魏 楓,程維維,尹雅芙

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,上海 200092)

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）目前影響全球約4 000萬人，是引起認(rèn)知障礙的第一位原因。中國(guó)近2.5億60歲及以上的成年人中癡呆和輕度認(rèn)知障礙（mild cognitive impairment，MCI）的患病率分別為6.04%和15.54%。其中AD患者近3.9%，患病人數(shù)約983萬［1］。過往研究表明2020年60歲以上的癡呆癥患者預(yù)計(jì)是2015年的2.13倍［2］，全國(guó)人口老齡化程度進(jìn)一步加深。60歲及以上老年人中老年癡呆患者約有1 507萬。日前，中國(guó)老齡協(xié)會(huì)發(fā)布《認(rèn)知癥老年人照護(hù)服務(wù)現(xiàn)狀與發(fā)展報(bào)告》和《認(rèn)知癥老年人照護(hù)服務(wù)指南》，中老年癡呆患者預(yù)計(jì)2030年將達(dá)2 220萬，2050年將達(dá)2 898萬［3］。AD占所有癡呆病例的60%～70%，其影響人群廣泛，造成的社會(huì)支持看護(hù)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)極大［4］。但目前對(duì)AD的病因和發(fā)病機(jī)制的了解仍不夠全面深入，臨床也沒有根治的方法。AD一直是醫(yī)學(xué)界亟待攻克的難關(guān)。

AD相關(guān)的動(dòng)物模型對(duì)疾病機(jī)制研究和相關(guān)藥物研發(fā)十分重要［5］。動(dòng)物模型要求能最大程度地復(fù)制人類AD病腦中的重要病理生理表現(xiàn)，即具有β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）聚集形成的胞外β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）和磷酸化微管相關(guān)蛋白Tau異常形成的胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）。這兩大典型的病理表現(xiàn)以及神經(jīng)元丟失、記憶障礙和認(rèn)知功能進(jìn)行性下降等是重要臨床及病理表現(xiàn)［6］。雖然目前沒有動(dòng)物模型能夠完全重復(fù)人類AD的病理表現(xiàn)，但是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型在活體實(shí)驗(yàn)、針對(duì)特定基因、病理進(jìn)行性發(fā)展及藥物應(yīng)用等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。理解特定動(dòng)物模型的特點(diǎn)和局限性對(duì)于以后開展針對(duì)性研究十分重要。

以下介紹現(xiàn)已建立并且應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。

1 Aβ轉(zhuǎn)基因小鼠模型

1.1 APP單轉(zhuǎn)基因小鼠模型

目前，Aβ被普遍認(rèn)為是AD重要的病理表現(xiàn)之一［7］。APP是一種廣泛存在于組織細(xì)胞表面的單次跨膜蛋白，病理?xiàng)l件下降解。長(zhǎng)度為42個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)的Aβ肽具有極強(qiáng)的疏水性，易于聚集，病理?xiàng)l件下細(xì)胞外Aβ42的水平增加。Aβ42肽被認(rèn)為是最具毒性的類型。既往研究認(rèn)為，淀粉樣蛋白單體聚集沉淀形成的Aβ斑塊即老年斑，是AD發(fā)病的主要原因。隨著研究的深入，淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說不斷地被質(zhì)疑修正，Aβ與AD相關(guān)的其他病理表現(xiàn)之間的聯(lián)系也不斷地被證實(shí)［8］。

具有APP轉(zhuǎn)基因的小鼠模型大多是在人血小板衍生生長(zhǎng)因子β（platelet derived growth factor β，PDGFβ）、朊病毒蛋白（prion protein，PrP）和胸腺細(xì)胞分化抗原1（thymocyte differentiation antigen 1，Thy-1）的控制下在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)人類APP突變型的轉(zhuǎn)基因小鼠［9］。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型腦內(nèi)有Aβ聚集或斑塊形成，并且促使轉(zhuǎn)基因小鼠模型出現(xiàn)明顯的認(rèn)知和行為學(xué)障礙，從而模擬人類AD的腦病理改變和行為異常。因此可以用于探索AD的潛在發(fā)病機(jī)制并作為早期AD生物標(biāo)志物。

1.1.1PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠模型

該型小鼠遺傳背景為C57BL/6×DBA/2，啟動(dòng)子為人PDGF-β，γ分泌酶切割位點(diǎn)V717F突變，表達(dá)人APP695/751/770。該型小鼠在血小板衍生生長(zhǎng)因子啟動(dòng)子（PDAPP minigene）的控制下，使得突變的人淀粉樣前體蛋白（hAPP717V→F）的過表達(dá)從而導(dǎo)致類似于AD的神經(jīng)退行性變化，因此命名為PDAPP［10］。

免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，PDAPP純合子小鼠4月齡時(shí)可見皮質(zhì)、海馬區(qū)Aβ含量明顯升高。而雜合子小鼠6月齡之后可見APP表達(dá)水平提高，免疫組織化學(xué)染色也觀察到小鼠腦中開始有彌漫性和致密Aβ斑塊沉積，并且隨年齡增加而增加［11］。小鼠腦中老年斑密度最大的區(qū)域最開始見于齒狀回的外分子層和海馬體。18月齡時(shí)硫黃素S染色可見在這些Aβ斑塊周圍有活躍的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)炎性改變；此外，這些小鼠隨著年齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)了顯著的突觸丟失［12］。

4月齡時(shí)，通過水迷宮（Morris water maze）和其他行為檢測(cè)，PDAPP小鼠表現(xiàn)出空間、工作方面記憶障礙，并伴隨小鼠的整個(gè)生命周期［12］。6月齡時(shí)，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)（novel object recognition）測(cè)試顯示有認(rèn)知功能障礙，但并不像空間記憶障礙一樣明顯。

1.1.2Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠

該型小鼠遺傳背景為C57BL6×SJL，啟動(dòng)子為鼠PrP，轉(zhuǎn)入APPSWE基因形成β分泌酶切割位點(diǎn)瑞典雙突變K670N/M671L，表達(dá)人APP695。

免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，最早在2月齡時(shí)小鼠腦內(nèi)Aβ含量增高，到4～5月齡時(shí)增高更為明顯。9月齡后小鼠大腦切片剛果紅染色見斑塊沉淀［13］。隨著Aβ量的增多，其沉積范圍也逐漸增大。有報(bào)告稱該模型小鼠中約95%的致密斑塊出現(xiàn)在血管周圍，因此能引發(fā)淀粉樣腦血管?。?4］。該轉(zhuǎn)基因小鼠10月齡時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)炎癥，同時(shí)可見突觸的丟失和小膠質(zhì)細(xì)胞增生。

在6月齡時(shí)水迷宮實(shí)驗(yàn)中小鼠表現(xiàn)出空間記憶障礙。此時(shí)雖然沒有明顯的腦區(qū)神經(jīng)元丟失，但已出現(xiàn)樹突棘穩(wěn)定性受損和突觸可塑性降低。9月齡時(shí)Y迷宮即可顯示空間相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力受損，但直到12月齡時(shí)Tg2576小鼠才通過新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出認(rèn)知障礙。

1.1.3APP23轉(zhuǎn)基因小鼠

該型小鼠遺傳背景為C57BL/6J，啟動(dòng)子為鼠Thy-1，β-分泌酶切割位點(diǎn)瑞典雙突變K670N/M671L，表達(dá)人APP751。

免疫組織化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，6月齡時(shí)APP23小鼠大腦學(xué)可見淀粉樣蛋白沉淀，并且隨月齡增加逐漸加重，24月齡時(shí)在皮質(zhì)和海馬區(qū)大量出現(xiàn)Aβ斑塊［15］。研究發(fā)現(xiàn)APP23小鼠腦內(nèi)的Aβ沉淀以血管周圍表現(xiàn)明顯，12月齡時(shí)可導(dǎo)致血管血流減少和血管形態(tài)改變，并可引起淀粉樣血管病。此后通過膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)到反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，伴有神經(jīng)炎和突觸變性［16］。在12月齡時(shí)還表現(xiàn)出突觸丟失，甚至海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失［17］。6月齡時(shí)APP23小鼠腦中Tau蛋白的磷酸化增加，即Tau蛋白磷酸化似乎與Aβ肽沉積平行發(fā)生。

在水迷宮實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，3月齡開始表現(xiàn)出空間記憶、空間工作記憶受損，并且隨年齡增長(zhǎng)逐漸加重。12月齡時(shí)，通過巴恩斯迷宮（Barnes maze）實(shí)驗(yàn)也可檢測(cè)出認(rèn)知功能缺陷。該模型在疾病進(jìn)展晚期約19月齡時(shí)，出現(xiàn)非空間工作記憶缺陷。

1.2 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠

目前已有研究證明早老素（presenilin，PS）基因突變和家族性阿爾茨海默?。╢amilial Alzheimer's disease，F(xiàn)AD）病理改變相關(guān)，但僅攜帶FAD突變型PS基因的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)不會(huì)形成Aβ斑塊［18］。攜帶PS突變型可導(dǎo)致Aβ42水平明顯升高，增加腦中Aβ42∶Aβ40的比例。通過將人APP和PS轉(zhuǎn)基因小鼠品系雜交，獲得同時(shí)包含兩種突變型的雙轉(zhuǎn)基因小鼠，使表達(dá)FAD突變APP和PS1的轉(zhuǎn)基因鼠過度產(chǎn)生Aβ42并展現(xiàn)類似AD淀粉樣斑塊病理狀態(tài)，可觀察到更早更廣泛的斑塊沉積病理表型。這些APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠目前也已經(jīng)廣泛用于研究。

1.2.1APPSWE/PS1M146L轉(zhuǎn)基因小鼠啟動(dòng)子為鼠PrP和人PDGFβ，β分泌酶切割位點(diǎn)瑞典突變K670N/M671L和PS1基因M146L突變，表達(dá)人

APP695。

APPSWE/PS1M146L小鼠腦內(nèi)Aβ42/Aβ40出現(xiàn)早，在2月齡時(shí)細(xì)胞內(nèi)可見Aβ沉積。3月齡時(shí)在皮質(zhì)、海馬細(xì)胞的內(nèi)、外出現(xiàn)Aβ聚集。細(xì)胞外Aβ聚集隨年齡升高而增加，6月齡時(shí)出現(xiàn)淀粉樣蛋白斑塊。

1～2月齡模型小鼠即出現(xiàn)場(chǎng)景恐懼記憶障礙。實(shí)驗(yàn)中觀察到的工作記憶損傷比大多數(shù)模型進(jìn)展緩慢，3月齡時(shí)Y迷宮檢測(cè)出空間工作記憶受損，6月齡時(shí)可以通過水迷宮和放射臂水迷宮（radial arm water maze）檢測(cè)到空間記憶、獎(jiǎng)賞相關(guān)的空間記憶受損。15月齡時(shí)空間工作記憶受損更加明顯，并持續(xù)整個(gè)生命周期。

1.2.2APPSWE/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠

該型小鼠遺傳背景為C57BL6×C3H，啟動(dòng)子為鼠PrP，β分泌酶切割位點(diǎn)瑞典突變K670N/M671L和PS1dE9基因位點(diǎn)缺失，表達(dá)人APP695。

PS1 dE9位點(diǎn)缺失并不會(huì)使PS1基因失活，反而起增強(qiáng)促進(jìn)作用。這種模型的特點(diǎn)是2～3月齡時(shí)小鼠腦中的皮質(zhì)和海馬區(qū)域發(fā)生膽堿能軸突腫脹，以及淀粉樣蛋白含量增加。4～5月齡時(shí)剛果紅染色見Aβ開始在大腦和海馬體中沉積形成斑塊［19］。6月齡時(shí)可以在小鼠大腦皮質(zhì)、海馬體和杏仁核檢測(cè)到大量淀粉樣斑塊。到8月齡出現(xiàn)斑塊沉積和行為缺陷時(shí)，小鼠并沒有出現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)缺損或神經(jīng)元丟失［20］。但有研究認(rèn)為：在15月齡以上老年組的海馬、基底核、杏仁體可見有大量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和神經(jīng)元變性［21］。

在3月齡時(shí)通過放射臂水迷宮檢測(cè)，該轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)有空間相關(guān)的獎(jiǎng)賞和逃避相關(guān)能力受損，6月齡時(shí)水迷宮實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)到空間學(xué)習(xí)記憶受損。

1.3 5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠

大多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的斑塊發(fā)展慢于預(yù)期。為了加快斑塊發(fā)展速度和研究腦內(nèi)Aβ42高水平帶來的不良影響，出現(xiàn)了共表達(dá)5個(gè)FAD突變（AβPPSwe，Lnd，F(xiàn)lo，PS1M146L，L286V）的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，達(dá)到了迅速增加Aβ42含量的目的［12］。

5xFAD（C57BL/6×SJL，啟動(dòng)子為Thy-1基因，高表達(dá)人淀粉樣蛋白前體695）轉(zhuǎn)基因鼠幾乎只產(chǎn)生Aβ42。通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1.5月齡時(shí)5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ42開始在神經(jīng)元體細(xì)胞和神經(jīng)突觸中累積和聚集。而淀粉樣蛋白自小鼠2月齡時(shí)開始大量沉淀，特別是在深皮質(zhì)層和海馬下托，與此同時(shí)免疫熒光染色顯示有膠質(zhì)細(xì)胞增生。大約4月齡時(shí)經(jīng)Y迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有工作記憶受損［22］。9月齡時(shí)皮質(zhì)層和海馬下托錐體神經(jīng)元丟失，出現(xiàn)顯著神經(jīng)退行性變。并且5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠在不表達(dá)Tau蛋白的情況下，大量毒性的Aβ改變神經(jīng)突觸的結(jié)構(gòu)和密度，并導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)元死亡和萎縮，而大多數(shù)AD小鼠模型缺乏這種特征［23］。

5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠能快速再現(xiàn)AD淀粉樣病變的主要病理特征，目前已成為Aβ42介導(dǎo)神經(jīng)退行性變和淀粉樣斑塊形成的常用模型。

1.4 Aβ轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用

多年來，Aβ小鼠模型廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。研究者最早通過這些Aβ轉(zhuǎn)基因小鼠模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了過度表達(dá)人類APP基因亞型的轉(zhuǎn)基因小鼠可獲得認(rèn)知行為缺陷，其大腦皮層中也可檢測(cè)到淀粉樣沉淀［24］。這些轉(zhuǎn)基因小鼠的行為、生化和病理異常與AD患者相似，為人類研究AD提供了新的路徑。目前應(yīng)用最為廣泛的Aβ小 鼠 模 型 是APPSWE/PS1M146L及APPSWE/PS1dE9以 及5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠。自證實(shí)攜帶PS1的轉(zhuǎn)基因小鼠模型可更好更早呈現(xiàn)Aβ病理表現(xiàn)后，研究人員更多使用APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行針對(duì)Aβ的形成機(jī)制、分解過程及靶向治療的實(shí)驗(yàn)研究。

然而鑒于大多數(shù)AD病例晚發(fā)性和偶發(fā)性的特點(diǎn)，美國(guó)加州大學(xué)記憶與神經(jīng)障礙研究所的David Baglietto-Vargas教授更是通過敲入技術(shù)將小鼠Aβ序列中的3個(gè)氨基酸改變?yōu)橐吧偷娜祟悓?duì)應(yīng)氨基酸，從而導(dǎo)致認(rèn)知能力和突觸可塑性的年齡依賴性損傷、腦內(nèi)炎癥改變，建立相關(guān)野生型AD小鼠，為建立遲發(fā)性AD生物模型開發(fā)與評(píng)估建立了重要基礎(chǔ)［26］。

最初針對(duì)Aβ的研究多聚焦在Aβ的清除上，而在Aβ靶向治療效果欠佳的當(dāng)下，研究人員開始關(guān)注神經(jīng)炎癥的影響。美國(guó)加州大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在2016年4月發(fā)表的一項(xiàng)研究中對(duì)10月齡的5xFAD小鼠使用了選擇性集落刺激因子1受體抑制劑治療，消除了腦內(nèi)80%的小膠質(zhì)細(xì)胞后挽救了小鼠的樹突棘丟失。研究認(rèn)為在不改變Aβ或斑塊水平的情況下，改善了小鼠記憶并減輕了整體的神經(jīng)炎癥［25］。紀(jì)念斯隆·凱瑟琳癌癥研究中心的李月明教授團(tuán)隊(duì)2020年9月在Nature雜志上發(fā)表的文章中也使用了5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠［27］，他們認(rèn)為神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)γ-分泌酶活性并以此影響Aβ產(chǎn)生，通過小分子γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑特異地抑制Aβ42的產(chǎn)生但不影響其他位點(diǎn)和底物切割，這種特殊機(jī)制或有望成為未來AD藥物開發(fā)的方向。

目前也有更多的研究人員使用不同表型的Aβ轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究與Aβ各種可能相關(guān)因素的影響，如通過APP/ApoE小鼠模型觀察Aβ過表達(dá)對(duì)腦淀粉樣血管病（cerebralamyloidangiopathy，CAA）和實(shí)質(zhì)性斑塊的不同作用［28］。研究發(fā)現(xiàn)APOE4與Aβ誘導(dǎo)的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)缺陷增強(qiáng)有關(guān)，實(shí)驗(yàn)支持使用抗h-apoE4抗體來減少斑塊形成。

2 Tau轉(zhuǎn)基因小鼠模型

Tau的異常磷酸化導(dǎo)致大腦中出現(xiàn)NFTs，這是AD的另一個(gè)顯著病理特征［14］。微管蛋白正確組裝維持微管穩(wěn)定，神經(jīng)元從而發(fā)揮正常功能［29］。Tau過度磷酸化被認(rèn)為是影響微管組裝和誘導(dǎo)Tau聚集的關(guān)鍵因素。在過度磷酸化過程中Tau發(fā)生構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致NFTs的形成［8］。由于長(zhǎng)期以來針對(duì)Aβ的臨床試驗(yàn)未見成效，并且淀粉樣蛋白沉積最明顯的區(qū)域和受NFTs影響導(dǎo)致突觸和神經(jīng)元損失最大的區(qū)域并不重合［30］，也有研究認(rèn)為Tau病理和認(rèn)知功能障礙下降呈正相關(guān)，強(qiáng)調(diào)Tau病理性改變和神經(jīng)退行性變間可能有直接聯(lián)系［31］。在AD病因?qū)W中Tau病理不可忽視，因而有研究人員建立了Tau轉(zhuǎn)基因小鼠模型用以研究Tau病理性表達(dá)與相關(guān)疾病的關(guān)系。

2.1 JNPL3轉(zhuǎn)基因小鼠

常用的Tau轉(zhuǎn)基因JNPL3小鼠遺傳背景為C57BL6×DBA2×SW，啟動(dòng)子為鼠PrP，人Tau蛋白P301L突變，過表達(dá)人Tau蛋白。

Lewis團(tuán)隊(duì)報(bào)告的JNPL3小鼠表達(dá)人Tau最為常見的P301L突變，這也是最早利用P301L突變構(gòu)建的Tau轉(zhuǎn)基因小鼠模型。該突變與17號(hào)染色體相關(guān)，除了AD外該突變也與人類的額顳葉癡呆和帕金森病相關(guān)［32］。JNPL3小鼠可在腦和脊髓中產(chǎn)生NFTs，并且在脊髓尤其是前角中明顯地出現(xiàn)神經(jīng)元丟失，因而會(huì)出現(xiàn)類帕金森病的癥狀。轉(zhuǎn)基因小鼠引入的Tau突變目前認(rèn)為與AD的發(fā)病沒有直接關(guān)聯(lián)，且其大多會(huì)表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)功能障礙的特性影響其在行為學(xué)檢測(cè)中的表現(xiàn)，包括該類模型缺乏Aβ聚集和斑塊沉積，無法全面模擬AD的病理改變，因而JNPL3主要用于靶向Tau藥物的非臨床研究。

研究顯示雜合子JNPL3小鼠Tau病理性表達(dá)水平與人類患者相當(dāng)，而純合子小鼠Tau病理表達(dá)水平可翻倍。4月齡時(shí)，免疫組織化學(xué)證實(shí)純合子JNPL3小鼠出現(xiàn)異常磷酸化Tau和不溶性的Tau病理改變［33］，而雜合子動(dòng)物在6月齡時(shí)發(fā)現(xiàn)Tau免疫陽性，即NFTs的表達(dá)量與突變基因數(shù)量以及小鼠年齡相關(guān)。6月齡時(shí)JNPL3小鼠出現(xiàn)進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)障礙，通過懸掛實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩和肌無力［34］。在NFTs區(qū)域，也可發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及神經(jīng)元丟失等現(xiàn)象［35］。

2.2 TauV337M轉(zhuǎn)基因小鼠

該型小鼠遺傳背景為B6SJL，啟動(dòng)子為鼠Thy-1，人TauV337M突變，高表達(dá)Tau蛋白。

通過6月齡TauV337M小鼠矢狀面腦切片獲得的原位雜交數(shù)據(jù)，研究認(rèn)為人類Tau在大腦皮層、海馬和腦橋中有高水平的表達(dá)，而在紋狀體或小腦中幾乎沒有表達(dá)［36］。用磷酸化非依賴性人特異性T14 Tau抗體對(duì)6月齡小鼠進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)人Tau蛋白的空間分布基本上遵循人AD病腦中的表達(dá)模式，額葉、海馬和腦橋神經(jīng)元染色明顯，紋狀體染色很少。在11月齡時(shí)小鼠可發(fā)生NFTs和海馬神經(jīng)元丟失［37］。

2.3 Tau轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用

通過對(duì)人AD病腦中特征性病理表現(xiàn)的長(zhǎng)期研究，研究人員意識(shí)到Tau對(duì)AD的形成有著不可忽視的作用。后續(xù)將利用Tau轉(zhuǎn)基因小鼠，對(duì)僅Tau蛋白形成時(shí)是否有AD病理表現(xiàn)，其存在時(shí)與Aβ形成之間的關(guān)系，及其對(duì)AD疾病進(jìn)展等問題展開研究。2020年7月，德國(guó)薩爾蘭德大學(xué)Laura團(tuán)隊(duì)的研究表明p38α-絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）可作為AD治療的新靶點(diǎn)。Laura團(tuán)隊(duì)利用Tau轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)P38α-MAPK在AD損傷部位被特異性激活［38］。雖然P38α-MAPK對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的影響，特別是對(duì)p-Tau相關(guān)腦病理的影響以及潛在的分子機(jī)制尚不清楚，但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)p38α-MAPK的缺失可以改善9月齡的轉(zhuǎn)基因AD小鼠的認(rèn)知功能，這與大腦中Aβ和p-Tau負(fù)荷的降低有關(guān)。之后對(duì)AD致病機(jī)制的系統(tǒng)研究也表明，神經(jīng)元p38α-MAPK的缺失可以減弱AD相關(guān)的腦病理改變，并保護(hù)AD發(fā)病中的神經(jīng)元。

3 Aβ+Tau多轉(zhuǎn)基因小鼠模型

AD的特征性病理改變包括淀粉樣蛋白斑塊和NFTs。之前的研究認(rèn)為一種典型的病理改變并不能引發(fā)另一種典型病理的產(chǎn)生。為了明確Aβ斑塊和Tau蛋白之間是否存在相互作用以及它們對(duì)神經(jīng)突觸的影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要建立了能夠同時(shí)表達(dá)這兩種典型病理表現(xiàn)的小鼠模型。

3.1 TAPP雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型

該型小鼠遺傳背景為C57BL/6，啟動(dòng)子為鼠PrP，高表達(dá)人APP695和Tau。

TAPP是JNPL3小鼠和Tg2576小鼠雜交產(chǎn)生的雙轉(zhuǎn)基因鼠，它同時(shí)表達(dá)淀粉樣斑塊和NFTs，可用于研究揭示Aβ與Tau之間存在交互作用［39］。這是第一個(gè)同時(shí)展示AD兩大主要病理特征的小鼠模型。

作為雜交產(chǎn)生的雙突變體（Tau/APP）子代，TAPP小鼠與親代Tg2576小鼠在相同年齡發(fā)生分布和密度相似的Aβ沉積。原位雜交分析表明，TAPP小鼠和JNPL3小鼠之間的Tau轉(zhuǎn)基因表達(dá)模式?jīng)]有差異，但3月齡時(shí)蛋白質(zhì)印跡可在脊髓和腦橋中見Tau蛋白病理性表達(dá)。此時(shí)Gallyas銀染腦切片中也偶爾可見NFTs，均早于JNPL3小鼠。6～7月齡時(shí)，TAPP小鼠的邊緣腦區(qū)具有NFTs，此時(shí)JNPL3小鼠大部分局限于脊髓和腦橋。Tau/APP雙突變體小鼠要比JNPL3親代小鼠在大腦邊緣區(qū)域和嗅覺皮層的NFTs病理表達(dá)增強(qiáng)，有研究者認(rèn)為Aβ表達(dá)量增加可促進(jìn)Tau病理的進(jìn)展［34］。而在NFTs最多的邊緣區(qū)域，GFAP的免疫染色顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞也隨之增加。TAPP小鼠的行為學(xué)變化與發(fā)病時(shí)間也和其親代JNPL3小鼠相似。

3.2 3xTg-AD三轉(zhuǎn)基因小鼠

Oddo教 授 等［40］建 立 了 一 個(gè) 包 含AβPPSwe、TauP301L、PS1M146V三種基因突變型的小鼠模型3xTg-AD。該小鼠模型的基因型背景為C57BL/6/129S，啟動(dòng)子為Thy1.2，高表達(dá)APP695。這是第一個(gè)同時(shí)在AD相關(guān)腦區(qū)發(fā)生兩種主要病理表現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因模型。并且它在產(chǎn)生斑塊和NFTs之前就表現(xiàn)出了年齡相關(guān)的突觸功能障礙和認(rèn)知功能受損。

免疫沉淀法檢測(cè)3～4月齡時(shí)3xTg-AD小鼠，可在新皮質(zhì)區(qū)檢測(cè)到神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Aβ免疫反應(yīng)，6月齡時(shí)則發(fā)展至海馬CA1亞區(qū)。同時(shí)6月齡的3xTg-AD小鼠最先在額葉皮層細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)淀粉樣蛋白沉淀，之后出現(xiàn)在其他皮質(zhì)區(qū)和海馬，12月齡時(shí)細(xì)胞外可見Aβ，即3xTg-AD小鼠表現(xiàn)出年齡區(qū)域相關(guān)性的Aβ沉淀趨勢(shì)。與之相反，12月齡時(shí)Tau蛋白病理首先出現(xiàn)在海馬CA1區(qū)，隨后發(fā)展至皮質(zhì)區(qū)［41］。盡管總體濃度低，p-Tau與認(rèn)知能力下降的相關(guān)性最強(qiáng)，能夠更直接、定量相關(guān)疾病進(jìn)展［42］。pS422免疫反應(yīng)性是AD中Tau病理進(jìn)展的早期標(biāo)志物。而突觸功能障礙出現(xiàn)在標(biāo)志性病理累積之前，最早的突觸功能障礙和認(rèn)知受損出現(xiàn)于3～5月齡的3xTg-AD小鼠，6月齡時(shí)在水迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)明顯，12月齡時(shí)通過巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)確認(rèn)有記憶損傷。實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為這與Aβ在海馬體和杏仁核中的神經(jīng)元內(nèi)積累有關(guān)。在病理發(fā)展后期進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色可見星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生［43］。

但目前也有研究認(rèn)為，因長(zhǎng)期廣泛使用3xTg-AD小鼠，已形成了多種相關(guān)亞系，較過往研究其病理發(fā)生及行為學(xué)變化出現(xiàn)輕微的時(shí)間延遲［44］。如小膠質(zhì)細(xì)胞活化（第一次檢測(cè)到是6個(gè)月）先于星形膠質(zhì)細(xì)胞增生（第一次檢測(cè)到是12個(gè)月）。但該研究只分析了雌性小鼠，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)室保有的純合子體系中，雄性3xTg AD小鼠顯示出相當(dāng)大的神經(jīng)病理學(xué)變異，即使是在同窩的小鼠之間。

和人類AD患者腦內(nèi)狀況一致的是，在3xTg-AD小鼠腦內(nèi)Aβ沉積早于Tau的改變。Aβ病理的首先出現(xiàn)表示它可能會(huì)影響Tau神經(jīng)病理學(xué)進(jìn)展［40］。和只表現(xiàn)Tau蛋白病理改變的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，3xTg-AD小鼠Tau病理改變形成時(shí)間明顯提前，并且認(rèn)知功能顯著受損。這提示細(xì)胞內(nèi)Aβ積累是3xTg-AD小鼠發(fā)生突觸功能障礙的原因之一。3xTg-AD小鼠斑塊和NFTs病理以年齡和區(qū)域依賴性的方式進(jìn)行性發(fā)展，更接近人類AD患者大腦的神經(jīng)病理變化。這有助于確定針對(duì)其中一種標(biāo)志性病理改變的診療干預(yù)方法是否能影響另一種病理改變的進(jìn)展。該動(dòng)物模型可以同時(shí)評(píng)估潛在的藥物或治療手段對(duì)兩種病理改變的影響。

3.3 Aβ+Tau轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用

雖然3xTg-AD小鼠的病理發(fā)生與過去的報(bào)告相比出現(xiàn)輕微的時(shí)間延遲［44］，但是3xTg-AD小鼠仍然是目前最常使用的轉(zhuǎn)基因小鼠模型之一。

巴黎薩克雷大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在他們2020年3月發(fā)表的文章中使用了3xTg-AD小鼠［45］。在AD的早期階段經(jīng)常能觀察到病人腦內(nèi)糖酵解改變，但不清楚這種代謝失調(diào)是否影響AD進(jìn)展以及其如何導(dǎo)致AD的突觸可塑性改變和行為缺陷。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中糖酵解衍生的l-絲氨酸遭破壞可導(dǎo)致AD的認(rèn)知缺陷。研究人員發(fā)現(xiàn)在早期AD小鼠和AD患者中，其星形細(xì)胞中絲氨酸生物合成途徑受損，而該途徑是糖酵解的分支。D-絲氨酸是突觸可塑性所必需突觸離子型谷氨酰胺受體的協(xié)同激活劑，而l-絲氨酸是D-絲氨酸的前體。因此，AD小鼠突觸離子型谷氨酰胺受體協(xié)同激活劑位點(diǎn)占有率較低，同時(shí)伴隨突觸和行為缺陷。在海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中l(wèi)-絲氨酸合成途徑失活后，也觀察到類似的缺陷。該研究結(jié)果表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解途徑調(diào)節(jié)認(rèn)知功能，并提示左旋絲氨酸可用于AD的治療。針對(duì)神經(jīng)炎癥方向的研究及治療對(duì)策也是目前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)難題。

4 總結(jié)和展望

從醫(yī)學(xué)倫理和臨床表現(xiàn)多樣性的角度考慮，臨床研究人類AD發(fā)病機(jī)制具有相當(dāng)?shù)奶魬?zhàn)性?？紤]到轉(zhuǎn)基因小鼠模型在海馬和皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能方面與人類腦區(qū)系統(tǒng)發(fā)育高度相似，雖然不能完全復(fù)制整個(gè)AD病腦的病理生理學(xué)，但是以其高度類似人類的形態(tài)學(xué)、病理學(xué)和遺傳學(xué)表現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究AD病理過程已經(jīng)是一種有效替代。

通過轉(zhuǎn)基因小鼠特定病理表現(xiàn)深入理解人類AD潛在發(fā)病機(jī)制，尋找可靠的早期診斷生物標(biāo)志物，評(píng)估治療藥物是否安全和有效，這些是我們利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型想要達(dá)到的目的。動(dòng)物模型的優(yōu)勢(shì)在于允許我們?cè)趧?dòng)物身上探索不同生長(zhǎng)時(shí)期的不同病理表現(xiàn)，從而進(jìn)行更為深入準(zhǔn)確的研究，更好地理解疾病的進(jìn)展。利用在實(shí)驗(yàn)中成功模擬AD發(fā)病機(jī)制的小鼠模型，可以長(zhǎng)期多次試用潛在的治療藥物，從而驗(yàn)證藥物是否有治療效果、藥物聯(lián)用是否更佳等等，這在疾病研究中已經(jīng)是一個(gè)可行、成熟的選擇。

雖然目前利用動(dòng)物模型進(jìn)行的臨床前研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但是它們的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值仍不明確，臨床轉(zhuǎn)化結(jié)果不甚理想的情況也很多。目前認(rèn)為可能是對(duì)于AD神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)和發(fā)病機(jī)制的理解仍然不足，基礎(chǔ)研究亟待加強(qiáng)。研究常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型尚不能模擬人類AD病腦的全部病理過程，因此通過臨床前動(dòng)物研究獲得的成果在臨床階段的人體實(shí)驗(yàn)中不一定適用，還需要進(jìn)一步的臨床研究驗(yàn)證。AD作為一種長(zhǎng)期慢性神經(jīng)退行性疾病，實(shí)驗(yàn)用小鼠的壽命時(shí)限不能達(dá)到人類需要的長(zhǎng)時(shí)程的藥物治療觀察和定期監(jiān)測(cè)的要求。除此之外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的月齡大小、性別差異、遺傳背景以及不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件都對(duì)研究結(jié)果有很大的影響。

鑒于AD的神經(jīng)病理基礎(chǔ)仍不明確，實(shí)驗(yàn)研究人員應(yīng)綜合考慮不同動(dòng)物模型的優(yōu)勢(shì)和局限性，選擇最合適的動(dòng)物模型進(jìn)行針對(duì)性研究。

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

魏楓收集資料并參與論文寫作；程維維指導(dǎo)并協(xié)助完成論文內(nèi)容；尹雅芙負(fù)責(zé)課題及本論文審核及把關(guān)。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。