左 梅，譚 軍，向必坤，施河麗，陳紅華，彭五星，尹忠春

湖北省煙草公司恩施州公司，湖北省恩施市市府路65 號 445000

由根結(jié)線蟲引起的病害屬于土傳病害，具有發(fā)生范圍廣、防治難度大、危害嚴(yán)重的特點，在我國主要煙區(qū)均有發(fā)生［1-2］。當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中根結(jié)線蟲的防治仍以化學(xué)藥劑為主，但長期使用化學(xué)藥劑易造成環(huán)境污染，對人畜健康不利［3-4］。而微生物菌劑因其綠色環(huán)保的優(yōu)勢，逐漸成為現(xiàn)代根結(jié)線蟲防控的重要手段。黃闊等［5］研究表明，淡紫擬青霉、枯草芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌3種微生物菌劑均能增加微生物群落的多樣性，有效控制煙草根結(jié)線蟲病害的發(fā)生。Seenivasan［6］的研究顯示熒光假單胞桿菌、淡紫紫孢菌和木霉液體制劑均能在一定程度上減輕胡蘿卜根結(jié)線蟲病害的發(fā)生。

目前，有關(guān)芽孢桿菌用于防治農(nóng)作物根結(jié)線蟲及其他土傳病害的研究較多［7-8］，但對芽孢桿菌的施入改變了土壤中哪些細菌群落，哪些細菌群落在根結(jié)線蟲的防控中起關(guān)鍵作用，以及芽孢桿菌施入土壤前后植株根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的差異等方面的研究還鮮見報道。受微生物培養(yǎng)的限制，傳統(tǒng)微生物組學(xué)分析方法不能充分揭示土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化規(guī)律，而宏基因組測序技術(shù)可不用進行微生物分離和純培養(yǎng)，直接對特定環(huán)境中的總DNA進行提取和鑒定，理論上可獲取所有環(huán)境微生物的基因信息，從而反映環(huán)境中微生物群落的結(jié)構(gòu)和代謝狀況［9］。因此，選取3 種不同的芽孢桿菌（分離篩選自恩施植煙土壤）微生物菌劑施于煙田，利用宏基因組測序技術(shù)分析施用該微生物菌劑對煙株根際細菌群落的影響，并對比施用不同菌劑后煙田根結(jié)線蟲病害的發(fā)病程度，旨在為如何利用微生物菌劑防控?zé)熖锔Y(jié)線蟲提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為云煙87。供試菌株1 000 億活孢子/g B3 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus B3）、1 000億活孢子/g B9 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus B9）、1 000億活孢子/g S2蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides S2）均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙秀云老師團隊從恩施煙區(qū)的煙田中分離篩選獲得。B3 蠟樣芽孢桿菌和B9 蠟樣芽孢桿菌雖同為蠟樣芽孢桿菌，但菌株形態(tài)與殺蟲活性不同。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2019年在湖北省宣恩縣椒園鎮(zhèn)水井坳村3組進行。當(dāng)?shù)爻Ｄ攴N植烤煙，且受根結(jié)線蟲影響嚴(yán)重，土壤中根結(jié)線蟲數(shù)量為5～150 頭/g。試驗地地勢平坦，土壤為山地黃棕壤，有機質(zhì)含量24.75 g/kg，堿解氮含量138.45 mg/kg，速效鉀含量149.32 mg/kg，有效磷含量23.60 mg/kg。

試驗設(shè)置 4 個處理，分別為：T1，B3 蠟樣芽孢桿菌；T2，B9蠟樣芽孢桿菌；T3，S2蕈狀芽孢桿菌；T4，清水對照（CK）。上述微生物菌劑1.5 kg 兌水150 L溶解成混合菌液，分別將3種混合菌液和等量清水對照于煙苗移栽10 d 后進行灌根處理，每株150 mL。每個處理3 次重復(fù)，每個小區(qū)面積37.6 m2，隨機排列，周圍設(shè)置保護行。煙苗于2019年5月1日移栽，除4種試驗處理外其他管理均按常規(guī)措施進行。

1.3 樣品采集

煙葉成熟采收后，各小區(qū)隨機選取15株煙株，挖出其完整根系，采取抖落法除去表面較大土壤團塊及根系上松散粘附的土壤顆粒，再用干凈的毛刷刷取根系周圍約2 mm 粘附的土作為根際土。每5 株的根際土混合為1個樣品，即每個小區(qū)3個樣品。將樣品土壤過20目網(wǎng)篩去除植物碎片等殘體，均勻混合后收集在無菌自封袋中，每個樣品分2份分裝，在2～4 ℃下轉(zhuǎn)移至實驗室進行前處理，分別用于宏基因組測序和線蟲密度指標(biāo)分析。

1.4 測定內(nèi)容與方法

1.4.1 宏基因（Metagenomics）組測序分析

將分裝好的其中1 份土壤樣品轉(zhuǎn)移至塑料離心管并置于液氮罐中冷凍干燥后取出，再用干冰儲存送往北京諾禾致源有限公司進行宏基因組測序分析。DNA 樣品經(jīng)提取并采用Qubit?2.0 Flurometer（美國Life Technologies 公司）檢測合格后，使用Covaris ME220超聲波破碎儀（美國Covaris公司）隨機打斷，再經(jīng)末端修復(fù)、加A 尾、加測序接頭、純化、PCR擴增（Bio-Rad T100 PCR擴增儀，美國Biorad公司）等步驟進行文庫制備。本批次文庫接頭序列為5′Adapter：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACAC（index）TCTTTCCCTACACGACGCTCTTC CGATCT-3′，3′Adapter：5′-GATCGGAAGAGCACA CGTCTGAACTCCAGTCAC（index）ATCTCGTATG CCGTCTTCTGCTTG-3′，其中下劃線部分為錨定序列，非下劃線部分為引物序列。檢測合格的文庫將采用Illumina PE150 測序儀（美國Illumina 公司）進行測序，測序得到的下機數(shù)據(jù)（Raw data）將用于后期信息分析。測序分析通過去除低質(zhì)量堿基的reads，采用Bowtie2 軟件過濾源于宿主的reads 等手段得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)（Clean data）。對于預(yù)處理后得到的Clean data 使用SOAP denovo組裝軟件進行組裝分析（Assembly analysis），組裝生成的Scaftigs，過濾掉500 bp 以下的片段，并進行統(tǒng)計分析和后續(xù)基因預(yù)測。

1.4.2 線蟲密度分析

將分裝好的另外1 份土壤樣品送往中國科學(xué)院微生物研究所測定南方根結(jié)線蟲密度。參照文獻［10］提取土壤樣品DNA，利用設(shè)計的南方根結(jié)線蟲特異性引物和標(biāo)記進行實時熒光定量PCR 分析［11］。根據(jù)循環(huán)閾值（Ct 值）計算土壤中南方根結(jié)線蟲密度。

1.4.3 根結(jié)線蟲發(fā)病率與病情指數(shù)調(diào)查方法

煙田煙草植株根結(jié)線蟲病害嚴(yán)重程度分級標(biāo)準(zhǔn)為：根部正常的煙株為0 級；少于1/4 的根上有少量根結(jié)的煙株為1級；1/4至1/3的根上有少量根結(jié)的煙株為 3 級；1/3 至 1/2 的根上有根結(jié)的煙株為 5 級；多于1/2的根上有根結(jié)，少量次生根上有根結(jié)的煙株為7 級；所有根上（包括次生根）長滿根結(jié)的煙株為9級。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007 軟件進行數(shù)據(jù)整理，使用DPS 7.65 軟件對數(shù)據(jù)進行Tukey法差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理土壤細菌在門水平上的群落組成分析

由圖1 可見，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）在4個處理中的豐度之和均超過95%。其中變形菌門（Proteobacteria）豐度以 T1 處理最高，T2、T3 處理次之，CK處理最低。放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）豐度則均以CK 處理最高，其中放線菌門（Actinobacteria）以T2、T1次之，T3最低；酸桿菌門（Acidobacteria）則以T2、T3 處理次之，T1 最低。藍細菌門（Cyanobacteria）具有固氮和抵抗不良環(huán)境的功能，在T1、T3 處理中豐度明顯高于CK 處理，且在T3處理中最高。硝化螺旋菌門（Nitrospirae）為T1 處理中特有的細菌門類，其豐度達0.02%。該菌門中的硝化螺旋菌屬（Nitrospira）［13］作為硝化細菌，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，有益于植物的生長發(fā)育。

圖1 不同芽孢桿菌處理土壤中主要細菌門的相對豐度Fig.1 Relative abundances of major bacterial phyla in soils under different Bacillus treatments

2.2 不同處理土壤細菌在屬水平上的群落組成分析

圖2 為各處理煙田土壤中相對豐度超過2%的10 個 屬 ，柄 桿 菌 屬（Caulobacter）、鞘 脂 菌 屬（Sphingobium）、貪噬菌屬（Variovorax）和紅假單胞菌屬（Rhodopseudomona）為各處理土壤中的優(yōu)勢菌屬。 相比3 種加菌處理，CK 處理中類諾卡氏屬（Nocardioides）豐度最高，貪噬菌屬（Variovorax）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）和羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）豐 度 最 低 。 類 諾 卡 氏 菌 屬（Nocardioides）可降解水體或土壤中的吡啶、呋喃、除草劑等有害有機物［14］。貪噬菌屬（Variovorax）為高產(chǎn)鐵載體的主體菌屬，具有一定的固氮功能［15-16］，為土壤中的有益菌屬，在T1處理中豐度最高。亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）耐氨，在土壤中參與硝化作用［17］，在T2 處理中豐度最高。 羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）具有降解纖維素的功能，在T1 處理中最高。Granulicella、柄桿菌屬（Caulobacter）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomona）和中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）在T3處理中豐度最高。伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）屬，在T2 處理中豐度最高，該屬的一些細菌具有生物防治、促進植物生長和生物修復(fù)等功能［18］。

圖2 不同芽孢桿菌處理土壤中主要細菌屬的相對豐度Fig.2 Relative abundances of major bacterial genera in soils under different Bacillus treatments

2.3 不同處理土壤細菌群落在種水平上的主成分（PCA）聚類分析

對不同處理土壤細菌群落結(jié)構(gòu)在種水平上的物種豐度進行主成分聚類分析，分別提取2個主成分，貢獻率分別為58.00%和20.00%（圖3）。由圖3 可見，添加芽孢桿菌的3 個處理（T1、T2、T3）的所有樣本均能較好地與CK 處理分離，說明加菌處理與CK處理樣本中的微生物種群差異較大。3 種加菌處理間的某些樣本雖有重疊，但也存在較大差異。

圖3 基于細菌種水平的主成分PCA分析結(jié)果Fig.3 Results of PCA analysis at species level

2.4 不同處理細菌群落鑒定對比分析

通過Metaphalan方法從各處理土壤中獲取主要菌種208種，其中屬54個，種65個。不同加菌處理與CK 處理中菌種的分布關(guān)系見圖4。由圖4 可知，加菌處理的細菌種數(shù)均大于CK 處理（103 種），且最多的為T1處理（119種），其次為T3處理（113種），最少的為T2 處理（111 種）。加菌處理與CK 處理共有菌種數(shù)最多的為T3 處理（70 種），其次為T1 處理（65種），共有菌種數(shù)最少的為T2處理（59種）。而與CK處理相比特有菌種數(shù)最多的為T1處理，其次為T2處理，最少的為T3處理。

圖4 不同芽孢桿菌處理對土壤中細菌種數(shù)的影響Fig.4 Effects of different Bacillus treatments on soil bacterial species

2.5 不同處理存在顯著差異細菌類群的差異分析

分別將添加不同芽孢桿菌的處理與CK 處理兩兩組合進行分組，通過LDA（線性判別分析）篩選出不同分類水平上在各組中存在顯著差異的細菌類群（圖5），相關(guān)類群豐度統(tǒng)計結(jié)果見表1。由表1和圖5可知，各組間存在顯著差異的微生物類群差異較大。放線菌目（Actinomycetales）均在A組（T1-CK）、B組（T2-CK）及C組（T3-CK）3組中的CK處理中顯著高于加菌處理，而放線菌目類諾卡氏科（Nocardioidaceae）和微桿菌科（Microbacteriaceae）僅在A組與B組中的CK處理中豐度顯著高于對應(yīng)加菌處理。在A 組中假單胞菌科（Pseudomonadaceae）和伯克霍爾德氏菌目無名科（Burkholderiales_noname）在加菌處理T1中顯著高于CK處理，在CK處理中未檢測到該群落，而鏈霉菌科（Streptomycetaceae）則相反，該菌在CK處理中的豐度顯著高于T1。C組中微桿菌科（Microbacteriaceae）在加菌處理T3 中顯著高于CK 處理，其豐度為CK 處理的2.63 倍?？梢?，在土壤中添加芽孢桿菌后改變了土壤中的細菌菌群結(jié)構(gòu)，且不同的芽孢桿菌對土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)的影響不同。

圖5 不同組間細菌類群聚類樹Fig.5 UPGMA trees of different groups

表1 不同分組在不同分類水平上存在顯著差異的細菌類群豐度Tab.1 Bacterial groups with significant differences in abundance at different levels of classification

2.6 不同芽孢桿菌處理對煙草根結(jié)線蟲病害的防控效果

由表2可見，施用3種芽孢桿菌的土壤中根結(jié)線蟲蟲口密度均低于CK 處理，其中T1 處理的根結(jié)線蟲蟲口密度最低，且T1 和T3 處理顯著低于CK 處理。各處理的線蟲病情指數(shù)均顯著低于CK 處理。而不同加菌處理中T1 處理根結(jié)線蟲發(fā)病率和病情指數(shù)最低，且顯著低于T3 處理，T2 處理居中。說明施用3種芽孢桿菌均能不同程度降低根結(jié)線蟲蟲口密度、發(fā)病率和病情指數(shù)，且B3 蠟樣芽孢桿菌的效果最好。

表2 不同處理對根結(jié)線蟲防治效果的影響①Tab.2 Effects of different treatments on control effect of root-knot nematodes

3 討論

從門水平和屬水平上對添加不同芽孢桿菌的根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)B3蠟樣芽孢桿菌能增加土壤中有益菌門硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和有益菌屬貪噬菌屬（Variovorax）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）的豐度，B9 蠟樣芽孢桿菌能增加有益菌屬亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）的豐度，S2 蕈狀芽孢桿菌能增加有益菌屬紅假單胞菌屬（Rhodopseudomona）和中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）的豐度。貪噬菌屬（Variovorax）為高產(chǎn)鐵載體的主體菌屬，而在營養(yǎng)競爭中鐵載體對鐵的競爭常作為很多生防細菌抑制植物病原真菌的重要特征［8］。因而貪噬菌屬（Variovorax）能幫助宿主菌競爭Fe元素，抑制線蟲病原菌的生長，從而抑制根結(jié)線蟲病害的發(fā)生。亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）與硝化螺旋菌門（Nitrospirae）下的菌屬在土壤中參與硝化作用，為煙株的生長提供養(yǎng)分，從而增強煙株抵抗病原菌的抗逆性。

通過對添加不同芽孢桿菌的土壤與對照土壤中的菌種群落進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)不同種類的芽孢桿菌均能不同程度增加土壤中的細菌種類，其中添加B3 蠟樣芽孢桿菌處理的總菌種數(shù)與特有菌種數(shù)最大，細菌菌群最為豐富。另外通過對加菌處理與CK處理中差異顯著的細菌類群進行分析，結(jié)果表明相比CK 處理假單胞菌科（Pseudomonadaceae）在B3 蠟樣芽孢桿菌處理土壤細菌群落中的豐度顯著高于CK 處理，而假單胞菌是抑制根結(jié)線蟲病害的有益微生物，已用作研制作物生產(chǎn)中防治線蟲的生防菌劑［19］。在土壤中施入B3蠟樣芽孢桿菌后，增加了土壤中總體細菌菌群多樣性，特別是增加了其中有益菌的相對豐度。黃闊等［5］的研究結(jié)果表明枯草芽孢桿菌、淡紫擬青霉、熒光假單胞桿菌均能夠促進土壤微生物群落對碳源的整體利用，提高微生物群落的多樣性，與本研究結(jié)論基本一致。而微生物菌群越豐富，與致病菌進行營養(yǎng)競爭越激烈，可在一定程度上抑制根結(jié)線蟲病害的發(fā)生，因而B3蠟樣芽孢桿菌抗根結(jié)線蟲病害的效果最佳。

從3 種芽孢桿菌對根結(jié)線蟲的防控效果來看，3者均能不同程度地降低煙株根際土壤中根結(jié)線蟲的蟲口密度，同時降低根結(jié)線蟲病害的發(fā)病率和病情指數(shù)。其中，根據(jù)計算的發(fā)病率和病情指數(shù)，B3、B9蠟樣芽孢桿菌的效果要優(yōu)于S2蕈狀芽孢桿菌，且均以B3蠟樣芽孢桿菌的效果最好，這可能與芽孢桿菌具有較強的抗菌活性，但不同種類的芽孢桿菌能不同程度抑制根結(jié)線蟲的活性有關(guān)［20］。程萬里等［21］、曾立等［22］的研究表明，多粘類芽孢桿菌 KM2501-1不僅能抑制番茄南方根結(jié)線蟲活性，還能促進植物的生長發(fā)育。張文博等［23］也發(fā)現(xiàn)另外一種芽孢桿菌——貝萊斯芽孢桿菌FZB42 對防治松材線蟲效果較好。

4 結(jié)論

3種芽孢桿菌（B3蠟樣芽孢桿菌、B9蠟樣芽孢桿菌和S2蕈狀芽孢桿菌）均能增加土壤中細菌菌群的種類與部分有益菌群的相對豐度，不同芽孢桿菌對土壤的細菌菌群結(jié)構(gòu)的影響不同。3種芽孢桿菌中，添加B3 蠟樣芽孢桿菌后的根際土壤中細菌菌群最豐富，該菌可顯著增加根際土壤中有益菌假單胞菌科（Pseudomonadaceae）的相對豐度，有效抑制煙株根結(jié)線蟲病害的發(fā)生。3 種芽孢桿菌均可不同程度地降低煙株根結(jié)線蟲病害的發(fā)病率和病情指數(shù)，其中，B3蠟樣芽孢桿菌的效果最好。