陳星宇 文旭洋 賈仁兵 葛盛芳

視網(wǎng)膜母細胞瘤是兒童最常見的眼惡性腫瘤，占兒童惡性腫瘤的3%[1，2]。隨疾病進展，視網(wǎng)膜母細胞瘤可出現(xiàn)局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移，其中顱內(nèi)轉(zhuǎn)移是造成患兒死亡的主要原因[3]。通過早期篩查、診斷及治療，可有效提高視網(wǎng)膜母細胞瘤患者保眼率[4]。視網(wǎng)膜母細胞瘤有多種保眼治療手段，包括全身化療、動脈介入化療、敷貼放射治療和局部治療(激光、冷凍、玻璃體腔注射等)[2]。近來發(fā)現(xiàn)，動脈介入化療可在不影響患兒生存率的前提下，顯著提高保眼率[5]。此外，玻璃體腔內(nèi)注射化療藥物對視網(wǎng)膜母細胞瘤玻璃體播散療效明顯[6]。馬法蘭是動脈介入化療和玻璃體腔注射治療最常用的藥物，既往應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤等多種惡性腫瘤的全身化療[7]。馬法蘭是一種烷化劑，可烷化DNA中的鳥嘌呤，與DNA發(fā)生交叉連接抑制蛋白合成[8]。但馬法蘭在視網(wǎng)膜母細胞瘤中的作用機制尚不明確，明確馬法蘭在視網(wǎng)膜母細胞瘤中的作用機制具有重要意義。

隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，RNA-測序(RNA-sequencing, RNA-seq)已成為分析基因表達水平的重要手段[9]。在腫瘤中，該技術(shù)常被應(yīng)用于檢測基因表達水平及鑒別新基因和轉(zhuǎn)錄因子。在本研究中，我們將應(yīng)用該技術(shù)，檢測mRNA表達譜，并對其進行生物信息學(xué)分析，探索馬法蘭在治療視網(wǎng)膜母細胞瘤中的作用機制。

資料與方法

一、視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞系來源及培養(yǎng)方法

實驗研究。視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞SO-RB50來源于廣州中山眼科中心，細胞在含10%胎牛血清(Thermo Fisher scientific)的RPMI1640(Gibco)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，CO2濃度為5%。

二、馬法蘭與SO-RB50細胞系聯(lián)合培養(yǎng)及取樣分析

實驗組為SO-RB50細胞與1.107 nM的馬法蘭聯(lián)合培養(yǎng)，對照組SO-RB50細胞接受相對應(yīng)濃度DMSO處理。分別在4 h，8 h，12 h以及24 h進行取樣分析，通過Nanodrop2000檢測所提RNA的濃度和純度，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，通過Agilent2100 測定RIN值。質(zhì)檢合格后進行mRNA測序(mRNA sequencing, mRNA-seq)。

三、生物信息學(xué)技術(shù)分析測序

對測序結(jié)果進行圖像識別，去污染，去接頭。通過RNA測序最大希望算法(RNA-Seq by Expectation-Maximization，RSEM)將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對至人類參考基因組上，對比對結(jié)果進行統(tǒng)計量化，得到每個樣品比對到每個轉(zhuǎn)錄本上的reads數(shù)目?；谠嫉膔eads數(shù)據(jù)，進行標(biāo)準化(normalization)，進而得到每個基因的表達值。然后，對不同組間差異表達基因計算及多重假設(shè)檢驗校正，得到FDR值(錯誤發(fā)現(xiàn)率)和log2|FC|(log2|Fold Change|)。篩選標(biāo)準為FDR<0.05，log2FC>1(上調(diào)基因)或log2FC<-1(下調(diào)基因)。獲取馬法蘭處理后不同時間點的差異表達基因，對其進行GO富集分析(DAVID: https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，通過R語言對時間序列上相同變化趨勢的基因進行聚類，同時進行KEGG通路富集分析。

結(jié) 果

一、時序差異表達基因

經(jīng)過標(biāo)準化預(yù)處理后，所有的樣品測序深度一致，以FDR<0.05和log2|FC|>1為標(biāo)準，獲得各時序的差異表達基因?；鹕綀D顯示各時序的上調(diào)基因和下調(diào)基因(圖1A)?；鹕綀D和韋恩圖顯示，馬法蘭在前4 h引起1 723個基因持續(xù)發(fā)生差異表達，前8 h引起213個基因持續(xù)發(fā)生差異表達，前12 h引起344個基因持續(xù)發(fā)生差異表達，24 h僅360個基因發(fā)生表達量的變化(圖1B)。可見，馬法蘭對基因表達影響最顯著的作用時間為前4 h。

圖1 時序的差異表達基因A示馬法蘭處理后各時間點樣本進一步差異表達變化的基因。(紅色圓點為表達上調(diào)差異表達基因FDR<0.05和log2FC>1，藍色圓點為表達下調(diào)的差異表達基因FDR<0.05和log2FC<-1，黑色小點為表達未發(fā)生差異改變的基因) B示馬法蘭處理后各時間點樣本進一步差異表達變化的基因數(shù)量

二、差異表達基因功能注釋及富集分析

近一步通過GO富集分析馬法蘭處理4 h后引起的差異表達基因(DGEs)，發(fā)現(xiàn)主要在以下幾個方面發(fā)生改變：在生物學(xué)過程方面，差異表達基因主要涉及細胞進程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)等；在細胞組分方面，差異表達基因主要影響細胞、細胞器和細胞膜等成分；在分子功能方面，差異表達基因主要富集在導(dǎo)致結(jié)合和催化活性等生物過程(圖2A)。其中蛋白結(jié)合和細胞進程調(diào)控的改變最為顯著(圖2B)。對比不同時間點發(fā)現(xiàn)，馬法蘭處理8 h對比處理4 h，差異表達基因涉及突觸相關(guān)的改變(圖2C)，馬法蘭處理12 h相比處理8 h，差異表達基因參與解剖結(jié)構(gòu)相關(guān)改變(圖2D)，馬法蘭24 h相比處理12 h，差異表達基因影響生長和極性相關(guān)改變(圖2E)。

圖2 差異表達基因的富集分析及功能注釋A示馬法蘭4 h處理后差異基因GO富集情況 B-E示馬法蘭處理后各時間點樣本差異基因的GO富集情況橫坐標(biāo)：富集指數(shù)，點的大小和顏色代表富集的顯著性，點越大，顏色越深，表示富集程度越高；縱坐標(biāo)：馬法蘭處理后各時間點樣本差異基因的GO富集情況

三、相同變化趨勢基因的聚類分析

通過R語言對在時間序列上相同變化趨勢的基因進行聚類分析發(fā)現(xiàn)：DEGs一共可分成8類不同變化趨勢的基因簇(圖3A)。進一步分析發(fā)現(xiàn)：在這八類變化趨勢的基因簇中，第2簇和第6簇的基因在馬法蘭作用后表達量分別迅速下調(diào)和上調(diào)，并于4 h后表達量維持不變；第7簇和第8簇的基因隨馬法蘭作用時間延長，表達量不斷持續(xù)升高或降低；第3簇的基因則在馬法蘭作用早期(4 h)表達量不變，在8 h后表達量顯著升高(圖3B)。

圖3 差異表達基因聚類分析A示熱圖上相同變化趨勢基因聚集分析，分成8個基因簇 B示8個基因簇在馬法蘭用后不同時間表達水平連續(xù)變化情況

四、不同簇基因KEGG功能富集及網(wǎng)絡(luò)搭建

對不同簇的基因分別進行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，馬法蘭作用后表達量迅速降低的第2簇基因主要富集于剪接體通路和核糖體生物發(fā)生通路(圖4A)，而表達量逐漸降低的第8簇基因主要富集于同源重組通路和DNA復(fù)制通路(圖4E)；馬法蘭作用后表達量迅速升高的第6簇基因主要富集于磷酸肌醇代謝通路和蛋白聚糖通路(圖4C)，表達量逐漸升高的第7簇基因主要富集于蛋白酶體通路(圖4D)；第3簇基因于馬法蘭作用8 h后顯著升高，主要富集于類固醇生物合成通路和萜類化合物生物合成通路(圖4B)。

圖4 各簇基因功能富集及互作網(wǎng)絡(luò)A-E示差異基因簇基因KEGG通路富集情況橫坐標(biāo)：基因比率，點的大小和顏色代表富集的顯著性，點越大，顏色越深，表示富集程度越高；縱坐標(biāo)：馬法蘭處理后各時間點樣本差異基因的KEGG富集情況

討 論

視網(wǎng)膜母細胞瘤是對兒童危害最大的惡性腫瘤之一，多發(fā)生于3歲以下嬰幼兒，早期干預(yù)往往有著較好的治療效果和預(yù)后[10]。目前認為，視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生主要與13號常染色體q14 基因組區(qū)相關(guān)，其中位于該區(qū)域的RB1雙等位基因失活，被認為是其發(fā)生的最主要因素[11，12]。此外，多種基因和通路異常被發(fā)現(xiàn)與視網(wǎng)膜母細胞瘤發(fā)生相關(guān)，包括CDK、E2F1-CIP2A反饋通路[13]、MDM2[14]、MYCN[15]、SKY[16]、PLAC2[17]、PTEN-PI3K/AKT通路等[18]。

化療是視網(wǎng)膜母細胞瘤的主要保眼治療方法，其中動脈介入化療和玻璃體腔化療是目前提高患兒保眼率的主要治療方法[19]。馬法蘭是視網(wǎng)膜母細胞瘤動脈介入化療和玻璃體腔化療中的主要化療藥物，也是一種廣泛應(yīng)用臨床腫瘤治療的藥物[20]，但其具體抗腫瘤作用機制尚不清楚。本研究通過RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)方法，分析了馬法蘭處理視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞不同時長后基因表達的變化情況，初步揭示了馬法蘭在視網(wǎng)膜母細胞瘤中的治療機制。

生物信息學(xué)分析表明，馬法蘭影響視網(wǎng)膜母細胞瘤基因表達譜，對各時間段差異表達基因進行聚類分析得到八類基因簇。第二簇基因在馬法蘭作用初期(4 h)表達量顯著降低而后保持持續(xù)低表達，其中WDR3為甲狀腺癌易感性相關(guān)基因[21]，UTP14C可以介導(dǎo)破壞TP53引起的凋亡信號，從而引起卵巢癌[22]。在K562白血病和PC3前列腺癌細胞株中，SRPK1敲除或抑制可以降低細胞的增殖、侵襲和遷移[23]。SR因子及SRSF家族可作為乳腺癌以及一些未發(fā)現(xiàn)的腫瘤治療靶點，例如SRSF6多可引起腺泡形態(tài)破壞，引起轉(zhuǎn)移增殖[24]。第六簇基因在馬法蘭作用初期(4 h)表達量顯著升高而后保持高表達，其中PSMD2在胃癌中通過抑制DUSP7、WIP1和PTEN，進而誘導(dǎo)ERK、P38和AKT的磷酸化，從而調(diào)控細胞增殖[25]。PSMD4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡肝癌細胞。PSMC3在非小細胞肺癌中通過miR-182-5p/NME2信號通路抑制細胞的侵襲和遷移[26]。MD-ND6突變可通過增加ROS促進宮頸癌變[27]。第七簇基因在馬法蘭作用視網(wǎng)膜母細胞瘤后表達量不斷升高，其中PSMA4的變異與肺癌的發(fā)病率相關(guān)[28]。NDUFA11的調(diào)節(jié)與肺鱗狀細胞癌的發(fā)生相關(guān)[29]。第八簇基因在馬法蘭作用視網(wǎng)膜母細胞瘤后表達量不斷降低，例如BRCA1和RAD51C是遺傳性卵巢癌和乳腺癌的主要基因[30，31]。RAD51在同源重組中起重要作用[32]。RFC2作為RFC家族的一員，已經(jīng)被報道與結(jié)腸癌及各種惡性腫瘤相關(guān)，并在增殖、侵襲以及遠處轉(zhuǎn)移中起重要作用[33]。第三簇基因于馬法蘭作用8 h后顯著升高，其中NSDHL在胰導(dǎo)管腺癌中的缺失可進一步激活轉(zhuǎn)化生長因子β，從而導(dǎo)致上皮間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化[34]。該簇基因多影響脂類、類固醇類合成。

綜上所述，馬法蘭可能通過抑制DNA復(fù)制和同源重組，并促進磷酸肌醇代謝和萜類化合物生物合成等多個方面，達到抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤生長并殺傷腫瘤細胞的作用，為臨床更加合理選擇應(yīng)用馬法蘭提供了依據(jù)。