延緩碳水化合物的吸收，從而降低餐后高血糖。目前市場(chǎng)上銷售的用于治療糖尿病的藥物阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等均為α-葡萄糖昔酶抑制劑。中醫(yī)藥治療糖尿病較為經(jīng)典的名方如腎氣丸、六味地黃丸、消渴方、白虎加人參湯等方藥沿用至今，近年來(lái)對(duì)單體如黃連素、民族藥如苗藥糖寧通絡(luò)等的研究，受到國(guó)際關(guān)注[3]。

酢漿草是酢漿草屬的一種闊葉草本植物，別稱大酸葉草，在我國(guó)長(zhǎng)江流域及西南分布廣泛?，F(xiàn)代植物化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，酢漿草中含有黃酮類、酚酸類、生物堿類、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，其藥理活性研究主要集中在抑菌、抗腫瘤、抗焦慮、抗癲癇、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、肝腎保護(hù)、促進(jìn)骨形成等方面[4-5]。Rodriguez等人[6]報(bào)道，酢漿草具有一定的降糖作用。本實(shí)驗(yàn)以酢漿草提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為指標(biāo)，在優(yōu)化提取溶劑的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面法，對(duì)酢漿草α-葡萄糖苷酶抑制成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為酢漿草提取物未來(lái)應(yīng)用于臨床糖尿病治療提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

酢漿草，α-葡萄糖苷酶，4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）。磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、石油醚、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、正丁醇、二甲基亞砜（DMSO）(均為分析純)。自制超純水。

1.2 主要儀器

KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器，DLSB-5/30低溫冷卻液循環(huán)泵，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，DF-1集熱式磁力攪拌器，Cary 5000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

參考文獻(xiàn) [7]的方法，測(cè)試酢漿草提取物對(duì)α-葡萄糖酶水解p-NPG為4-硝基苯酚的抑制活性，判斷酢漿草對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活力，計(jì)算方法如式(1)所示：

其中，X=A對(duì)照組-A空白組；Y=A實(shí)驗(yàn)對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組。

1.3.2 原料預(yù)處理

酢漿草干燥、粉碎→石油醚脫脂→濾渣烘干待用。

1.3.3 提取溶劑的選擇

稱取4份（2.0g）經(jīng)預(yù)處理的酢漿草粉末，按液料比20∶1(mL∶g)分別加入超純水、正丁醇、乙酸乙酯和乙醇，于70℃下提取120 min。提取液按1.3.1的方法進(jìn)行測(cè)試，并計(jì)算其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率，以確定最佳提取溶劑。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

以抑制率為指標(biāo)，考察超聲預(yù)處理時(shí)間、提取時(shí)間、提取溫度及液料比等因素在不同水平值下，所得的酢漿草提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果的影響。每組進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.3.5 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取提取時(shí)間(A)、超聲預(yù)處理時(shí)間(B)、液料比(C)、提取溫度(D)這4個(gè)因素作為自變量[8]，編碼水平為-1、0、1，各實(shí)驗(yàn)因素編碼和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素及水平

1.4 酢漿草α-葡萄糖苷酶抑制成分的純化

將所得的酢漿草α-葡萄糖苷酶抑制成分提取浸膏分為3份，加入相同體積的水之后超聲，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。將有機(jī)相減壓旋蒸后，用少量中性氧化鋁粉末拌勻，烘干，進(jìn)行硅膠柱層析[9]。所得洗脫液濃縮后分別進(jìn)行抑制率測(cè)定，以確定最優(yōu)純化方式。

1.5 酢漿草α-葡萄糖苷酶抑制劑的最佳濃度

將純化后旋干所得的浸膏加DMSO溶解后，配成1、2、4、6、8、10 mg·mL-1的抑制劑，按1.3.1的方法進(jìn)行測(cè)試，并計(jì)算其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率，以確定最佳抑制濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。由Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并分析，利用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑降糖效果的比較

分別以石油醚、水、正丁醇、乙酸乙酯、乙醇為溶劑，得到相同提取條件下，不同溶劑提取的酢漿草α-葡萄糖苷酶抑制成分的降糖效果，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)可得到最優(yōu)的抑制率，故選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

圖1 不同的提取溶劑對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)抑制率的影響

5份酢漿草粉末按照30∶1( mL∶g)的液料比加入溶劑中超聲預(yù)處理10 min后，在70℃下分別提取60、90、120、150、180 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。提取時(shí)間在60～120min內(nèi)，抑制率逐漸上升；120min時(shí)抑制率開(kāi)始下降，160 min時(shí)出現(xiàn)陡降。原因是溶劑進(jìn)入酢漿草植物細(xì)胞，以及細(xì)胞內(nèi)的有效成分傳遞到溶劑，均需要消耗一定的時(shí)間，這有助于α-葡萄糖苷酶抑制成分溶出，使降糖效果提高。但長(zhǎng)時(shí)間、較高溫度的提取，會(huì)導(dǎo)致活性物質(zhì)發(fā)生變性、分解，導(dǎo)致抑制率降低[10]，因此最合適的提取時(shí)間為120 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)抑制率的影響

2.2.2 超聲預(yù)處理時(shí)間對(duì)抑制率的影響

提取溫度70℃，提取時(shí)間120min，液料比30∶1(mL∶g)，研究超聲預(yù)處理時(shí)間的改變對(duì)酢漿草提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，超聲預(yù)處理時(shí)間為10 min時(shí)，抑制率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加預(yù)處理時(shí)間，抑制率略有降低。超聲預(yù)處理加速了植物細(xì)胞壁的破裂，有助于酢漿草有效成分的溶出。導(dǎo)致抑制率下降的可能原因，是過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間導(dǎo)致某些熱不穩(wěn)定組分遭到破壞[8]，因此選擇最優(yōu)超聲時(shí)間為10min。

圖3 超聲預(yù)處理時(shí)間對(duì)抑制率的影響

2.2.3 液料比對(duì)抑制率的影響

在酢漿草粉末中加入提取溶劑，固定超聲預(yù)處理時(shí)間10min，提取溫度70℃，提取時(shí)間120min，改變液料比，測(cè)試提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，液料比為30∶1 (mL∶g)時(shí)有最大的抑制率84.4%。提高液料比可確保藥材和提取溶劑有充分的接觸面積，從而使有效成分能溶解完全。因此確定最佳液料比為30∶1 (mL∶g)。

圖4 液料比對(duì)抑制率的影響

2.2.4 溫度對(duì)抑制率的影響

如圖5所示，提取溫度在40～70℃時(shí)，抑制率呈上升趨勢(shì)，70℃時(shí)抑制率達(dá)到最高值80.07%，繼續(xù)提高溫度，抑制率迅速下降。故選擇70℃作為最佳提取溫度。

圖5 溫度對(duì)抑制率的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化分析

將單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行處理，可獲得4因素3水平中心組合的29個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，所得的抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.1 方程回歸分析和方差分析

用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)模型方差分析，分析結(jié)果列于表3。以酢漿草α-葡萄糖苷酶抑制成分的抑制率R為因變量，提取時(shí)間(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)、提取溫度(D)為自變量的二階多項(xiàng)式回歸方程為：

二階多項(xiàng)式回歸方程中的線性項(xiàng)、二次項(xiàng)和相互作用項(xiàng)，體現(xiàn)自變量對(duì)響應(yīng)值的影響[10]，其數(shù)值反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，數(shù)值越大，則影響越大。回歸方程系數(shù)為正值則表示各變量對(duì)響應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)，為負(fù)值則表示反向關(guān)系[11]。P值可用于確定模型和系數(shù)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表3的分析結(jié)果可知，所選用模型的P＜0.0001且失擬項(xiàng)不顯著(P=0.3349＞0.05)，表明模型的可靠性相對(duì)較高，也說(shuō)明回歸方程的擬合精度較高。模型的確定系數(shù)R2=0.9141，模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.8283，說(shuō)明該模型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有較好的擬合度，所以用該模型來(lái)描述抑制率與提取條件間的關(guān)系較適合，可用于初步分析和預(yù)測(cè)酢漿草的高效提取工藝參數(shù)。由此可知，方程的1次項(xiàng)A、B對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著，C、D對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。平方項(xiàng)A2、B2、D2對(duì)響應(yīng)值的影響極為顯著，C2對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。交互項(xiàng)AB極為明顯，BD對(duì)響應(yīng)值的作用是顯著。各個(gè)因素的F值都能夠直觀反映各個(gè)因素受影響的程度和大小，F(xiàn)值越高，其對(duì)響應(yīng)值的影響越大[12]。對(duì)各單個(gè)因素進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A=12.63，F(xiàn)B=15.36，F(xiàn)C=7.10，F(xiàn)D=5.11。各單因素對(duì)酢漿草抗糖抑制率影響的大小順序?yàn)椋撼曨A(yù)處理時(shí)間＞提取時(shí)間＞液料比＞提取溫度。

表3 回歸模型方差分析

2.3.2 因素交互作用分析

為進(jìn)一步分析提取時(shí)間、超聲波時(shí)間、液料比、溫度對(duì)抑制率的影響，固定其中2個(gè)變量，得到另外2個(gè)因素相互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖6和圖7。對(duì)比表3可知，提取時(shí)間與超聲預(yù)處理時(shí)間、超聲預(yù)處理時(shí)間與溫度這2組交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，其他因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。

圖6 超聲預(yù)處理和提取時(shí)間的響應(yīng)面和等高線

圖7 超聲預(yù)處理和溫度的響應(yīng)面和等高線

2.3.3 最佳工藝條件的確定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由Design-Expert 8.0.6程序，模擬得出最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間135.6 min、超聲預(yù)處理時(shí)間12.12 min、液料比31.93∶1 ( mL∶g)、溫度71.61℃，此時(shí)抑制率為85.01%。為驗(yàn)證響應(yīng)面的可信度，結(jié)合實(shí)際情況，得到酢漿草最佳的提取條件是：液料比30∶1(mL∶g)、超聲時(shí)間10 min、提取時(shí)間120 min、溫度70.0 ℃，此時(shí)抑制率為84.4%，與推測(cè)相符，說(shuō)明本文采用的優(yōu)化方案是合理的。

2.4 最佳純化溶劑的確定

由1.4純化所得的3種酢漿草α-葡萄糖苷酶抑制成分的降糖抑制率如圖8所示，可知正丁醇萃取后的純化物效果較好。后續(xù)實(shí)驗(yàn)確定采用正丁醇二次萃取物過(guò)柱純化后的產(chǎn)品。

圖 8 不同萃取劑得到的純化物的抑制率

2.5 最佳測(cè)試濃度的確定

從圖9可知，酢漿草α-葡萄糖苷酶抑制成分濃度增加所導(dǎo)致的抑制率結(jié)果，可分為急速增長(zhǎng)區(qū)和平緩區(qū)。在1～6 mg·mL-1范圍內(nèi)，抑制率從65.9%急速增長(zhǎng)至84.6%；在6～10mg·mL-1范圍內(nèi)，抑制率基本維持在82%～83%。從節(jié)約成本和確保抑制效果兩方面考慮，選擇6mg·mL-1為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的抑制劑濃度。

圖9 最佳抑制濃度的確定

3 結(jié)論

本文以酢漿草為原料，考察了超聲預(yù)處理時(shí)間、提取時(shí)間、液料比、提取溫度等因素對(duì)酢漿草α-葡萄糖苷酶抑制成分降糖效果的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了酢漿草有效成分的提取工藝。結(jié)果表明，影響酢漿草降糖有效成分提取的因素順序?yàn)椋撼曨A(yù)處理時(shí)間＞提取時(shí)間＞液料比＞溫度。最佳提取工藝條件為：超聲時(shí)間10 min、提取時(shí)間120 min、液料比30∶1(mL∶g)、提取溫度70℃，在此條件下，酢漿草有效成分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為84.4%。