白娜玲， 何 宇， 李雙喜， 張翰林， 張娟琴， 鄭憲清， 張海韻， 劉善良， 呂衛(wèi)光,5*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學院 生態(tài)環(huán)境保護研究所，上海 201403；2.時科生物科技(上海)有限公司，上海 201108；3.上海海洋大學 海洋生態(tài)與環(huán)境學院，上海 201306；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 上海農(nóng)業(yè)環(huán)境與耕地保育科學觀測試驗站，上海 201403；5.上海市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護監(jiān)測站，上海 201403)

烷基酚聚氧乙烯醚(APEOs)是全球第二大商用非離子型表面活性劑，其中壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)占APEOs總產(chǎn)量的80%～85%[1]。市場上的NPEOs是含同分異構(gòu)體與同系物的混合物，聚合度由平均乙氧基(EO)數(shù)目(n=1～50)來表征。NPEOs具有良好的潤濕、乳化、起泡、增溶、滲透等功能，被廣泛用于洗滌、紡織、橡膠、醫(yī)藥、塑料、農(nóng)藥等領域，可通過各種途徑釋放到環(huán)境中。NPEOs及其一系列降解產(chǎn)物在污水排放口、污泥沉積物、土壤等樣品中被廣泛檢測到[2-3]。NPEOs或其產(chǎn)物進入生物體后，對激素代謝過程產(chǎn)生干擾，威脅生物體的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及生存和繁殖[4-6]。由于NPEOs及其代謝產(chǎn)物具有雌激素毒性與難降解特性，各國對NPEOs類物質(zhì)的使用進行了嚴格規(guī)定。2011年，《中國嚴格限制進出口的有毒化學品目錄》中首次將壬基酚(NP)和NPEOs列為禁止進出口物質(zhì)。2012年，國際生態(tài)紡織標準將辛基酚(OP)、NP、辛基酚聚氧乙烯醚(OPEOs)、NPEOs列于其中并對其限量[7]。歐盟委員會的2016年第26號法規(guī)，要求紡織制品中NPEOs含量不得高于0.01%。由于微生物種類復雜及環(huán)境因素的影響，導致NPEOs代謝產(chǎn)物多樣，如短鏈NPEOs、NP、羧酸衍生物(烷基鏈末端被酸性氧化的CAPEs、EO鏈末端被酸性氧化的壬基酚聚氧乙烯酸NPECs、烷基鏈和EO鏈末端均被酸性氧化的CAPECs)等，難以在原有基礎上進一步降解或降解速率極低[8]。NPEOs的主要降解途徑：①末端羥基直接氧化，生成NPECs和/或CAPECs，無EO鏈減少或其他產(chǎn)物生成。②羥基非氧化位移逐步去除EO基，釋放乙醛，生成短鏈NPEOs[9]。③羥基氧化生成NPECs，脫去乙醛/乙醛酸，這種途徑多見于中短鏈NPEOs的降解。例如，Ensifersp.AS08和Pseudomonassp.AS90通過氧化末端EO基的方式降解NP1-4EO，但不能利用長鏈NPEOs(如NP10EO)[10]。需要指出的是，有機污染物的降解途徑及產(chǎn)物可能會隨環(huán)境變化而不同[11-12]。例如一些雌激素藥劑在無觀測效應濃度時會協(xié)同作用產(chǎn)生明顯的雌激素毒性[13]。Montgomery-Brown等[14]發(fā)現(xiàn)短鏈NPEOs在厭氧條件下被轉(zhuǎn)化成NPs，在好養(yǎng)條件下被氧化為NPECs。有研究則強調(diào)外源物質(zhì)對NPEOs降解產(chǎn)物的重要影響，甲醇、葡萄糖、酵母抽提物等有機物有助于EO鏈氧化，NP10EO只氧化生成NP10EC，隨后生成極難降解的CAPECs；但當無外加有機物時，NP10EO的主要產(chǎn)物為NP2EO和NP3EO[11]。Hotta等[15]發(fā)現(xiàn)，Mg2+和Ca2+存在的前提下，F(xiàn)e3+能夠顯著促進菌株BSN22降解OPEOs并提高OP1EC產(chǎn)物比例。諸多因素均可影響微生物對NPEOs的降解趨勢，這更加反映出NPEOs在原位環(huán)境中降解方式的復雜性。印染紡織廢水中經(jīng)常含有表面活性劑、金屬離子等成分，例如在染料中添加大量CuSO4用于固色，印花工藝中利用鉛作為著色劑，錳配合物用于棉針織物的雙氧水低溫浸漬催化漂白等[16]。據(jù)報道，NPEOs的質(zhì)量濃度可高達0.45～5.68 mg/L，經(jīng)生化處理后廢水雌激素活性顯著升高；NP為雌激素活性的關鍵致癌物，對廢水雌激素活性的平均貢獻率可達70%[17]。已往研究多針對NPEOs降解菌篩選、代謝途徑分析、雌激素毒性變化等方面，但鮮少關注常見金屬離子脅迫對微生物降解NPEOs的影響。本研究以前期篩選到的NPEOs高效降解菌Sphingomonassp. Y2為研究對象，重點解析了菌株Y2對不同金屬離子的耐受性及在金屬離子脅迫下NPEOs的代謝規(guī)律變化，以期為環(huán)境中APEOs類污染物降解及產(chǎn)物毒性評價提供理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 NPEOs高效降解菌Shingomonassp. Y2(GenBank No. KT957299)分離自污水處理廠，保存于上海市農(nóng)業(yè)科學院生態(tài)環(huán)境保護研究所菌保中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①重金屬培養(yǎng)基(TMM)(g/L)[18]：MOPS(pH=7.0)20 mmol/L，β-甘油磷酸 0.95 mmol/L，KCl 1.49，NH4Cl 1.07，Na2SO40.43，MgCl2·6H2O 0.2，NaCl 4.68，CaCl2·H2O 0.03，F(xiàn)e(Ⅲ)NH4·檸檬酸 0.005，微量元素1 mL，115 ℃滅菌30 min；②微量元素配方(mg/L)：25% HCl 10 mL，F(xiàn)eCl2·4H2O 1.5，CoCl2·6H2O 190，MnCl2·4H2O 100，ZnCl270，H3BO362，Na2MoO4·2H2O 36，NiCl2·6H2O 24，CuCl2·2H2O 17，115 ℃滅菌30 min；③0.5×LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物 2.5，胰蛋白胨5，NaCl 5，pH調(diào)至7.0～7.2，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 NPEOs(平均EO數(shù)目為9，CAS：9016-45-9，濃度約為10%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；金屬鹽CoCl2、ZnSO4、K2Cr2O7、CrCl3、NiCl2、CuSO4、CdCl2、HgCl2、MnCl2、Pb(NO3)2等，購自國藥集團藥業(yè)股份有限公司；有機溶劑(如三氯甲烷、乙酸乙酯、色譜級甲醇等)，購自天津四友有限公司。超凈工作臺(SW-CJ-1F，上海博迅)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(SKY-2012，上海蘇坤)；紫外可見分光光度計(T6，北京普析)；臺式離心機(3K15，默克SIGMA生物公司)；場發(fā)射掃描電鏡(SIRON，荷蘭FEI)；高效液相色譜(HPLC)儀(Waters1525，美國Waters)；氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS/MS)儀(Aglient7900，美國Aglient)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1300，東京理化)。

1.2 方法

1.2.1 菌株Sphingomonassp. Y2對不同金屬離子耐受性分析 ①菌株Y2在0.5×LB中對金屬離子的耐受性分析：設置1～1 000 mg/L(質(zhì)量分數(shù)，下同)不同梯度的Cd2+、Cr3+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Cr6+、Pb2+、Cu2+、Zn2+等金屬離子，按照1%(體積分數(shù)，下同)接種量接種活化好的目標菌株Y2于0.5×LB中。置于水平搖床200 r/min，30 ℃培養(yǎng)5 d。期間觀察菌株Y2生長情況，記錄不同金屬離子對菌株Y2的最低抑菌濃度(MIC)。MIC值越大，金屬離子對菌體的毒性越小，反之，對菌體的毒性越大。② 菌株Y2在TMM中對金屬離子的耐受性分析：金屬離子在營養(yǎng)培養(yǎng)基(0.5×LB)中可能會與其中的有機成分或磷酸根發(fā)生相互作用，導致真正發(fā)揮作用的金屬離子濃度低于添加濃度[18]。因此，進一步選擇TMM培養(yǎng)基進行金屬離子耐受性分析與驗證?；罨玫木闥2按1%接種量接種到TMM中，以葡萄糖為碳源，同時分別加入1～1 000 mg/L不同梯度的金屬離子Cd2+、Cr3+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Cr6+、Pb2+、Cu2+、Zn2+。置于水平搖床200 r/min，30 ℃培養(yǎng)5 d。期間觀察菌株Y2生長情況，記錄金屬離子在TMM中的MIC值。

1.2.2 菌株Y2在金屬離子脅迫下降解NPEOs分析 菌株Y2以1%接種量接種到TMM培養(yǎng)基中，NPEOs、Mn2+、Zn2+添加濃度分別為1 000、500、90 mg/L。實驗分組：無菌空白對照、無金屬離子添加、只添加Mn2+、只添加Zn2+、添加Mn2+和Zn2+。置于水平搖床200 r/min，30 ℃培養(yǎng)5 d。定時取樣測定菌株Y2于600 nm處的光密度值(OD600)。同時HPLC分析NPEOs降解情況。HPLC的分離柱為Eclipse C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，流動相為甲醇∶水=95∶5，流速1 mL/min，紫外檢測器波長 λ=225 nm，柱溫30 ℃。

1.2.3 金屬離子脅迫對菌株Y2細胞形態(tài)的影響 菌株Y2以1%接種量接種至TMM培養(yǎng)基中，其中碳源NPEOs質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，Mn2+質(zhì)量濃度為500 mg/L。置于水平搖床200 r/min，30 ℃培養(yǎng)2 d時收集菌體。具體操作步驟：7 000 r/min離心3～5 min，PBS緩沖液清洗3～5次，加入2.5%戊二醛后4 ℃固定過夜。PBS緩沖液再次清洗3次，加入1%鋨酸進行后固定。隨后用PBS緩沖液清洗3次，乙醇梯度脫水并用乙酸異戊酯置換2次。將樣品通過CO2臨界點干燥和真空噴金處理后，進行SEM觀察。

1.2.4 金屬離子對NPEOs降解產(chǎn)物的影響 將活化好的菌株Y2按1%接種量接種至TMM中，碳源NPEOs質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，Mn2+質(zhì)量濃度為500 mg/L。置于水平搖床200 r/min，30 ℃培養(yǎng)5 d。每12 h取樣，采用破壞性取樣法萃取NPEOs中間代謝產(chǎn)物。等體積三氯甲烷萃取2次后，HCl調(diào)節(jié)水相pH值至2.0～3.0，等體積乙酸乙酯再萃取1次。合并的有機相真空旋蒸，甲醇定容至5 mL，0.22 μm PVDF膜過濾至液相瓶中GC-MS/MS待測。GC-MS/MS程序：初始溫度80 ℃，10 ℃/min升至280 ℃維持5 min，檢測器溫度280 ℃。進樣量10 μL，不分流模式，氦氣流速1 mL/min，m/z 范圍40～600。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Y2對不同金屬離子的耐受性

由表1可知，培養(yǎng)基成分對細菌的金屬離子耐受性有顯著影響。在0.5×LB中，菌株Y2對Cr3+、Cu2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+均具有較高耐受性，MIC范圍為160～900 mg/L，對Cr6+最敏感(20 mg/L)。在TMM培養(yǎng)基中，則表現(xiàn)為對Cr3+、Co2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+的MIC值為12～500 mg/L；Cu2+和Ni2+僅3、6 mg/L即可明顯抑制菌株Y2生長。在營養(yǎng)培養(yǎng)基0.5×LB中表現(xiàn)的MIC普遍高于TMM，說明營養(yǎng)培養(yǎng)基中不同物質(zhì)間的相互作用導致了過高的MIC0.5×LB值[19]。在TMM培養(yǎng)條件下，菌株Y2對Mn2+、Zn2+有較高的耐受性(500、90 mg/L)。

表1 不同金屬離子對菌株Y2的MIC值(mg/L)Table 1 The MIC values of strain Y2 against different metal ions (mg/L)

2.2 金屬離子脅迫對菌株Y2降解NPEOs的影響

菌株Y2在TMM培養(yǎng)基中的生長與NPEOs降解呈良好的相關關系(圖1)，R2為0.944。無金屬離子脅迫條件下，菌株Y2生物量在2 d時快速達到最高值(OD600=1.28)，隨后下降，直至5 d時OD600僅為0.85。此外，NPEOs降解率在2 d時達到100.00%。菌株Y2在500 mg/L Mn2+脅迫條件下生長趨勢與對照相似，最大降解率及最大生物量較對照延后1 d(3 d時，OD600=1.28，降解率為100.00%)，表明菌株Y2可較好地耐受此濃度的金屬離子。但是在Zn2+、Mn2++Zn2+脅迫的培養(yǎng)基中菌株Y2生長被顯著抑制，說明90 mg/L Zn2+對菌株Y2的毒害作用顯著高于Mn2+。5 d時，Zn2+、Mn2++Zn2+處理組對NPEOs的降解率分別為20.62%、15.65%，可見兩種金屬離子共存的情況下毒性加強。

圖1 菌株Y2在Mn2+和Zn2+脅迫下降解NPEOs和生長情況(n=3)Fig.1 Performance of NPEOs biodegradation and growth curve of strain Y2 in presence of Mn2+ and/or Zn2+ ions(n=3)

2.3 金屬離子脅迫對菌株Y2細胞形態(tài)的影響

對微生物在復合污染脅迫下的細胞表面形態(tài)變化進行了分析，復合污染(NPEOs+Mn2+)顯著影響了菌株Y2的細胞超微結(jié)構(gòu)(圖2)。菌株Y2在僅有NPEOs條件下的形態(tài)，長0.5～1.1 μm，寬0.27～0.42 μm，桿狀，細胞整體完整且表面較光滑(圖2A)。但在NPEOs和Mn2+雙重脅迫下，菌株Y2細胞形貌變化較大，有的細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了中部塌陷，表面變得多褶皺甚至破損(圖2B、2C)。細胞形貌除了桿狀外，有的呈現(xiàn)不規(guī)則狀，有的則發(fā)生了聚集粘結(jié)，細胞長0.6～2.1 μm，寬0.25～0.47 μm。有研究指出，在錳氧化細菌胞外可觀察到無定形態(tài)生物氧化錳[20-21]；但本研究中菌株Y2菌體外層并未發(fā)現(xiàn)明顯的物質(zhì)膜包裹。

圖2 TMM中培養(yǎng)Sphingomonas sp. Y2的SEM圖Fig.2 SEM images of Sphingomonas sp. Y2 cultured in TMM唯一碳源為NPEOs。A：無金屬離子；B： Mn2+；C：Mn2+With NPEOs as the only carbon source. A：No metal ion stress in TMM； B：Mn2+ stress in TMM;C：Mn2+ stress in TMM

2.4 金屬離子對NPEOs降解產(chǎn)物的影響

已有研究表明，環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)及微量元素均可顯著影響污染物的降解速率、降解效果以及生態(tài)毒性[15]。菌株Y2降解NPEOs的代謝產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析表現(xiàn)為兩個主要流出峰，分別為產(chǎn)物a(保留時間為2.3～2.5 min)和產(chǎn)物b(保留時間為4.6 min)(圖3)。GC-MS/MS分析表明，產(chǎn)物a主要為短鏈NPECs(NP1EC、NP2EC)，產(chǎn)物b主要為短鏈NPEOs(NP、NP1EO、NP2EO、NP3EO)(圖4)。隨著培養(yǎng)時間的延長，短鏈NPEOs(產(chǎn)物b)可被氧化生成短鏈NPECs(產(chǎn)物a)。有趣的是，Mn2+脅迫顯著影響了產(chǎn)物a/b比例，在僅有NPEOs條件下，產(chǎn)物a/b比例由0.18增加至3.05，而在NPEOs和Mn2+復合污染條件下，產(chǎn)物a/b比例由0.14增加至0.68，說明Mn2+離子脅迫抑制/減緩了短鏈NPEOs的羧化反應，從而減少了羧酸化產(chǎn)物(即NPECs)的生成。

圖3 Sphingomonas sp. Y2降解NPEOs的代謝產(chǎn)物Fig.3 The metabolites of NPEOs biodegradation by Sphingomonas sp. Y2A：5 d時，無Mn2+脅迫NPEOs降解產(chǎn)物；B：5 d時，Mn2+脅迫下NPEOs降解產(chǎn)物A：The intermediates of NPEOs without metal ion stress at 5 d; B：The intermediates of NPEOs in presence of Mn2+ stress at 5 d

圖4 在TMM培養(yǎng)基中NPEOs降解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Fig.4 The mass spectra of the metabolites of NPEOs biodegradation in TMM

3 討 論

NPEOs在生活、農(nóng)業(yè)、印染工業(yè)中應用廣泛，也常用于去除水相、土壤中金屬離子[22]，因此研究金屬離子對NPEOs降解的影響十分必要。影響污染物生物降解的因素主要有微生物活性、基質(zhì)以及環(huán)境因子，其中環(huán)境因子主要包括外源添加物、溶解氧、金屬離子、溫度以及pH等。例如，Kamari等[23]發(fā)現(xiàn)Zn2+對殼聚糖生物降解的抑制作用明顯高于Cu2+和Pb2+。也有一些研究表明，金屬離子對低分子量多環(huán)芳烴(如蒽、菲)降解具有促進作用[24]。本研究通過營養(yǎng)培養(yǎng)基(0.5×LB)和重金屬培養(yǎng)基(TMM)發(fā)現(xiàn)Sphingomonassp. Y2對多種金屬離子具有耐受性，在TMM中對Cr3+、Co2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+的MIC為12～500 mg/L。500 mg/L Mn2+并未顯著影響NPEOs降解效率和菌株Y2生物量，只是將其最佳效果時間由2 d延長為3 d；但90 mg/L Zn2+則對菌株Y2生長和NPEOs代謝產(chǎn)生了顯著抑制，5 d時的降解效率僅為20.62%；當Mn2+和Zn2+聯(lián)合添加時，由于毒性增強導致NPEOs降解效率甚至不足16%，同時考慮到萃取效率、試驗操作誤差等因素，說明菌株Y2對Mn2+的耐受性顯著高于Zn2+。因此，菌株Y2應用于Mn2+/Zn2+污染廢水中去除NPEOs類污染物具有潛在價值。

金屬離子主要通過影響功能菌的生理機能和生態(tài)活動進而影響污染物的生物降解[25]。本研究以Mn2+為代表分析了金屬離子脅迫對菌株Y2細胞表面結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示Mn2+顯著改變了菌株Y2的形貌及大小(圖2)。推測細胞壁表面呈多孔狀的表面層官能團與金屬離子發(fā)生鍵合作用，使其表面結(jié)構(gòu)變得更加粗糙，加之細胞在溶液中因滲透作用等原因發(fā)生溶脹與塌陷，導致部分細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生破損[26]。Y2菌體聚集則是因為細胞自身分泌的一些物質(zhì)使得發(fā)生了黏連(圖2C)[27]。實際上，當菌株Y2培養(yǎng)在添加有Mn2+的0.5×LB中發(fā)現(xiàn)有褐色物質(zhì)產(chǎn)生，這是典型的氧化現(xiàn)象，與以往報道一致[28]。但是在NPEOs和Mn2+復合污染的情況下，并未在菌株Y2細胞表面發(fā)現(xiàn)錳氧化物膜，推測可能是由于無機鹽培養(yǎng)基中碳源單一，營養(yǎng)不足，導致氧化還原力受限[29]。微生物抵抗高濃度金屬離子的毒害，通常有以下機制：通過酶促或化學反應，將有毒物質(zhì)還原成無毒/低毒物質(zhì)；通過陽離子外流系統(tǒng)促進金屬離子外排；通過合成螯合物質(zhì)或結(jié)合因子將有毒金屬離子絡合成復合物[30]。例如，楊楠等[31]指出，菌株C14通過分泌大量胞外多糖(黏液多糖、莢膜多糖等)結(jié)合部分重金屬，從而提高其對重金屬的耐受性。Ralstoniasp. CH34有多種金屬離子抗性基因，同時存在于質(zhì)粒和基因組上[19]。本研究中并未涉及Sphingomonassp. Y2耐受多種金屬離子的分子機制研究，后續(xù)將結(jié)合菌株Y2表觀結(jié)構(gòu)動態(tài)監(jiān)測及基因組學、轉(zhuǎn)錄組學信息進行深入分析。

Mn2+可作為酶的輔基或激活劑參與生命代謝活動，在真菌代謝中報道較多。糙皮側(cè)耳中的漆酶和錳過氧化物酶活性隨Mn2+濃度增加呈現(xiàn)“先升后降”趨勢，而木質(zhì)素過氧化物酶則隨著Mn2+濃度增加而降低[32]。但本研究中，Mn2+是否影響了NPEOs代謝過程中關鍵酶活性有待進一步闡明。Mn2+雖然對NPEOs降解效率無顯著影響，但是明顯改變了代謝產(chǎn)物的組分組成(圖3～4)。Hotta等[15]發(fā)現(xiàn)，Mg2+、Ca2+、Fe3+則同時影響了OPEO的降解效率及產(chǎn)物組成。對于菲的降解，Pb2+和Cd2+表現(xiàn)出抑制作用，但只影響中間產(chǎn)物濃度，不影響其組分組成[33]。因此，推測本研究中，該現(xiàn)象可能與金屬離子及污染物本身特性有關。本研究中，在Mn2+脅迫下，更多的中間代謝產(chǎn)物以短鏈NPEOs(而非短鏈NPECs)形式存在，對照組中短鏈NPECs含量約為短鏈NPEOs的3.05倍。與此相反的是，Shibata等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+使得OPEOs降解菌PseudomonasputidaS-5積累生成更多的OPECs。OPECs、NPECs等羧酸化合物水溶性強，且更難降解，易釋放到地表水和地下水中并長期存在[35]。因此，根據(jù)目前結(jié)果推測，Mn2+傾向于減少水溶性更強、危害更大的短鏈NPECs的生成。本研究將為環(huán)境中表面活性劑類污染物的生物降解及代謝產(chǎn)物毒性評估提供參考，后續(xù)應進一步揭示菌株Y2耐受復合污染的潛在機理并加強微生物菌劑的研發(fā)與實踐應用。