王 敏，蔡蕓瑩，武 澤，朱秀芳，汪瑞琪，蘇 恒

(1.云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650091；2.云南省第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，云南 昆明 650032；3.云南省第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650032；4.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院,云南 昆明 650032)

0 引 言

全氟化合物(Perfluorinated Compounds，PFCs)是一類具有獨(dú)特表面活性劑性質(zhì)的合成含氟化合物，可作為疏水疏油劑，其結(jié)構(gòu)是烷烴分子鏈上的氟原子取代氫原子.由于碳氟鍵是化學(xué)穩(wěn)定性最強(qiáng)的鍵，因此PFCs具有高度耐化學(xué)和熱降解的特性，可長(zhǎng)期穩(wěn)定存在于自然環(huán)境中.自20世紀(jì)50年代以來，含氟有機(jī)物廣泛用于紙張、服裝、地毯、食品包裝材料和廚房用具的生產(chǎn)[1].PFCs是具有高度生物蓄積性的環(huán)境污染物，進(jìn)入人體的主要途徑包括受污染的空氣顆粒、飲食和水[2-3].動(dòng)物研究表明，全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)對(duì)肝臟、免疫系統(tǒng)、發(fā)育和生殖都具有毒性作用[4-6].PFCs作為重要的內(nèi)分泌干擾物，可對(duì)女性卵巢激素水平[7-9]及卵母細(xì)胞受精能力[10]產(chǎn)生不良影響, 與女性不孕不育之間存在密切關(guān)系.

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem Massspectrometry, MS-MS)聯(lián)用技術(shù)具有樣品需要量少、高靈敏度、高精確度、高分辨率鑒定和量化目標(biāo)分析物等突出優(yōu)勢(shì)，能有效地解決生物樣本中痕量組份同時(shí)檢測(cè)及確證等難點(diǎn)問題，近年來已被廣泛應(yīng)用于人體血漿[11]、血清[12]、臍帶血[13-14]等痕量PFCs的高通量檢測(cè).離線或在線固相萃取(SPE)法是目前比較主流的人體體液樣品前處理方法，具有基質(zhì)效應(yīng)較低及信號(hào)強(qiáng)度較高等優(yōu)勢(shì)[15-16]，但不足之處在于樣品需經(jīng)過柱子預(yù)處理，包括上樣、淋洗、洗脫、蒸發(fā)和復(fù)溶等較為繁瑣的步驟，在不使用自動(dòng)固相萃取裝置處理樣品時(shí)不太適合高通量分析.近年來有研究通過蛋白沉淀技術(shù)預(yù)處理血清后采用超高效液相色譜(UHPLC)結(jié)合質(zhì)譜(MS)法對(duì)PFCs進(jìn)行快速色譜分離，在提高信噪比(S/N)的同時(shí)兼顧了分離效率，取得較好效果[13].

卵泡液(Follicular Fluid, FF)由顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞分泌的因子以及血漿滲透液組成，在卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟中發(fā)揮重要作用，理論上FF中的PFCs與女性生育力的關(guān)系應(yīng)該較血清更為緊密.由于人的FF獲取難度較大，加之FF內(nèi)的PFCs濃度可能比血清中更為微量，目前探討卵泡液中PFCs水平的研究尚不多見.

本研究采用蛋白沉淀預(yù)處理FF樣品，通過優(yōu)化高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法液相色譜流動(dòng)相條件，在有效提高長(zhǎng)鏈全氟化合物檢測(cè)靈敏度的同時(shí)也兼顧了短鏈全氟化合物的檢測(cè)靈敏度, 建立了一種可同時(shí)測(cè)定卵泡液中C4～C11的8種PFCs的分析方法.本方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度和回收率高的優(yōu)勢(shì).通過此方法對(duì)104例接受體外受精不孕婦女卵泡液樣本中的PFCs水平進(jìn)行定量分析，評(píng)估其與輔助生殖結(jié)局的關(guān)系.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

EXIONLC System超高效液相色譜儀、SCIEX 6500 QTRAP+質(zhì)譜儀(美國(guó)SCIEX公司)；Heraeus Fresco17離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；PS-60AL超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)；BSA124S-CW電子天平(德國(guó)Sartorius公司);氮吹儀(上海梓桂儀器有限公司).

全氟辛酸(PFOA，purity≥98%，CAS No.335-67-1)、全氟己烷磺酸鉀(PFHxS, purity≥98%，CAS No.3871-99-6)、全氟癸酸(PFDA, purity≥98%，CAS No.335-76-2)、全氟庚酸(PFHpA, purity≥99%, CAS No.375-85-9)、全氟丁酸(PFBA，purity≥99%，CAS No.375-22-4)乙酸銨(99%，CAS No.631-61-8)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；全氟辛基磺酸(PFOS, 99.1%，CAS No.1763-23-1)、全氟壬酸(PFNA, 98.5%，CAS No.375-95-1)、全氟十一酸(PFUA, 99.2%，CAS No.2058-94-8)購(gòu)自德國(guó)DR EHRENSTORFER公司；13C4-PFOA(50 μg/mL，CAS No.960315-48-4)和13C4-PFOS(50 μg/mL，CAS No.960315-53-1)購(gòu)自加拿大Wellington Laboratories；甲醇(≥99.9%，CAS No.67-56-1)、乙腈(≥99.9%)購(gòu)自德國(guó)Merk公司.實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng) Milli-Q 純水儀(美國(guó)Millipore公司)制備的超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵泡液樣品準(zhǔn)備和前處理

人卵泡液樣品由云南省第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科采集提供.樣品收集自2018年至2020年在云南省第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科接受體外受精治療的104名女性卵泡液樣本.研究經(jīng)云南省第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2017YY138)，所有入組者均簽署知情同意書.卵泡液樣品采用蛋白沉淀法進(jìn)行預(yù)處理.將裝有卵泡液樣品的聚丙烯離心管在 4 ℃ 解凍為溶液，渦旋震蕩 30 s 混勻.取 150 μL 樣品，加入 450 μL 甲醇液.向溶液中加入兩個(gè)同位素內(nèi)標(biāo)(13C4-PFOA、13C4-PFOS)稀釋至 10 nmol/L，渦旋 30 s，在冰水浴中超聲 20 min 后于 4 ℃ 靜置 10 min；樣品在 4 ℃ 離心 15 min，12 000 rpm；取上清液 400 μL，氮?dú)獯蹈?；?100 μL 定容試劑(甲醇∶水=7∶3)復(fù)溶，超聲 10 min，離心 15 min，12 000 rpm，取上清液待上機(jī)分析.

將 10 mmol/L 的儲(chǔ)備液混標(biāo)逐級(jí)稀釋，配制成含 10 nmol/L 同位素內(nèi)標(biāo)的15種0.01～200 nmol/L 校準(zhǔn)溶液.實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿在實(shí)驗(yàn)前用甲醇沖洗.

1.2.2 全氟化合物的液相色譜分離條件

色譜柱: ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm, Waters)；柱溫：40 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4 ℃;流動(dòng)相A為乙酸銨溶液(3 mmol/L，pH=8.5)，B相為乙腈.梯度洗脫程序：0～0.5 min，75% A；0.5～2 min，75%～50% A；2～4 min，50%～5% A；4～5 min，5% A；5～5.1 min，5%～75% A；5.1～8 min，75% A.進(jìn)樣體積為 5 μL.

1.2.3 全氟化合物的質(zhì)譜檢測(cè)條件

IonDrive Turbo V電噴霧離子源(ESI)；負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；噴霧電壓(ISV)：-4 500 V；離子化溫度(TEM)：400 ℃；氣簾氣(CUR)：30 PSI(1 PSI=6.89 kPa)；噴霧氣(GS1)：45 PSI；輔助加熱氣(GS2)：45 PSI.

1.2.4 臨床妊娠判斷

臨床妊娠定義為：接受體外受精，胚胎移植后28天B超可見子宮內(nèi)孕囊、胚芽及胎心搏動(dòng).

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及目標(biāo)化合物定量分析工作，均通過SCIEX Analyst Work Station Software(Version 1.6.3)和Sciex OS-Q software完成.采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn))統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件優(yōu)化

PFCs是具有一定表面活性和極性的有機(jī)化合物, 有研究報(bào)道，采用較低硅羥基活性填料的C18反相柱可以實(shí)現(xiàn)這類化合物的分離[17].本研究比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和Thermo Hypersil GOLDTMC18(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)兩種色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果和峰形，結(jié)果表明，8種全氟化合物在Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱上峰形尖銳，峰的對(duì)稱度和響應(yīng)更好.因此本文選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)色譜柱.

我們分別考察了乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-1 mmol/L 乙酸銨溶液、乙腈-3mmol/L 乙酸銨溶液體系對(duì)8種PFCs 響應(yīng)強(qiáng)度及分離效果的差異，發(fā)現(xiàn)C4～C8短鏈PFCs和中鏈PFCs在乙腈-0.1%甲酸溶液體系中的信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度更好，而長(zhǎng)鏈PFCs，如全氟壬酸、全氟癸酸和全氟十一酸的色譜峰響應(yīng)不強(qiáng).之后我們將 3 mmol/L 乙酸銨用氨水調(diào)至pH 8.5，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈PFCs色譜峰響應(yīng)效果明顯改善，同時(shí)短鏈和中鏈PFCs的響應(yīng)強(qiáng)度和分離效果也得到較好的保證.綜合考慮7個(gè)全氟化合物的信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度，本研究選擇 3 mmol/L、pH 8.5的乙酸銨溶液作流動(dòng)相.

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

使用針泵進(jìn)樣直接注入質(zhì)譜儀，分別將母離子在ESI +和ESI-兩種模式下進(jìn)行全掃描，結(jié)果顯示ESI-模式下8種待測(cè)物和2種同位素內(nèi)標(biāo)的離子信號(hào)穩(wěn)定、響應(yīng)高，因此選擇ESI-掃描模式.在電噴霧負(fù)離子模式MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下優(yōu)化各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)，使目標(biāo)分析物離子的信號(hào)達(dá)到最佳.確定PFCs以及內(nèi)標(biāo)的母離子, 根據(jù)離子對(duì)的豐度確定碰撞電壓(CE).優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1.

2.3 本底水平、線性范圍、檢出限和定量限

控制本底污染是PFCs檢測(cè)方法質(zhì)量保證和控制的關(guān)鍵，本方法考察了測(cè)試程序中空白試劑目標(biāo)分析物的本底水平.結(jié)果顯示，空白溶劑中檢出PFOA背底，濃度小于 0.008 ng/mL(見圖1).污染源可能來自色譜系統(tǒng)的聚四氟乙烯和全氟烷氧基化合物.

圖1 全氟辛酸濃度

在優(yōu)化條件下，我們考察了方法的檢出限、定量限和線性范圍.檢出限和定量限為全氟化合物信噪比(S/N)3和10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度.以目標(biāo)分析物濃度對(duì)定量?jī)?nèi)標(biāo)濃度之比為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線.如表2所示，PFBA、PFHpA、PFHxS、PFNA、PFOS、PFNA和PFUA共7種目標(biāo)物的檢出限(LOD)在 0.002～0.004 ng/mL 之間，定量限(LOQ)在0.005～0.011 ng/mL 之間.因存在空白背底，PFOA的LOD和LOQ均高于這7個(gè)PFCs，分別為 0.008 ng/mL(LOD)和 0.017 ng/mL(LOQ).線性相關(guān)系數(shù)≥0.992 3.本方法可同時(shí)測(cè)定卵泡液基質(zhì)中8種從短鏈到長(zhǎng)鏈PFCs,靈敏度高、線性范圍寬, 能夠滿足卵泡液中痕量PFCs的準(zhǔn)確定量需要.

表2 目標(biāo)分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限和定量限

2.4 回收率、基質(zhì)效應(yīng)和精密度

為保證方法的可靠性，我們考察了精密度、基質(zhì)效應(yīng)和加標(biāo)回收率.制備2種濃度的樣品(2 nmol/L、6 nmol/L)在日內(nèi)、日間重復(fù)做5次分析，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果見表3.基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect，ME)通過計(jì)算卵泡液中 10 nmol/L 同位素內(nèi)標(biāo)MPFOA和MPFOS的響應(yīng)值與甲醇溶液中 10 nmol/L 同位素內(nèi)標(biāo)MPFOA和MPFOS響應(yīng)值的比值得到.卵泡液中加入目標(biāo)分析物的2個(gè)濃度水平(5 nmol/L、定量上限)，重復(fù)測(cè)定3次計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4.目標(biāo)分析物的日內(nèi)精密度在0.9%～9.2%之間，日間精密度在3.3%～14.1%之間.ME%(MPFOA)=93%，ME%(MPFOS)=80%.檢測(cè)結(jié)果未觀察到嚴(yán)重的基質(zhì)抑制效應(yīng).卵泡液中8種全氟化合物的加標(biāo)回收率為85.9%～138.8%，精密度在4.1%～21.1%之間.上述結(jié)果表明,所建立的蛋白質(zhì)前處理和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法準(zhǔn)確、可靠,符合分析方法的要求.

表3 目標(biāo)分析物的精密度

表4 卵泡液中目標(biāo)分析物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 實(shí)際樣品分析

我們采用優(yōu)化的液相色譜質(zhì)譜條件對(duì)云南地區(qū)104例體外受精患者的卵泡液做分析，檢測(cè)結(jié)果顯示，卵泡液中8種PFCS的檢出率均為100%(見圖2).卵泡液中8種PFCs見表5.PFCs濃度(幾何均值GM)較高的是PFBA(5.501 ng/mL)、PFOA(1.080 ng/mL)和PFOS(0.856 ng/mL)，其次是PFHpA(0.841 ng/mL)、PFNA(0.526 ng/mL)、PFUA(0.270 ng/mL)和PFDA(0.227 ng/mL)，含量最低的是PFHxS(0.050 ng/mL).在以往的報(bào)道中，59例英國(guó)婦女卵泡液中檢出PFOS(GM：2.0 ng/mL)、PFOA(GM：1.82 ng/mL)、PFHxS(GM：0.88 ng/mL)和PFNA(GM：0.41 ng/mL)[18]，但因檢出限(LOD)水平高，英國(guó)未檢出PFBA、PFDA和PFUA.本研究發(fā)現(xiàn)，云南地區(qū)卵泡液中PFOS和PFOA濃度低于英國(guó)[PFOS(GM：2.0 ng/mL)、PFOA(GM：1.82 ng/mL)]和北京[PFOS(GM：4.82 ng/mL)和PFOA(GM：4.6 ng/mL)][19].本研究中，云南地區(qū)的PFNA、PFDA和PFUA濃度與北京報(bào)道近似，但PFHpA水平(GM：0.841 ng/mL)遠(yuǎn)高于北京(0.012 ng/mL).與英國(guó)和北京的報(bào)道不同，本研究在FF中檢出了PFBA.

圖2 卵泡液中8個(gè)全氟化合物和2個(gè)同位素內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜圖

表5 卵泡液中8種全氟化合物的檢測(cè)結(jié)果(ng/mL,n=104)

2.6 卵泡液PFCs與體外受精結(jié)局的關(guān)系

本研究按累計(jì)妊娠情況將患者分為妊娠組(n=46)和未妊娠組(n=58)，比較兩組間IVF指標(biāo)和卵泡液PFCs水平的差異.結(jié)果表明，與未妊娠組相比，妊娠組竇卵泡數(shù)[4(3,6)vs 3(2,5)，P=0.015]、MII卵數(shù)[0(0,1)vs 1(0,2)，P=0.034]和受精率[71.4% vs 54%.1，P=0.018]均顯著高于未妊娠組.此外，與妊娠組相比，未妊娠組卵泡液中PFOA[1.15(0.90,1.53)ng/mL vs 0.98(0.82,1.21)ng/mL，P=0.034]；PFNA[0.58(0.47,0.78)vs 0.46(0.38,0.67)ng/mL,P=0.007]；PFHxS[0.05(0.04,0.08)vs 0.04(0.03,0.06)ng/mL,P=0.034]水平顯著增高(見表6).

表6 體外受精后累計(jì)妊娠與未妊娠組臨床指標(biāo)和卵泡液PFCs水平

多項(xiàng)研究顯示，不孕婦女體液中的PFCs水平可能與體外授精/單精子胞漿內(nèi)注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)結(jié)局有關(guān).Fei等[11]對(duì)懷孕4～14周的丹麥婦女的研究表明，血漿全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)水平較高的婦女生育率低下的發(fā)生率較高.Velez等[20]在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對(duì)母嬰影響研究項(xiàng)目(MIREC)也發(fā)現(xiàn)，血清中PFOA和PFHxS每增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，受孕率降低約10%.國(guó)內(nèi)Zhang等[21]對(duì)173例子宮內(nèi)膜異位癥不孕婦女的研究發(fā)現(xiàn)，血漿中全氟丁烷磺酸(PFBS)水平與患子宮內(nèi)膜異位癥的不孕癥的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān).此外，有研究顯示，PFOA及PFOS是卵泡液中含量最高的全氟化合物，卵泡液中PFCs的暴露與體外受精的受精率及獲卵數(shù)之間有相關(guān)性[22].我們將卵泡液中的PFCs進(jìn)行三等分，與PFBA水平最低的三分位組相比，水平最高三分位組的婦女竇卵泡數(shù)、總卵泡數(shù)、MII卵數(shù)顯著降低；與PFHxS水平最低的三分位組相比，水平最高三分位組的婦女總卵泡數(shù)和MII卵數(shù)顯著增高；與PFOS水平最低的三分位組相比，水平最高三分位組的婦女總卵泡數(shù)顯著增高(見表7).但我們的研究沒有發(fā)現(xiàn)PFCs與優(yōu)胚數(shù)有關(guān).

表7 卵泡液PFCs暴露水平與IVF指標(biāo)的關(guān)系

3 結(jié) 論

基于超高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，采用蛋白質(zhì)沉淀預(yù)處理技術(shù)建立了在人卵泡液中測(cè)量8種微量全氟化合物的方法.本方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足人卵泡液中全氟化合物的定性和定量要求，為不孕不育患者的診斷并進(jìn)行生殖輔助治療提供了重要的技術(shù)支持.研究發(fā)現(xiàn)，體外受精后臨床妊娠組與未妊娠組相比，卵泡液中PFCs水平存在差異.此外，卵泡液中PFCs與IVF指標(biāo)，竇卵泡數(shù)、總卵泡數(shù)和MII卵數(shù)有關(guān).這些結(jié)果提示卵泡液中PFCs可能對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育存在影響，但不同種類的PFCs的生殖影響可能存在差異.今后的研究還需加大樣本量，深入探究全氟化合物對(duì)女性生殖的影響及機(jī)制.