吉 潔 馬志君 曹振東 邵雪齋 張玉娟（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，承德 067000）

宮頸癌發(fā)病率、病死率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤均居首位［1］。據(jù)統(tǒng)計，全球每年宮頸癌新發(fā)病例高達50 萬例，占所有新發(fā)癌癥病例的5%，其中約85%發(fā)生在醫(yī)療資源相對匱乏的發(fā)展中國家［2］。盡管宮頸癌的預防、診斷和治療方法不斷改善，但晚期宮頸癌患者的預后仍然不佳，許多患者在手術(shù)切除、規(guī)范化的放化療后仍復發(fā)和轉(zhuǎn)移［3］。因此，研究宮頸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移的生物學機制具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是由20～25 個核苷酸組成的單鏈小分子RNA，其通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）結(jié)合來調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達。此外，miRNA 還可作為癌基因或抑癌基因，通過特定的靶點或信號通路參與胚胎發(fā)育、細胞分化、凋亡、耐藥性、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學過程［4-5］。近年研究顯示，miR-584 等miRNA 在宮頸癌中異常表達，表明miRNA 可能作為宮頸癌新的預后標志物或治療靶點［6］。miR-495-3p 是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，miR-495-3p 低表達與胃癌、透明細胞腎細胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)［7-8］。然而，miR-495-3p 在宮頸癌中的生物學作用尚未可知。miRNA 預測網(wǎng)站顯示白細胞介素6 受體（interleukin 6 receptor，IL-6R）基因是miR-495-3p 的潛在靶基因。既往研究表明胃癌細胞中IL-6R 表達上調(diào)，IL-6R 高表達與臨床病理特征之間具有顯著的相關(guān)性［9］。IL-6R 高表達還可促進骨肉瘤細胞的增殖和遷移能力［10］。因此，本研究以IL-6R 為切入點，探討miR-495-3p 在宮頸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用，以期為宮頸癌臨床診療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸永生化細胞H8、宮頸癌細胞SiHa、HeLa、caski 購自中國科學院上海細胞庫；RPMI1640、MEM、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；RNeasy Mini Kits、第一鏈cDNA 合成試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix 購自大連TaKaRa 公司；Lipo?fectamine 2000、Taqman miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen 公司；細胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit 8，CCK-8）、細胞裂解液、聚偏氟乙烯膜購自上海碧云天公司；鼠源IL-6R 抗體、兔源細胞周期素D1（CyclinD1）、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallo?proteinase，MMP2）、MMP9 購自上海艾博抗公司；康寧Transwell 小室購自北京優(yōu)尼康生物公司；miR-495-3p模擬物（miR-495-3p mimics）及其陰性對照（miR-NC）、IL-6R 小干擾RNA（si-IL-6R）及其陰性對照（si-NC）、IL-6R 過表達質(zhì)粒（pcDNA-IL-6R）及其陰性對照（pcDNA-NC）、野生型/突變型IL-6R 熒光素酶報告基因載體（WT/MUT-IL-6R）由上海吉瑪制藥公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H8、SiHa、HeLa、caski細胞采用RPMI1640、MEM、DMEM 培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均補充10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素。當細胞密度達80%時，按 照1∶3 比例進 行傳代，2～3 d 換液1次。

1.2.2 RT-qPCR 檢 測miR-495-3p 和IL-6R mRNA表達 利用RNeasy Mini Kits從H8、HeLa、caski各組SiHa細胞中分離總RNA。使用Taqman miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA轉(zhuǎn)化為cDNA，使用第一鏈cDNA合成試劑盒將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用引物和SYBR Green PCR Master Mix 進 行RT-qPCR 擴 增。2-ΔΔCt法分析miR-495-3p（內(nèi)參為U6）、IL-6R mRNA（內(nèi)參為β-actin）的表達水平。miR-495-3p 正向引物序列5'-GCGGAAACAAACATGGTGCA-3'，反向引物序列5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6 正向引物序列5'-ACAGATCTGTCGGTGTGGCAC-3'，反 向引物序列5'-GGCCCCGGATTATCCGACATTC-3'；IL-6R 正向引物序列5'-AGTGTCGGGAGCAAGTTCAG-3'，反向引物序列5'-TGGTCTGTGGAGAGA?AGCCT-3'；β-actin 正向引物序列5'-CCAACCGC?GAGAAGATGA-3'，反向引物序列5'-CCAGAGGCG?TACAGGGATAG-3'。

1.2.3 轉(zhuǎn)染和實驗分組 在細胞轉(zhuǎn)染前1天，將生長良好的SiHa細胞接種到6孔無血清培養(yǎng)基中。按照Lipofectamine2000 使用說明，當細胞融合度達到60%時進行轉(zhuǎn)染。將1 μl 的Lipofectamine2000 與24 μl無血清培養(yǎng)基混合。將50 pmol的待轉(zhuǎn)染物與適量無血清培養(yǎng)基混合，使總體積為25 μl。室溫下混合20 min。然后將混合物加入每個孔中進行培養(yǎng)。6 h 后更換培養(yǎng)基。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同分為miRNC 組、miR-495-3p 組、si-NC 組、si-IL-6R 組、miR-495-3p+pcDNA-NC組、miR-495-3p+pcDNA-IL-6R組。

1.2.4 CCK-8 實驗檢測細胞活力 將各組SiHa 細胞接種于96孔板，接種后48 h進行CCK-8測定。每孔添加10 μl CCK-8試劑，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h?？瞻卓渍{(diào)零，采用酶標儀檢測450 nm 波長處吸光度（absorbance，A）值，計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=（A實驗組/A對照組）×100%。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移能力 轉(zhuǎn)染48 h，消化細胞并懸浮在無血清培養(yǎng)基中。細胞密度調(diào)整為2×106個/ml。將Transwell 小室放置在24 孔板中。在上室和下室分別加入200 μl的細胞懸浮液和500 μl 的含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)24 h 后，擦去上室內(nèi)細胞，用4%多聚甲醛固定細胞15 min，用結(jié)晶紫染色15 min。顯微鏡下隨機選擇5個視野進行細胞計數(shù)，其均值為轉(zhuǎn)移細胞數(shù)。

1.2.6 Western blot 檢測IL-6R、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達 使用放射免疫沉淀分析裂解緩沖液提取細胞蛋白，并分析蛋白樣品濃度。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶封閉膜后，在4℃條件下與適當?shù)囊豢狗跤^夜。然后，用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育膜。以β-actin 為內(nèi)參，利用增強型化學發(fā)光檢測試劑盒進行顯色，凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白灰度值，以目的蛋白和β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 合成含有與miR-495-3p 結(jié)合位點或結(jié)合位點突變序列的IL-6R 野生型序列（5'-UUCAAGUUUUUGUUUGUUUGUUU-3'）或突變型序列（5'-UUCAAGUUUUUGUUGUCA?CUGAU-3'），將其克隆到pmirGIO 雙熒光素酶表達載體，分別命名為WT-IL-6R、MUT-IL-6R。利用Lipofectamine2000 將WT-IL-6R、MUT-IL-6R 分別與miR-495-3p mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染SiHa 細胞，48 h后，雙熒光素酶報告檢測系檢測各組細胞相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗均重復3 次，進行3 次獨立實驗，數(shù)據(jù)以表示。采用t檢驗評估兩組間差異；采用單因素方差分析評估多組間差異，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 在宮頸癌細胞系miR-495-3p 和IL-6R 表達情況 與人宮頸永生化細胞H8 比較，宮頸癌細胞SiHa、HeLa、caski 中miR-495-3p 的表達降低，IL-6R mRNA和IL-6R蛋白的表達升高（P＜0.05，圖1）。

圖1 在宮頸癌細胞系中miR-495-3p和IL-6R表達情況Fig.1 Expressions of miR-495-3p and IL-6R in cervical cancer cell lines

2.2 過表達miR-495-3p 對宮頸癌細胞SiHa 增殖和轉(zhuǎn)移的影響 與miR-NC 組比較，miR-495-3p 組SiHa 細胞miR-495-3p 的表達顯著升高，CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達顯著降低，細胞增殖率、轉(zhuǎn)移數(shù)降低（P＜0.05，圖2）。

圖2 過表達miR-495-3p 對宮頸癌細胞SiHa 增殖和轉(zhuǎn)移的影響Fig.2 Effect of overexpression of miR-495-3p on prolifera?tion and metastasis of cervical cancer cells SiHa

2.3 干擾IL-6R 表達對宮頸癌細胞SiHa 增殖和轉(zhuǎn)移的影響 與si-NC 組比較，si-IL-6R 組SiHa 細胞IL-6R 蛋白表達顯著降低，CyclinD1、MMP2 和MMP9蛋白表達顯著降低，細胞增殖率、轉(zhuǎn)移數(shù)降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 過表達IL-6R對宮頸癌細胞SiHa增殖和轉(zhuǎn)移的影響Fig.3 Effects of overexpression of IL-6R on proliferation and metastasis of cervical cancer cells SiHa

2.4 miR-495-3p 靶向IL-6R Starbase 軟件在線預測顯示，miR-495-3p 與IL-6R 之間存在部分連續(xù)和互補的核苷酸序列，見圖4A。與miR-NC 和WT-IL-6R 共轉(zhuǎn)染組比較，miR-495-3p 和WT-IL-6R 共轉(zhuǎn)染組SiHa 細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而miR-495-3p 和MUT-IL-6R 共轉(zhuǎn)染組SiHa 細胞熒光素酶活較miR-NC 和MUT-IL-6R 共轉(zhuǎn)染組無顯著變化，見圖4B。miR-495-3p 組SiHa 細胞IL-6R 蛋白表達較miR-NC 組顯著降低；anti-miR-495-3p 組SiHa細胞IL-6R 蛋白表達較anti-miR-NC 組顯著升高（P＜0.05，圖4C、D）。

圖4 miR-495-3p靶向調(diào)控IL-6R表達Fig.4 miR-495-3p targeted and regulates expression of IL-6R

2.5 過表達IL-6R 可以逆轉(zhuǎn)miR-495-3p 對SiHa 增殖和轉(zhuǎn)移的影響 與miR-495-3p+pcDNA-NC 組比較，miR-495-3p+pcDNA-IL-6R 組SiHa 細胞IL-6R、CyclinD1、MMP2、MMP9 表達增加，細胞增殖率、轉(zhuǎn)移數(shù)增加（P＜0.05，圖5）。

圖5 過表達IL-6R 可以逆轉(zhuǎn)miR-495-3p 對SiHa 增殖和轉(zhuǎn)移的影響Fig.5 Overexpression of IL-6R could reverse effects of miR-495-3p on SiHa proliferation and metastasis

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、多步驟的復雜過程。早期宮頸癌患者預后較好，而晚期宮頸腺癌由于局部復發(fā)和轉(zhuǎn)移擴散，治療幾乎無效［3］。因此，探討miR-495-3p 在宮頸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用，對開發(fā)新的治療策略，改善宮頸癌患者生存現(xiàn)狀意義重大。

近年來，miRNA 已成為腫瘤研究的熱點，尤其是在惡性腫瘤中。研究顯示miR-495-3p 在結(jié)腸癌中表達下調(diào)，上調(diào)miR-495-3p 可誘導結(jié)腸癌細胞凋亡，抑制細胞周期進展［11］。miR-495-3p 在黑色素瘤中表達顯著降低，上調(diào)miR-495-3p 通過靶向E2F3可降低黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力［12］。此外，miR-495-3p 低表達還與胃癌細胞的增殖、侵襲、自噬以及多藥耐藥有關(guān)［13-14］。與上述研究結(jié)論一致，本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞中miR-495-3p 表達較宮頸永生化細胞H8 顯著降低，提示miR-495-3p 表達異?？赡芘c宮頸癌發(fā)生有關(guān)。進一步功能分析顯示，過表達miR-495-3p后SiHa細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力顯著降低，促增殖蛋白CyclinD1、促轉(zhuǎn)移蛋白MMP2 和MMP9 表達顯著降低。以上研究表明miR-495-3p低表達可促進宮頸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

IL-6R 在多種人類疾病中的作用已被報道。BHARTI 等［15］研究發(fā)現(xiàn)臨床高侵襲性乳腺導管癌中IL-6R表達增加，下調(diào)IL-6R表達可增加單胺氧化酶A活性，抑制腫瘤血管生成和侵襲。WANG 等［16］報道m(xù)iR-21 通過靶向IL-6R 可抑制內(nèi)皮祖細胞的增殖、遷移和侵襲，靶向miR-21/IL-6R 通路有助于降低癌癥患者復雜靜脈血栓形成，促進血栓的溶解。JIANG 等［17］指出IL-6R 高表達是膠質(zhì)瘤患者生存不良的預測因子，下調(diào)IL-6R 可抑制細胞的增殖、侵襲和神經(jīng)球的形成，抑制體內(nèi)腫瘤的發(fā)生。邢兵等［18］研究表明，BRMS1 可抑制IL-6R 表達進而降低鼻咽癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。此外，IL-6R 高表達還與上皮性卵巢癌的化療耐藥有關(guān)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞中IL-6R 表達顯著增加，與miR-495-3p表達呈負相關(guān)。雙熒光素酶報告基因證實IL-6R 是miR-495-3p 的靶基因。在SiHa 細胞中過表達miR-495-3p 可抑制IL-6R 表達，抑制miR-495-3p 則促進IL-6R 表達。更重要的是抑制IL-6R 表達可降低CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達水平以及SiHa細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，而恢復實驗顯示過表達IL-6R 則逆轉(zhuǎn)miR-495-3p mimics 對SiHa 細胞增殖、轉(zhuǎn)移及其相關(guān)蛋白表達的影響。以上結(jié)果表明，miR-495-3p 低表達通過靶向IL-6R 可促進宮頸癌進展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞中miR-495-3p表達降低，過表達miR-495-3p 通過靶向IL-6R 可抑制宮頸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。因此，上調(diào)miR-495-3p 可抑制宮頸癌的發(fā)展，為宮頸癌的靶向治療提供了新的策略。