李德麗 胡婉湘 蔣嫦月 謝露

缺血性腦血管疾病是臨床上的常見病，具有高致死率和致殘率的特點［1］，臨床首要治療方案是恢復(fù)缺血區(qū)域的血流供應(yīng)，但在恢復(fù)血流供應(yīng)的同時出現(xiàn)繼發(fā)性腦組織損傷和功能障礙，稱為腦缺血再灌注損傷（CIRI）［2］。CIRI 的病理機(jī)制主要是發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，甚至是細(xì)胞死亡［3-5］。課題組研究發(fā)現(xiàn)，ERK 抑制劑PD98059 改善心跳驟停/心肺復(fù)蘇大鼠的神經(jīng)功能，減輕細(xì)胞凋亡［6-7］。同為ERK 抑制劑U0126 在心肌缺血/再灌注模型中減輕心肌細(xì)胞凋亡［8］；在心臟移植模型中，減輕持續(xù)的冷損傷［9］；在高尿酸血癥腎病模型中減輕腎小管細(xì)胞損傷［10］；課題組前期用SH-SY5Y 細(xì)胞在體外構(gòu)建OGD/R 模型模擬體內(nèi)CIRI 模型，表明U0126 可提高細(xì)胞的生存率［11］。其抗氧化和抗細(xì)胞凋亡作用有待進(jìn)一步探究。本實驗應(yīng)用SHSY5Y 細(xì)胞OGD/R 模型，設(shè)置U0126 三個劑量組，探究其對經(jīng)OGD/R 處理后SH-SY5Y 細(xì)胞的SOD 活性、細(xì)胞凋亡的影響及量效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SH-SY5Y 細(xì)胞購自武漢大學(xué)細(xì)胞庫，MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和DMSO 購自Gibco 公司，CCK-8 購自新賽美生物科技有限公司，LDH、SOD 檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；U0126 購自美國Selleck 公司；PBS、胰酶、青鏈霉素、蛋白磷酸酶抑制劑、RIPA 購自北京索萊寶有限公司；PI 試劑盒購自美國賽默飛公司。

1.2 實驗方法 取SH-SY5Y 細(xì)胞復(fù)蘇后種在含5%胎牛血清和1%青鏈霉素完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80-90%時，用胰酶消化后離心，重懸后可傳代及鋪板。將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組（Control 組）、模型組（OGD/R 組）、溶劑組（DMSO 組）、U0126 10 μmol/L 組（U0126-L 組）、U0126 20 μmol/L 組（U0126-M 組）和U0126 30 μmol/L 組（U0126-H組）。待細(xì)胞密度達(dá)60-80%時給U0126 處理，Control 和OGD/R 兩組換完全培養(yǎng)基，DMSO 組換含0.06%DMSO 的培養(yǎng)基，U0126-L 組、U0126-M 組和U0126-H 組 分 別 換U0126 濃 度 為10、20、30 μmol/L 的培養(yǎng)基。U0126 作用24 h 后，除Control組換完全培養(yǎng)基外，其余組制備OGD/R 模型，即更DMEM 無糖培養(yǎng)基并通入氮氣使細(xì)胞缺糖缺氧，2 h 后換完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率 根據(jù)CCK-8 法檢測試劑盒說明書，將細(xì)胞按2×105個/孔種植于96 孔板，制備OGD/R 模型后每孔加100 μL CCK-8反應(yīng)液，37℃孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定450nm 處的吸收光。

1.4 酶標(biāo)法檢測培養(yǎng)液的LDH 活性 將細(xì)胞按1×106個/孔種植于6 孔板，制備OGD/R 模型后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)LDH 檢測試劑盒說明書在96 孔板加樣后搖勻，用酶標(biāo)儀測定450nm 處的吸收光。

1.5 SOD 活性檢測 將細(xì)胞按1×106個/孔種植于6 孔板，制備OGD/R 模型后提取細(xì)胞蛋白并測蛋白濃度，按照SOD 檢測試劑盒說明書在96 孔板板中加入相應(yīng)的試劑，37℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀測定450nm 處的吸收光。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞死亡率 根據(jù)PI 死染法說明書，將細(xì)胞按5×105個/孔種植于12 孔板，制備OGD/R 模型后收集細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞并用PBS沖洗兩次，將細(xì)胞懸液在5 μg/mL PI 染液中孵育，用流式細(xì)胞儀測量10000 個細(xì)胞/樣本在488nm 波長激發(fā)的熒光強(qiáng)度，通過f12 通道記錄PI 的熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 使用統(tǒng)計軟件SPSS23.0 進(jìn)行分析，計量資料結(jié)果以（）表示。使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）計算各組組間均值差異，以P＜0.05 為兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8 法 檢 測U0126 對SH-SY5Y 細(xì) 胞OGD/R 后細(xì)胞存活率的影響 Control 組細(xì)胞數(shù)量多，排列緊密，狀態(tài)好且輪廓清晰。與Control 組比較，OGD/R 組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列疏散，狀態(tài)差且形態(tài)不規(guī)則，存活率顯著降低（P＜0.05）。與OGD/R 組比較，U0126 各組細(xì)胞數(shù)量明顯增加、形態(tài)趨于規(guī)則，存活率顯著升高（P均＜0.05），顯示出劑量依賴性，U0126-H 組顯著高于U0126-L 組（P＜0.05）。DMSO 組與OGD/R 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 U0126 對OGD/R 后細(xì)胞存活率的影響（n=3）

2.2 U0126 對SH-SY5Y 細(xì)胞OGD/R 后細(xì)胞培養(yǎng)液LDH 活性的影響 與Control 組比較，OGD/R 組細(xì)胞培養(yǎng)液LDH 活性顯著增高（P＜0.05）。與OGD/R 組比較，U0126 各組細(xì)胞培養(yǎng)液LDH 活性顯著降低（P均＜0.05），顯示出劑量依賴性，U0126-H 組顯著低于U0126-L 組（P＜0.05）。DMSO 組與OGD/R 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 U0126 對OGD/R 后細(xì)胞培養(yǎng)液LDH 活性的影響（n=3）

2.3 U0126 對SH-SY5Y 細(xì) 胞OGD/R 后 細(xì) 胞SOD 活性的影響 與Control 組比較，OGD/R 組細(xì)胞中SOD 活性顯著下降（P＜0.05）。與OGD/R 組比較，U0126 各組細(xì)胞中SOD 活性顯著增加（P均＜0.05），顯示出劑量依賴性，U0126-H 組顯著高于U0126-L 組（P＜0.05）。DMSO 組與OGD/R 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 U0126 對OGD/R 后細(xì)胞SOD 活性的影響（n=3）

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測U0126 對SH-SY5Y 細(xì)胞OGD/R 后細(xì)胞凋亡率的影響 與Control 組比較，OGD/R 組細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加（P＜0.05）。與OGD/R 組比較，U0126 各組細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少（P均＜0.05），顯示出劑量依賴性，U0126-H 組顯著低于U0126-L 組（P＜0.05）。DMSO 組與OGD/R組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 U0126 對OGD/R 后細(xì)胞凋亡率的影響（n=3）

3 討 論

本實驗觀察到在SH-SY5Y 細(xì)胞OGD/R 模型中，U0126 能提高細(xì)胞活性和SOD 活性，降低培養(yǎng)液LDH 活性和細(xì)胞的凋亡率。此結(jié)果與前期U0126 相關(guān)報道相一致。機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時，SOD 活性降低，清除ROS 的能力下降［12］；在U0126處理后，細(xì)胞SOD 活性增加，清除OGD/R 產(chǎn)生的ROS 的能力增加，有助于細(xì)胞活性的提高。

課題組前期研究通過食管電刺激誘發(fā)心室顫動，建立大鼠全腦缺血再灌注模型，觀察到大鼠復(fù)蘇后腦部ROS 和MDA 水平增高，SOD 活性降低；在大鼠恢復(fù)自主循環(huán)后靜脈注射PD98059，使p-ERK 蛋白表達(dá)量下降，有效降低ROS 和MDA 活性，提高SOD 活性，改善CA/CPR 后大鼠生存率、延長生存時間、改善神經(jīng)功能［6-7］。因此可認(rèn)為PD98059 是通過抑制ERK 通路激活，降低線粒體源ROS 活性，提高細(xì)胞抗氧化能力，起到保護(hù)作用。本次實驗得出U0126 的抗氧化作用與課題組前期研究PD98058 在動物心跳驟停/心肺復(fù)蘇模型中的作用是相符的。因此可認(rèn)為在細(xì)胞OGD/R 模型中，U0126 的作用也與抑制ERK 通路激活相關(guān)。

課題組前期實驗在SH-SY5Y 細(xì)胞OGD/R 模型中表明，U0126 降低cleaved-Caspase3 的表達(dá)量，抑制Caspase3 的激活，起到減少細(xì)胞凋亡的作用［11］；本實驗通過流式細(xì)胞術(shù)PI 死染法直接檢測各組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示U0126 可降低細(xì)胞的凋亡率，與前期的實驗結(jié)果相符。

綜上所述，ERK 抑制劑U0126 呈現(xiàn)出提高細(xì)胞的抗氧化能力、抵抗OGD/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性，更多的作用機(jī)制還需要深入探索。