鞏曉宇 嚴(yán)俊珍 邱鳳鄒 陳秋燕 陸燕萍

深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院&香港中文大學(xué)(深圳)附屬第二醫(yī)院，廣東 深圳 518172

香丹注射液為心腦血管類疾病的臨床常用制劑，有擴張血管，增進(jìn)冠狀動脈血流量的作用，主要適用于冠心病、心絞痛，亦可用于心肌梗塞等。香丹注射液的主要成分有丹參、降香，輔料為吐溫80(聚山梨酯80)。

吐溫80在中藥注射劑中一般作為助溶劑，能顯著增加香丹注射液處方中植物提取物有效成分的溶解度，防止溶液渾濁而影響藥物的吸收和釋放。有報道顯示，中藥注射劑的不良反應(yīng)事件與吐溫80的含量有一定的相關(guān)性[1-2]，香丹注射液應(yīng)用過程中比較常見的不良反應(yīng)，一方面是消化道的癥狀，如惡心、嘔吐等；一方面是過敏樣反應(yīng)，如皮膚發(fā)紅、發(fā)癢、頭暈等。這類癥狀與吐溫80之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，建立吐溫80的含量測定方法，對于指導(dǎo)臨床用藥、進(jìn)行不良反應(yīng)監(jiān)控有十分重要的意義[3]。由于吐溫80屬于大分子的聚合物，而且紫外吸收較弱，很難通過常規(guī)的C18色譜柱分離檢測，本試驗采用高效液相法、凝膠色譜柱并結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器對香丹注射液中的吐溫80進(jìn)行了含量測定和方法學(xué)研究，對多批次的香丹注射液樣品進(jìn)行分析考察，結(jié)果證實建立的方法可有效用于香丹注射液的安全性評價和質(zhì)量分析。

1 儀器與試藥

Agilent1200 高效液相色譜儀(德國)；凝膠色譜柱(TSK gel G2000SWXL 8.7 mm×30.0 cm)；Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器，LC-solution分析軟件；梅特勒AB204-N型電子分析天平。

吐溫80對照品(湖南和眾三立科技發(fā)展有限公司，批號R03DX0)，香丹注射液(廣東新峰藥業(yè)有限公司，批號160602、160703、160903)。

甲醇、乙腈等為色譜純，純化水，醋酸銨(上?；S，批號130514)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取吐溫80對照品適量，加流動相0.02 mol/L醋酸銨溶液-乙腈(90∶10)定量稀釋制成每mL含5.0 mg的溶液(實際配制濃度：5.05 mg/mL)，作為對照品母液。再精密量取5 mL，用流動相定容至25 mL容量瓶中，得到濃度為1.01 mg/mL的對照品溶液。

2.2 樣品溶液的制備 取香丹注射液，搖勻，用注射器吸取5 mL，用0.45 um微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液2 mL置樣品瓶中，即得。

2.3 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 凝膠色譜柱：(TSK gel G2000SWXL 8.7 mm×30.0 cm)，柱溫為30 ℃；以0.02 mol/L醋酸銨溶液-乙腈(90∶10)為流動相，流速為0.6 mL/min；采用Alltech ELSD2000ES檢測器，檢測條件為：漂移管溫度120 ℃，氮氣流速2.0 L/min；進(jìn)樣量10 μL。在上述條件[4-5]下，香丹注射液的吐溫80色譜峰與其他色譜峰達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)超過3000，峰形對稱。如圖1所示。

A.吐溫80對照品溶液；B.香丹注射液樣品

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取吐溫80對照品溶液適量置容量瓶中，加流動相定量稀釋成0.505 、1.01 、2.02、4.04、5.05 mg/mL吐溫80的系列對照品溶液。精密吸取各種濃度對照品溶液10μL注入液相色譜儀，按“2.3”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積的對數(shù)值對濃度的對數(shù)值作圖，得到吐溫80的回歸方程Iny=5.5418Inx+11.227，R2=0.9991，線性范圍為0.505～5.05 mg/mL。

2.5 精密度試驗 精密吸取濃度為1.01 mg/mL的吐溫80對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.3”項下色譜條件測定峰面積，其相對保留時間穩(wěn)定,6次進(jìn)樣得到吐溫80峰面積的RSD為0.6%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取濃度為1.01 mg/mL的吐溫80對照品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、10、24 h在上述色譜條件下測定。結(jié)果6次測量后，其峰面積的RSD為1.5%。表明吐溫80在24 h內(nèi)未出現(xiàn)降解，穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗 取香丹注射劑6份，每份精密吸取5 mL，分別精密加入1.01 mg/mL的吐溫80(Sigma)5 mL，按“2.2”項下的方法制備溶液，樣品含量以及加入的含量詳見表1，并按照以上的方法學(xué)測定吐溫80的峰面積，計算得到吐溫80的平均加樣回收率為97.87%，RSD=1.8%。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.8 樣品測定 根據(jù)以上方法學(xué)考察的結(jié)果，取不同批次的香丹注射液樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3”項下方法進(jìn)行含量測定。分別計算每份樣品中吐溫80的含量，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 藥用輔料與不良反應(yīng)之間具有相關(guān)性 中藥注射劑在臨床上的嚴(yán)重不良反應(yīng)時有報道，和藥物本身的來源有一定的關(guān)聯(lián)，比如藥材的產(chǎn)地差異、藥材種植中引入的重金屬、農(nóng)藥殘留、植物藥材中可能產(chǎn)生的黃曲霉毒素等，同時也和中藥成分的本身的復(fù)雜性有關(guān)[6-7]，在加上藥物使用者的個體差異，引起不良反應(yīng)的過敏原具有非常多的不確定性，但藥用輔料也是其中一個不可忽視的重要環(huán)節(jié)，藥用輔料的品質(zhì)、純度、質(zhì)量、來源等，都和藥物不良反應(yīng)之間存在一定的相關(guān)性，準(zhǔn)確的定量分析研究有助于藥物的安全性評價和藥物警戒研究。

3.2 規(guī)范注射液中吐溫80含量的合理限度 吐溫80作為增溶劑，在中藥注射液中的應(yīng)用十分普遍，由于其用量與不良反應(yīng)存在相關(guān)性[8-9]，建立樣品中吐溫80的含量可以有效控制制劑質(zhì)量，可以為臨床用藥安全提供參考標(biāo)準(zhǔn)，保證用藥安全。以上研究給出了有效的吐溫80檢測方法，限度控制研究中，還需要更多的樣品量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，樣品中也應(yīng)涵蓋不同廠家和企業(yè)，同時對藥品的原料進(jìn)行分析檢測，考察有關(guān)物質(zhì)等，為了更準(zhǔn)確合理的給出限度值，還需要結(jié)合臨床表現(xiàn)和不良反應(yīng)監(jiān)測數(shù)據(jù)，以期更科學(xué)有效的對吐溫80含量的限度進(jìn)行規(guī)范。

3.3 色譜條件的合理優(yōu)化 吐溫80是一種非離子型表面活性劑，有增溶的作用，易溶于水和甲醇、乙酸乙酯和植物油類等有機溶劑，但由于吐溫80屬于聚合物，分子量較大，不適用常規(guī)的色譜柱進(jìn)行分離，而且紫外掃描的數(shù)據(jù)表明，吐溫80也沒有明顯的紫外吸收，常規(guī)的紫外檢測器靈敏度不夠，吐溫80的含量檢測，難以用常規(guī)的色譜方法進(jìn)行分離、檢測，試驗中探索凝膠色譜柱進(jìn)行分析，結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器，需要對流動相體系的適用性進(jìn)行驗證，同時對流動相的流速和流動相體系中乙酸銨比例進(jìn)行了考察[10-12]，試驗中對比分析了醋酸銨-乙腈體系以及磷酸鹽緩沖液體系，試驗發(fā)現(xiàn)，選擇0.02 moL/L醋酸銨溶液-乙腈(90∶10)體系作為流動相可以有效的改善色譜峰型，當(dāng)流速為0.6 mL/min時，色譜圖基線平穩(wěn)，分離效果最佳，出峰時間合理。