李俊雅 梁 曉

1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南 湘潭 411102；2.桂林醫(yī)學(xué)院,廣西 桂林 541199

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是排除酒精、感染之外出現(xiàn)肝臟脂肪過(guò)度堆積的一種肝臟疾病。NAFLD可逐漸發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌，同時(shí)還可增加糖尿病和心血管疾病的罹患風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，肥胖及代謝綜合征的流行，NAFLD已經(jīng)成為一種全球性的疾病，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升，發(fā)病年齡年輕化，逐漸成為影響人類(lèi)健康的最常見(jiàn)肝病之一[3]。目前，NAFLD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大多認(rèn)為NAFLD 發(fā)病主要與氧化應(yīng)激、細(xì)胞過(guò)度凋亡和過(guò)度炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。NAFLD可劃歸于中醫(yī)的“脅痛”“積聚”“癥瘕痞塊”等疾病范疇。近年來(lái)中醫(yī)藥治療NAFLD的療效日益受到重視。本研究通過(guò)觀察蓮心堿對(duì)NAFLD大鼠肝組織NF-κB、TNF-α表達(dá)的影響，探討蓮心堿防治NAFLD的可能作用途徑，為治療NAFLD篩選有效藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠48只，體重(180±20)g，購(gòu)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2019-0041。

1.2 試劑與儀器 全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)亞培公司)，Alpha Imager 2200型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Alpha公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；電子分析天平(德國(guó)Sartarius公司)；HH-2型恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高速離心機(jī)(德國(guó)Eppndorf 公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；ELISA試劑盒、蛋白免疫印跡系統(tǒng)(美國(guó)BIO-Rad公司)；WD-9405B型水平搖床(北京市六一儀器廠)。

1.3 模型建立、分組及給藥 造模：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分出8只作為8周空白組(第8周處死)和8只12周空白組(第12周處死)，普通飼料喂養(yǎng)。其余大鼠均采用高脂飼料(基礎(chǔ)飼料88%、膽固醇2%和豬油10%)喂養(yǎng)8周，隨機(jī)選取8只，進(jìn)行肝臟病理組織學(xué)檢查以確定是否造模成功。

分組：造模成功后，將剩余24只模型大鼠隨機(jī)分為NAFLD模型組、蓮心堿低劑量組和高劑量組，每組8只，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

給藥：空白組和模型組給予同等劑量的生理鹽水，藥物預(yù)處理12周后，禁食12 h，10%水合氯醛(3.0 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血約5 mL，取肝組織，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 測(cè)定空腹血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)水平。血漿靜置2 h后，3000 rpm/min，4 ℃離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 病理學(xué)觀察 取肝臟右葉中部距邊緣，剪取0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm肝組織若干塊，置于10%多聚甲醛液中固定24 h，梯度乙醇洗脫后，石蠟包埋，切片(約4 cm厚度)，使用蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光鏡下觀察肝組織的細(xì)胞脂肪變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死程度等病理學(xué)形態(tài)。

1.6 Western Blot測(cè)定肝組織NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá) 取各組肝組織20 μg，放入加有裂解液PIRA和蛋白抑制劑PMPF混合液的EP管中，充分裂解肝組織。每個(gè)樣本取出20 μL蛋白液進(jìn)行蛋白定量，按目標(biāo)蛋白NF-κB及TNF-α濃度配制分離膠，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，取出PVDF 膜，TBST沖洗3次，封閉結(jié)束后，將PVDF膜置于1∶1000稀釋的一抗溶液中，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST沖洗3次，加入1∶2000稀釋的二抗溶液，室溫?fù)u床孵育1 h。等比例混合BeyoEclplus A、B液，均勻滴加在PVDF膜表面，包覆封裝后放置于暗盒中，在暗室中顯影曝光。顯影30～70 s后用清水沖洗，定影2～3 min，漂洗干凈，自然晾干。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清生物化學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的血脂(TC、TG)和肝功能(ALT、AST)較同期空白組明顯上升(P<0.01)，并且8周模型組和12周模型組差異顯著，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證實(shí)高脂誘導(dǎo)的NAFLD模型成功致使大鼠肝細(xì)胞損傷，喂養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，肝細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。對(duì)比同期模型組，治療組血清中的TC、TG和ALT、AST含量下降明顯(P<0.01)，但仍高于正?？瞻捉M。蓮心堿治療能降低大鼠血脂、膽固醇和肝功能方面，高劑量組最為顯著。具體見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清生物化學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

2.2 大鼠肝臟病理結(jié)果 正?？瞻捉M肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯的病理變化。模型組的肝細(xì)胞腫脹，表現(xiàn)出彌漫性脂肪變，內(nèi)部可見(jiàn)數(shù)量不一、大小不等的脂滴分布，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡狀改變，其中以中央靜脈周?chē)淖冏蠲黠@。肝小葉內(nèi)和匯管區(qū)被炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并且肝小葉內(nèi)可觀察到局灶性點(diǎn)或片狀的壞死灶。蓮心堿治療組肝細(xì)胞小葉結(jié)構(gòu)基本完整，但存在輕度水腫。與模型組相比，蓮心堿治療組肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量下降，炎癥浸潤(rùn)、脂肪變性壞死程度均表現(xiàn)出明顯改善，以高劑量組尤為明顯。具體如圖1所示。

A B C DA.正常組；B.模型組；C.蓮心堿高劑量組；D.蓮心堿低劑量組圖1 各組肝臟病理切片圖

2.3 肝組織NF-κB及NF-α蛋白表達(dá) Western Blot檢測(cè)NAFLD大鼠肝組織中NF-κB、TNF-α基因表達(dá)。相比空白組，模型組肝臟組織中NF-κB蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.01)，藥物治療后，NF-κB蛋白表達(dá)有所下降，高劑量組優(yōu)于低劑量組(P<0.01)；藥物干預(yù)后各組TNF-α表達(dá)均不同程度降低，蓮心堿高劑量組與低劑量差異明顯(P<0.01)，高劑量組顯著優(yōu)于低劑量組。具體見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝組織中NE-kB、TNF-α表達(dá)比較

3 討論

ALT、AST是存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的細(xì)胞因子，是肝臟代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的常見(jiàn)指標(biāo)，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，能夠進(jìn)入血清中，導(dǎo)致血清ALT、AST水平升高， 因此，血清ALT、AST水平的高低是肝損傷的測(cè)定指標(biāo)[4-6]。本研究構(gòu)建的模型大鼠血清ALT、AST 水平升高，肝臟指數(shù)升高，肝組織中 TG、TC 水平升高，說(shuō)明成功構(gòu)建了NAFLD大鼠模型。TNF- α是一種肝損傷早期出現(xiàn)的一種促炎因子，可以誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞合成大量的白介素，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集，引起肝臟炎癥和損傷[7-8]。而 NF-κB是機(jī)體內(nèi)調(diào)控促炎細(xì)胞因子(TNF-α等)的轉(zhuǎn)錄與合成的關(guān)鍵調(diào)控因子。所以，通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎性反應(yīng)，可以積極改善肥胖所致NAFLD。

蓮心堿主要是從中藥蓮子心中提取分離得到的生物堿。蓮在我國(guó)各地均有栽培，主產(chǎn)于湖北、浙江、江西、福建、湖南等地[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[10]表明蓮具有調(diào)脂減肥、降血糖、抗氧化、抗病毒、抑菌抗炎、抗焦慮和抗抑郁等作用。楊丹虹等[11]發(fā)現(xiàn)蓮的提取物通過(guò)改善肝細(xì)胞脂變，可以拮抗高脂高糖所導(dǎo)致的NAFLD。史霄燕等[12]發(fā)現(xiàn)蓮心堿能夠明顯抑制多種誘聚劑誘導(dǎo)的高脂血癥患者，治療高脂血癥。范婷婷等[13-14]認(rèn)為蓮總生物堿能抑制前脂肪細(xì)胞3T3-L1的增殖，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，從而控制體重、預(yù)防肥胖的功效。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食構(gòu)建NAFLD大鼠模型，12周高脂喂養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)大鼠肝組織TC、TG、ALT和AST水平和NF-κB、TNF-α表達(dá)及血清明顯上升，肝臟病理學(xué)出現(xiàn)脂肪變化，炎癥加重。本研究用不同劑量蓮心堿對(duì)NAFLD大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示: 蓮心堿尤其是高劑量組可能通過(guò)降低NF-κB、TNF-α的表達(dá)，減少炎癥因子的釋放，進(jìn)而減少肝細(xì)胞損傷，顯著降低血清ALT、AST 水平，對(duì)血清TC、TG水平也有一定程度的降低，肝臟病理學(xué)改變也顯示肝小葉內(nèi)脂肪變細(xì)胞減少、縮小及炎癥、壞死細(xì)胞減少、消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表現(xiàn)出量效依賴性，但量效關(guān)系中最佳治療劑量的確定以及藥物的安全性尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，蓮心堿能夠減輕NAFLD大鼠肝組織損傷，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，蓮心堿可能是治療NAFLD的有效藥物。