李 運 張國強 高 鵬 李紅玉 景 明* 魏 鋒

1.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院/甘肅省種植中藥材外源性污染物監(jiān)測工程研究中心，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

藏藥熏倒牛(BiebersteiniaheterostemonMaxim．)為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物，是藏藥“明見賽保”的原植物來源之一[1]。具有清熱解毒、散腫止痛、清血熱、祛風(fēng)毒的功效，用于治療各種炎癥、結(jié)核癥、丹毒、瘧疾、咽喉腫痛、胃痛、全身水腫、中風(fēng)等疾病[2]。目前，國內(nèi)外學(xué)者主要側(cè)重于熏倒牛中主要化學(xué)成分的分離鑒定及初步的藥理活性研究，發(fā)現(xiàn)其主要含有黃酮、生物堿、苯丙素、香豆素、甾醇、糖類、揮發(fā)油和萜類等化合物[3-6]，并具有抗氧化[7]、降血糖[8]等活性，民間用于治療小兒驚厥、抽搐、感冒發(fā)熱等。在藏區(qū)的走訪調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，熏倒牛種子可用于治療各種炎癥類、膽囊類疾病及喉蛾、疔瘡等。民族藥用于疾病的治療，藥效的發(fā)揮往往基于多成分多靶點的共同作用，對于熏倒牛種子的研究，僅見于對其籽油中脂肪酸成分的分析[9]，從其中鑒定出11種脂肪酸類化合物，主要為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等成分，不飽和脂肪酸為74.23%，其中亞油酸含量為73.04%。

氨基酸類成分是重要的生命物質(zhì)，是組成蛋白質(zhì)和酶的基本單元，能夠增強機體免疫力、調(diào)節(jié)新陳代謝等[10]。對于熏倒牛種子中氨基酸的相關(guān)研究，未見報道。本文采用柱前衍生化法，利用氨基酸在偏堿性環(huán)境下，與異硫氰酸苯酯反應(yīng)生成硫脲，經(jīng)分子內(nèi)環(huán)化，生成乙內(nèi)酰苯硫脲類化合物，可用高效液相色譜儀進行定量分析。通過掌握熏倒牛種子中的氨基酸含量，以期為進一步研究藏藥熏倒牛藥材中的化學(xué)成分，深入挖掘其用藥潛力和價值提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(包括四元泵、Waters 2998 PDA 檢測器、自動進樣器及 Empower工作站，美國Waters公司)；MS205DU型十萬分之一分析天平(瑞士Mettle Toledo公司)；Milli-Q IQ 7000超純水系統(tǒng)(德國默克密理博公司)；SBL-10DT超聲波恒溫清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；微量移液器(德國eppendorf股份公司)。

1.2 材料 谷氨酸(批號：140690-201604，含量99.9%)、甘氨酸(批號：140689-201605，含量100%)、精氨酸(批號：140685-201707，含量99.9%)、蘇氨酸(批號：140682-201302，含量99.9%)、丙氨酸(批號：140680-201604，含量100%)、酪氨酸(批號：140609-201513，含量99.8%)、纈氨酸(批號：140681-201703，含量99.5%)、異亮氨酸(批號：140683-201302，含量99.9%)、亮氨酸(批號：140687-201804，含量99.9%)、苯丙氨酸(批號：140676-201706，含量100%)、鹽酸賴氨酸(批號：140673-201509，含量99.9%)，均由中國食品藥品檢定研究院提供；L-絲氨酸(批號：B21932，含量98.0%)、L-脯氨酸(批號：B21914，含量99.0%)、L-蛋氨酸(批號：B21913，含量98.0%)、L-色氨酸(批號：B21930，含量98.0%)，均由上海源葉生物科技有限公司提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

實驗所用熏倒牛種子，分別采自于甘肅省合作市(樣品編號S1、S2)、甘肅省定西市安定區(qū)(樣品編號S3)，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院景明教授鑒定為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物BiebersteiniaheterostemonMaxim.的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用色譜柱：CAPCELL PAK-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為80%乙腈溶液(A)-0.056 mol·L-1乙酸鈉緩沖液(B)；流速為1 mL·min-1；檢測波長254 nm；色譜柱溫度40 ℃；進樣體積：10 μL。梯度洗脫程序：0～15 min，5%A;15～20 min，5%A→20%A;20～35 min，20%A→36%A;35～45 min，36%A→70%A;45～50 min，70%→90%A;50～55 min，90%A;55～56 min，90%A→5%A;56～60 min，5%A。

2.2 溶液的制備

2.2.1 乙酸鈉緩沖溶液 取三水合乙酸鈉 7.587 g，加水850 mL，冰醋酸調(diào)節(jié)PH=6.5(約2滴)，加水75 mL，乙腈70 mL，配制成濃度為0.056 moL·L-1的乙酸鈉緩沖液。

2.2.2 0.1moL·L-1的異硫氰酸苯酯(PITC) 精密移取 PITC 0.30 mL，加入乙腈定容至25 mL，搖勻即得。

2.2.3 1.0moL·L-1三乙胺溶液 移取三乙胺3.475 mL，加入乙腈定容至 25 mL，搖勻即得。

2.2.4 對照品溶液衍生化溶液的配制 分別精密稱取15種氨基酸對照品適量，用0.1 moL·L-1鹽酸定容于10 mL容量瓶，配制成一定濃度的對照品溶液，分別取各濃度氨基酸對照品溶液適量，配制成每1毫升含有谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鹽酸賴氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸分別為58.56 μg、11.38 μg、20.56 μg、18.88 μg、10.36 μg、21.04 μg、21.92 μg、10.02 μg、9.62 μg、10.72 μg、10.1 μg、19.48 μg、10.04 μg、10.04 μg、19.68 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取上述溶液 1 mL，加入0.1 moL·L-1的PITC及1moL·L-1三乙胺乙腈溶液各0.5 mL。

2.2.5 供試品衍生化溶液的制備 取藏藥熏倒牛種子粗粉約0.2 g，置于10 mL玻璃頂空瓶中，加6 moL·L-1鹽酸溶液5 mL，充氮氣后壓蓋密封，于110 ℃烘箱中水解6 h，取出后放冷，揮干溶劑，殘渣加0.1 moL·L-1鹽酸溶液定容至10 mL容量瓶中；取其1 mL分別加入0.1 moL·L-1的PITC乙腈溶液、1 mol·L-1三乙胺乙腈溶液各0.5 mL，充分混勻，放置1 h，加入2 mL正己烷，混勻，靜置10 min，取2 mL定容于5 mL容量瓶中，即得。

2.2.6 空白衍生化溶液的制備 用0.1 moL·L-1鹽酸溶液代替樣品，同“2.2.5”項下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性實驗 精密吸取“2.2.4”項下制備的對照品溶液和“2.2.5”項下制備的供試品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品中各氨基酸色譜峰保留時間與對照品溶液各色譜峰保留時間一致，目標(biāo)峰與相鄰色譜峰的分離度均>1.5，理論塔板數(shù)以谷氨酸峰計大于9000，色譜圖如圖1所示。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.4”項下制備的對照品溶液適量，按照供試品溶液中各氨基酸的實際含量，配制系列濃度的對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，測定色譜峰面積。以對照品溶液中各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，對照品溶液中各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，谷氨酸等15種氨基酸在各自的線性范圍內(nèi)與色譜峰面積的積分值呈良好線性關(guān)系，回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表1。

表1 15種氨基酸的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.5”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算峰面積。結(jié)果顯示，各氨基酸質(zhì)量濃度的RSD值均小于2.73%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取“2.2.5”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算峰面積。結(jié)果顯示，各氨基酸的平均含量和RSD值分別為1.947 mg·g-1、0.592 mg·g-1、1.783 mg·g-1、0.975 mg·g-1、0.556 mg·g-1、0.349 mg·g-1、1.264 mg·g-1、0.379 mg·g-1、0.440 mg·g-1、0.814 mg·g-1、0.331 mg·g-1、0.713 mg·g-1、0.407 mg·g-1、0.445 mg·g-1、0.864 mg·g-1和2.85%、1.67%、2.13%、1.97%、2.60%、1.67%、2.55%、0.91%、1.32%、0.62%、2.40%、2.12%、1.60%、0.79%、2.57 %。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.5”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h測定，記錄各組分色譜峰，計算峰面積。測得各氨基酸成分的色譜峰面積的RSD值分別為1.43%、2.89%、2.65%、2.19%、1.97%、1.87%、1.11%、0.92%、2.58%、0.98%、2.44%、0.63%、1.92%、2.04%、2.60%，表明樣品在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

1.谷氨酸;2.L-絲氨酸；3.甘氨酸；4.精氨酸；5.蘇氨酸；6.丙氨酸；7.L-脯氨酸；8.酪氨酸；9.纈氨酸；10.L-蛋氨酸；11.異亮氨酸；12.亮氨酸；13.苯丙氨酸；14.L-色氨酸；15.鹽酸賴氨酸A.對照品衍生化溶液；B.供試品衍生化溶液；C.空白衍生化溶液圖1 樣品衍生化溶液色譜圖

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取編號S1的藏藥熏倒牛樣品0.1 g，共6份，加入各標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按照“2.2.5”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果見表1，加樣回收率試驗中15種氨基酸的平均回收率及RSD值分別為95.16%、101.99%、104.02%、102.03%、96.99%、100.70%、95.35%、101.82%、95.59%、99.56%、104.37%、101.64%、99.86%、99.57%、102.62%和2.01%、1.96%、2.67%、2.46%、1.46%、2.29%、2.22%、2.33%、1.22%、1.78%、0.98%、2.24%、1.61%、1.17%、1.21%。

2.3.7 樣品含量測定結(jié)果 精密稱取編號S1-S3的藏藥熏倒牛樣品各3份，每份0.2 g，加入各標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按照“2.2.5”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，進樣體積10 μL，測定樣品中各氨基酸的平均含量。結(jié)果見表2。

表2 熏倒牛種子中氨基酸的含量測定結(jié)果 (mg·g-1，n=3)

3 討論

對于氨基酸的分析，常采用柱前、柱上及柱后衍生化3種方式。采用柱前衍生化，利用HPLC進行測定，具有方法穩(wěn)定、普適性強等優(yōu)點。本研究選用柱前衍生化法，首先對樣品的水解方式進行優(yōu)化，結(jié)合文獻[11-12]，選擇以6 moL·L-1鹽酸為水解試劑，設(shè)置不同時間(1、6、12、24 h)進行水解，以樣品中各氨基酸含量為標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選最佳的水解方法，最終選擇以水解溫度110 ℃，水解6 h為樣品水解方法，本方法下，樣品中各氨基酸能夠充分水解，且無焦化現(xiàn)象。其次，通過預(yù)實驗，遴選了最佳衍生化試劑。常見的衍生化試劑主要有鄰苯二甲醛、PITC、二硝基氟苯、9-氯甲酸芴甲酯和丹磺酰氯等[13]。其中用PITC乙腈溶液進行衍生化處理具有產(chǎn)物單一、穩(wěn)定等特征[14-15]，通過優(yōu)化實驗方法，最終選擇以0.1 moL·L-1的異硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液及1 moL·L-1三乙胺乙腈溶液，時間為1 h進行衍生化處理。

本研究結(jié)果提示，藏藥熏倒牛種子中含有豐富的人體必需氨基酸，約占樣品中氨基酸總量的37.4%～38.6%。同時谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、L-絲氨酸等氨基酸含量較高，3批熏倒牛樣品中，五種氨基酸的平均含量分別介于2.363～4.060 mg·g-1、1.403～1.982 mg·g-1、1.155～1.641 mg·g-1、0.830～1.314 mg·g-1、0.679～1.070 mg·g-1之間。

本文通過建立柱前衍生化HPLC法同時測定藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸的含量，具有操作簡單，準(zhǔn)確度高等特點，能夠為藏藥熏倒牛種子的藥材質(zhì)量評價、深入開發(fā)等提供基礎(chǔ)。