吉 潔 馬志君 曹振東 邵雪齋 張玉娟(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院,承德 067000)
宮頸癌發(fā)病率、病死率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤均居首位[1]。據(jù)統(tǒng)計,全球每年宮頸癌新發(fā)病例高達50 萬例,占所有新發(fā)癌癥病例的5%,其中約85%發(fā)生在醫(yī)療資源相對匱乏的發(fā)展中國家[2]。盡管宮頸癌的預防、診斷和治療方法不斷改善,但晚期宮頸癌患者的預后仍然不佳,許多患者在手術(shù)切除、規(guī)范化的放化療后仍復發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。因此,研究宮頸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移的生物學機制具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是由20~25 個核苷酸組成的單鏈小分子RNA,其通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)結(jié)合來調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達。此外,miRNA 還可作為癌基因或抑癌基因,通過特定的靶點或信號通路參與胚胎發(fā)育、細胞分化、凋亡、耐藥性、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學過程[4-5]。近年研究顯示,miR-584 等miRNA 在宮頸癌中異常表達,表明miRNA 可能作為宮頸癌新的預后標志物或治療靶點[6]。miR-495-3p 是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,miR-495-3p 低表達與胃癌、透明細胞腎細胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)[7-8]。然而,miR-495-3p 在宮頸癌中的生物學作用尚未可知。miRNA 預測網(wǎng)站顯示白細胞介素6 受體(interleukin 6 receptor,IL-6R)基因是miR-495-3p 的潛在靶基因。既往研究表明胃癌細胞中IL-6R 表達上調(diào),IL-6R 高表達與臨床病理特征之間具有顯著的相關(guān)性[9]。IL-6R 高表達還可促進骨肉瘤細胞的增殖和遷移能力[10]。因此,本研究以IL-6R 為切入點,探討miR-495-3p 在宮頸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用,以期為宮頸癌臨床診療提供新的策略。
1.1 材料 人宮頸永生化細胞H8、宮頸癌細胞SiHa、HeLa、caski 購自中國科學院上海細胞庫;RPMI1640、MEM、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;RNeasy Mini Kits、第一鏈cDNA 合成試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix 購自大連TaKaRa 公司;Lipo?fectamine 2000、Taqman miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen 公司;細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)、細胞裂解液、聚偏氟乙烯膜購自上海碧云天公司;鼠源IL-6R 抗體、兔源細胞周期素D1(CyclinD1)、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallo?proteinase,MMP2)、MMP9 購自上海艾博抗公司;康寧Transwell 小室購自北京優(yōu)尼康生物公司;miR-495-3p模擬物(miR-495-3p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、IL-6R 小干擾RNA(si-IL-6R)及其陰性對照(si-NC)、IL-6R 過表達質(zhì)粒(pcDNA-IL-6R)及其陰性對照(pcDNA-NC)、野生型/突變型IL-6R 熒光素酶報告基因載體(WT/MUT-IL-6R)由上海吉瑪制藥公司提供。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) H8、SiHa、HeLa、caski細胞采用RPMI1640、MEM、DMEM 培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均補充10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素。當細胞密度達80%時,按 照1∶3 比例進 行傳代,2~3 d 換液1次。
1.2.2 RT-qPCR 檢 測miR-495-3p 和IL-6R mRNA表達 利用RNeasy Mini Kits從H8、HeLa、caski各組SiHa細胞中分離總RNA。使用Taqman miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA轉(zhuǎn)化為cDNA,使用第一鏈cDNA合成試劑盒將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用引物和SYBR Green PCR Master Mix 進 行RT-qPCR 擴 增。2-ΔΔCt法分析miR-495-3p(內(nèi)參為U6)、IL-6R mRNA(內(nèi)參為β-actin)的表達水平。miR-495-3p 正向引物序列5'-GCGGAAACAAACATGGTGCA-3',反向引物序列5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3';U6 正向引物序列5'-ACAGATCTGTCGGTGTGGCAC-3',反 向引物序列5'-GGCCCCGGATTATCCGACATTC-3';IL-6R 正向引物序列5'-AGTGTCGGGAGCAAGTTCAG-3',反向引物序列5'-TGGTCTGTGGAGAGA?AGCCT-3';β-actin 正向引物序列5'-CCAACCGC?GAGAAGATGA-3',反向引物序列5'-CCAGAGGCG?TACAGGGATAG-3'。
1.2.3 轉(zhuǎn)染和實驗分組 在細胞轉(zhuǎn)染前1天,將生長良好的SiHa細胞接種到6孔無血清培養(yǎng)基中。按照Lipofectamine2000 使用說明,當細胞融合度達到60%時進行轉(zhuǎn)染。將1 μl 的Lipofectamine2000 與24 μl無血清培養(yǎng)基混合。將50 pmol的待轉(zhuǎn)染物與適量無血清培養(yǎng)基混合,使總體積為25 μl。室溫下混合20 min。然后將混合物加入每個孔中進行培養(yǎng)。6 h 后更換培養(yǎng)基。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同分為miRNC 組、miR-495-3p 組、si-NC 組、si-IL-6R 組、miR-495-3p+pcDNA-NC組、miR-495-3p+pcDNA-IL-6R組。
1.2.4 CCK-8 實驗檢測細胞活力 將各組SiHa 細胞接種于96孔板,接種后48 h進行CCK-8測定。每孔添加10 μl CCK-8試劑,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h??瞻卓渍{(diào)零,采用酶標儀檢測450 nm 波長處吸光度(absorbance,A)值,計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=(A實驗組/A對照組)×100%。
1.2.5 Transwell實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移能力 轉(zhuǎn)染48 h,消化細胞并懸浮在無血清培養(yǎng)基中。細胞密度調(diào)整為2×106個/ml。將Transwell 小室放置在24 孔板中。在上室和下室分別加入200 μl的細胞懸浮液和500 μl 的含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)24 h 后,擦去上室內(nèi)細胞,用4%多聚甲醛固定細胞15 min,用結(jié)晶紫染色15 min。顯微鏡下隨機選擇5個視野進行細胞計數(shù),其均值為轉(zhuǎn)移細胞數(shù)。
1.2.6 Western blot 檢測IL-6R、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達 使用放射免疫沉淀分析裂解緩沖液提取細胞蛋白,并分析蛋白樣品濃度。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶封閉膜后,在4℃條件下與適當?shù)囊豢狗跤^夜。然后,用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育膜。以β-actin 為內(nèi)參,利用增強型化學發(fā)光檢測試劑盒進行顯色,凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白灰度值,以目的蛋白和β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對表達水平。
1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 合成含有與miR-495-3p 結(jié)合位點或結(jié)合位點突變序列的IL-6R 野生型序列(5'-UUCAAGUUUUUGUUUGUUUGUUU-3')或突變型序列(5'-UUCAAGUUUUUGUUGUCA?CUGAU-3'),將其克隆到pmirGIO 雙熒光素酶表達載體,分別命名為WT-IL-6R、MUT-IL-6R。利用Lipofectamine2000 將WT-IL-6R、MUT-IL-6R 分別與miR-495-3p mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染SiHa 細胞,48 h后,雙熒光素酶報告檢測系檢測各組細胞相對熒光素酶活性。
1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析,所有實驗均重復3 次,進行3 次獨立實驗,數(shù)據(jù)以表示。采用t檢驗評估兩組間差異;采用單因素方差分析評估多組間差異,進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 在宮頸癌細胞系miR-495-3p 和IL-6R 表達情況 與人宮頸永生化細胞H8 比較,宮頸癌細胞SiHa、HeLa、caski 中miR-495-3p 的表達降低,IL-6R mRNA和IL-6R蛋白的表達升高(P<0.05,圖1)。
圖1 在宮頸癌細胞系中miR-495-3p和IL-6R表達情況Fig.1 Expressions of miR-495-3p and IL-6R in cervical cancer cell lines
2.2 過表達miR-495-3p 對宮頸癌細胞SiHa 增殖和轉(zhuǎn)移的影響 與miR-NC 組比較,miR-495-3p 組SiHa 細胞miR-495-3p 的表達顯著升高,CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達顯著降低,細胞增殖率、轉(zhuǎn)移數(shù)降低(P<0.05,圖2)。
圖2 過表達miR-495-3p 對宮頸癌細胞SiHa 增殖和轉(zhuǎn)移的影響Fig.2 Effect of overexpression of miR-495-3p on prolifera?tion and metastasis of cervical cancer cells SiHa
2.3 干擾IL-6R 表達對宮頸癌細胞SiHa 增殖和轉(zhuǎn)移的影響 與si-NC 組比較,si-IL-6R 組SiHa 細胞IL-6R 蛋白表達顯著降低,CyclinD1、MMP2 和MMP9蛋白表達顯著降低,細胞增殖率、轉(zhuǎn)移數(shù)降低(P<0.05,圖3)。
圖3 過表達IL-6R對宮頸癌細胞SiHa增殖和轉(zhuǎn)移的影響Fig.3 Effects of overexpression of IL-6R on proliferation and metastasis of cervical cancer cells SiHa
2.4 miR-495-3p 靶向IL-6R Starbase 軟件在線預測顯示,miR-495-3p 與IL-6R 之間存在部分連續(xù)和互補的核苷酸序列,見圖4A。與miR-NC 和WT-IL-6R 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-495-3p 和WT-IL-6R 共轉(zhuǎn)染組SiHa 細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);而miR-495-3p 和MUT-IL-6R 共轉(zhuǎn)染組SiHa 細胞熒光素酶活較miR-NC 和MUT-IL-6R 共轉(zhuǎn)染組無顯著變化,見圖4B。miR-495-3p 組SiHa 細胞IL-6R 蛋白表達較miR-NC 組顯著降低;anti-miR-495-3p 組SiHa細胞IL-6R 蛋白表達較anti-miR-NC 組顯著升高(P<0.05,圖4C、D)。
圖4 miR-495-3p靶向調(diào)控IL-6R表達Fig.4 miR-495-3p targeted and regulates expression of IL-6R
2.5 過表達IL-6R 可以逆轉(zhuǎn)miR-495-3p 對SiHa 增殖和轉(zhuǎn)移的影響 與miR-495-3p+pcDNA-NC 組比較,miR-495-3p+pcDNA-IL-6R 組SiHa 細胞IL-6R、CyclinD1、MMP2、MMP9 表達增加,細胞增殖率、轉(zhuǎn)移數(shù)增加(P<0.05,圖5)。
圖5 過表達IL-6R 可以逆轉(zhuǎn)miR-495-3p 對SiHa 增殖和轉(zhuǎn)移的影響Fig.5 Overexpression of IL-6R could reverse effects of miR-495-3p on SiHa proliferation and metastasis
宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、多步驟的復雜過程。早期宮頸癌患者預后較好,而晚期宮頸腺癌由于局部復發(fā)和轉(zhuǎn)移擴散,治療幾乎無效[3]。因此,探討miR-495-3p 在宮頸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用,對開發(fā)新的治療策略,改善宮頸癌患者生存現(xiàn)狀意義重大。
近年來,miRNA 已成為腫瘤研究的熱點,尤其是在惡性腫瘤中。研究顯示miR-495-3p 在結(jié)腸癌中表達下調(diào),上調(diào)miR-495-3p 可誘導結(jié)腸癌細胞凋亡,抑制細胞周期進展[11]。miR-495-3p 在黑色素瘤中表達顯著降低,上調(diào)miR-495-3p 通過靶向E2F3可降低黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力[12]。此外,miR-495-3p 低表達還與胃癌細胞的增殖、侵襲、自噬以及多藥耐藥有關(guān)[13-14]。與上述研究結(jié)論一致,本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞中miR-495-3p 表達較宮頸永生化細胞H8 顯著降低,提示miR-495-3p 表達異??赡芘c宮頸癌發(fā)生有關(guān)。進一步功能分析顯示,過表達miR-495-3p后SiHa細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力顯著降低,促增殖蛋白CyclinD1、促轉(zhuǎn)移蛋白MMP2 和MMP9 表達顯著降低。以上研究表明miR-495-3p低表達可促進宮頸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
IL-6R 在多種人類疾病中的作用已被報道。BHARTI 等[15]研究發(fā)現(xiàn)臨床高侵襲性乳腺導管癌中IL-6R表達增加,下調(diào)IL-6R表達可增加單胺氧化酶A活性,抑制腫瘤血管生成和侵襲。WANG 等[16]報道m(xù)iR-21 通過靶向IL-6R 可抑制內(nèi)皮祖細胞的增殖、遷移和侵襲,靶向miR-21/IL-6R 通路有助于降低癌癥患者復雜靜脈血栓形成,促進血栓的溶解。JIANG 等[17]指出IL-6R 高表達是膠質(zhì)瘤患者生存不良的預測因子,下調(diào)IL-6R 可抑制細胞的增殖、侵襲和神經(jīng)球的形成,抑制體內(nèi)腫瘤的發(fā)生。邢兵等[18]研究表明,BRMS1 可抑制IL-6R 表達進而降低鼻咽癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。此外,IL-6R 高表達還與上皮性卵巢癌的化療耐藥有關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞中IL-6R 表達顯著增加,與miR-495-3p表達呈負相關(guān)。雙熒光素酶報告基因證實IL-6R 是miR-495-3p 的靶基因。在SiHa 細胞中過表達miR-495-3p 可抑制IL-6R 表達,抑制miR-495-3p 則促進IL-6R 表達。更重要的是抑制IL-6R 表達可降低CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達水平以及SiHa細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,而恢復實驗顯示過表達IL-6R 則逆轉(zhuǎn)miR-495-3p mimics 對SiHa 細胞增殖、轉(zhuǎn)移及其相關(guān)蛋白表達的影響。以上結(jié)果表明,miR-495-3p 低表達通過靶向IL-6R 可促進宮頸癌進展。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞中miR-495-3p表達降低,過表達miR-495-3p 通過靶向IL-6R 可抑制宮頸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。因此,上調(diào)miR-495-3p 可抑制宮頸癌的發(fā)展,為宮頸癌的靶向治療提供了新的策略。