劉延霞 楊 青 王紅怡 林則彬 汪婧怡（海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院兒科，海口 571100）

小兒類風濕關節(jié)炎（juvenile rheumatoid arthritis，JRA）是小兒時期常見的以關節(jié)滑膜炎癥為主的全身性結締組織病，是小兒致殘的重要原因，其病因尚未完全明確［1］?；こ衫w維細胞是類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）炎性增生滑膜中的主要細胞類型，滑膜成纖維細胞活化后，其增殖、遷移及侵蝕能力增強，可侵蝕關節(jié)軟骨和骨組織，導致受累關節(jié)組織結構破壞和功能障礙，因此，抑制滑膜成纖維細胞異常增殖、遷移和侵襲對防治RA 具有重要意義［2］。lncRNA 可通過影響滑膜成纖維細胞增殖、遷移及侵襲等參與類風濕關節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明LINC01419在胃癌、肺腺癌細胞中表達水平升高，抑制其表達可抑制細胞生長及轉移［3-5］。然而LINC01419對小兒類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制尚不清楚。研究報道類風濕關節(jié)炎患者滑膜組織中miR-320a 的表達水平低于健康人，miR-320a 高表達可抑制滑膜成纖維細胞的增殖并促進其凋亡［6］。miR-320a上調(diào)可抑制類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞的激活、遷移和侵襲［7］。因此，本實驗旨在研究LINC01419 對小兒類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制是否與miR-320a有關。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 取2017 年1 月至2019 年12 月本院收治的21 例小兒類風濕關節(jié)炎患者的滑膜組織，其中男13 例，女8 例，年齡4～13 歲；類風濕關節(jié)炎患者的診斷根據(jù)1987 年美國風濕病協(xié)會修訂的標準。取21 例因骨折或創(chuàng)傷截肢者的膝關節(jié)正常滑膜組織作為對照，其中男14 例，女7 例，年齡5～16歲；所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑 胎牛血清、DEME 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司；Trizol 試劑、cDNA 合成試劑盒、RT-qPCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司；MTT 試劑盒、RIPA 蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell 小室、Matrigel 購自美國BD 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)JRA 滑膜成纖維細胞（RASFs）取小兒類風濕關節(jié)炎患者滑膜組織標本，用PBS 沖洗干凈，無菌條件下剪碎用胰蛋白酶于37℃充分消化，200 目篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min 離心5 min，離心半徑10 cm，收集細胞，加入含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取3～6 代細胞用于實驗。

1.2.2 細胞處理與分組 將si-NC、si-LINC01419、pcDNA、pcDNA-LINC01419、miR-NC、miR-320a 轉染至RASFs 中，記為si-NC 組、si-LINC01419 組、pcDNA組、pcDNA-LINC01419 組、miR-NC 組、miR-320a 組；將si-LINC01419 分別與anti-miR-NC、anti-miR-320a共轉染至RASFs 中，記為si-LINC01419+anti-miRNC組、si-LINC01419+anti-miR-320a組。

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測LINC01419 和miR-320a 表達水平 提取細胞總RNA，合成cDNA，按照試劑盒說明進行PCR，PCR反應體系：2 μl 反轉錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl 無菌水；循環(huán)條件為95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共40 個循環(huán)；相對表達量用2-ΔΔCt法計算。LINC01419和miR-320a分別以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，LINC01419 正向引物序 列：5'-AGAACTGAGGTCCACTTTCTGG-3'，反 向引物序列：5'-GGTCCTTTGTCTGCAACGA-3'；GAPDH正向引物序列：5'-CATCCTGGGCTACACTGAGC-3'，反向引物序列：5'-AGTGGTCGTTGAGGGCAA-3'；miR-320a 正向引物序列：5'-GGGCTAAAAGCT?GGGTTGA-3'，反向引物序列：5'-CAGTGCGTGTC?GTGGAGT-3'；U6 正向引物序列：5'-GCTTCGGCAG?CACATATACT-3'，反向引物序列：5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 MTT 檢測細胞增殖活性 在各組細胞培養(yǎng)至48 h 時，每孔分別加入20 μl 的MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，加入DMSO 150 μl，振蕩10 min使沉淀溶解，用酶標儀于波長490 nm 處檢測吸光度（OD）值。

1.2.5 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲 收集各組細胞，取200 μl接種于Transwell小室上室，培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照并計數(shù)發(fā)生遷移的細胞數(shù)量。細胞侵襲實驗在Transwell 小室上室加入50 μl 基質(zhì)膠Matrigel，凝固后接種細胞，之后同細胞遷移操作。

1.2.6 Western blot 法檢測CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9 蛋白表達 提取細胞總蛋白，用BCA 試劑盒定量；進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應的一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，用Quantity One 軟件測定各組蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH 條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.2.7 熒光素酶報告實驗檢測LINC01419 和miR-320a 的靶向關系 構建LINC01419 野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-LINC01419 和MUT-LINC01419，用LipofectamineTM2000 將其分別與miR-NC 和miR-320a 共轉染至RASFs 中，按照說明書檢測細胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析 用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。細胞實驗重復3 次，每組設置3 個復孔，即n=9。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LINC01419 和miR-320a 在JRA 患者滑膜組織中的表達 與Con 組比較，RA 患者滑膜組織中LINC01419 表達水平升高，miR-320a 表達水平降低（P＜0.05），見表1。

表1 LINC01419 和miR-320a 在JRA 患者滑膜組織中的表達（，n=21）Tab.1 Expression of LINC01419 and miR-320a in synovial tissue of JRA（，n=21）

表1 LINC01419 和miR-320a 在JRA 患者滑膜組織中的表達（，n=21）Tab.1 Expression of LINC01419 and miR-320a in synovial tissue of JRA（，n=21）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05.

2.2 抑制LINC01419 表達對JRA 滑膜成纖維細胞增殖的影響 與si-NC 組比較，si-LINC01419 組LINC01419 表達水平降低，細胞活性降低，CyclinD1表達水平降低，p21 表達水平升高（P＜0.05），見圖1和表2。

表2 抑制LINC01419 表達對JRA 滑膜成纖維細胞增殖的影響（，n=9）Tab.2 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表2 抑制LINC01419 表達對JRA 滑膜成纖維細胞增殖的影響（，n=9）Tab.2 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

圖1 增殖相關蛋白表達Fig.1 Expressions of proliferation-related proteins

2.3 抑制LINC01419 表達對JRA 滑膜成纖維細胞遷移和侵襲的影響 與si-NC 組比較，si-LINC01419組遷移和侵襲細胞數(shù)降低，MMP-2、MMP-9 表達水平降低（P＜0.05），見圖2和表3。

表3 抑制LINC01419 表達對JRA 滑膜成纖維細胞遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表3 抑制LINC01419 表達對JRA 滑膜成纖維細胞遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting expression of LINC01419 on migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

圖2 遷移和侵襲相關蛋白表達Fig.2 Expressions of migration and invasion-related proteins

2.4 LINC01419 靶向調(diào)控miR-320a 的表達 Lnc?Base Predicted v.2 預測顯示LINC01419 的序列中含有與miR-320a互補的核苷酸序列（圖3）。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-NC 組比較，miR-320a組轉染W(wǎng)T-LINC01419 的細胞熒光素酶活性降低（P＜0.05），而轉染MUT-LINC01419的細胞熒光素酶活性無顯著變化（表4）。與pcDNA 組比較，pcDNALINC01419 組miR-320a 表達水平降低，與si-NC 組比較，si-LINC01419 組miR-320a 表達水平升高（P＜0.05，表5）。

表4 雙熒光素酶報告實驗（，n=9）Tab.4 Dual luciferase report experiment（，n=9）

表4 雙熒光素酶報告實驗（，n=9）Tab.4 Dual luciferase report experiment（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

表5 LINC01419調(diào)控miR-320a的表達（，n=9）Tab.5 LINC01419 regulates expression of miR-320a（，n=9）

表5 LINC01419調(diào)控miR-320a的表達（，n=9）Tab.5 LINC01419 regulates expression of miR-320a（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with si-NC group，2）P＜0.05.

圖3 LINC01419 的序列中含有與miR-320a 互補的核苷酸序列Fig.3 Sequence of LINC01419 contains a nucleotide sequence complementary to miR-320a

2.5 miR-320a 過表達對JRA 滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC 組比較，miR-320a 組miR-320a 表達水平升高，細胞活性降低，遷移和侵襲細胞數(shù)降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平降低，p21表達水平升高（P＜0.05），見圖4和表6。

表6 miR-320a過表達對JRA滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.6 Effect of miR-320a overexpression on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表6 miR-320a過表達對JRA滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.6 Effect of miR-320a overexpression on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

圖4 miR-320a 過表達后JRA 滑膜成纖維細胞增殖、遷移及侵襲相關蛋白表達Fig.4 Proliferation，migration and invasion related pro?tein expression of synovial formation in JRA after miR-320a overexpression

2.6 干擾miR-320a表達逆轉了抑制LINC01419表達對JRA滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲的作用與si-LINC01419+anti-miR-NC組比較，si-LINC01419+anti-miR-320a 組miR-320a 表達水平降低，細胞活性升高，遷移和侵襲細胞數(shù)升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平升高，p21表達水平降低（P＜0.05），見圖5、表7。

圖5 增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達Fig.5 Expressions of proteins related to proliferation，migration and invasion

表7 干擾miR-320a表達逆轉了抑制LINC01419表達對JRA滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲的作用（，n=9）Tab.7 Interference with miR-320a expression reversed effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

表7 干擾miR-320a表達逆轉了抑制LINC01419表達對JRA滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲的作用（，n=9）Tab.7 Interference with miR-320a expression reversed effect of inhibiting expression of LINC01419 on proliferation，migration and invasion of synovial fibroblasts in JRA（，n=9）

Note：Compared with si-LINC01419+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

3 討論

小兒類風濕性關節(jié)炎是兒童常見風濕性疾病，嚴重影響患兒身體健康。類風濕關節(jié)炎以滑膜組織增生、間質(zhì)炎癥細胞浸潤及軟骨和骨組織的破壞等為主要病理特征，研究表明成纖維樣滑膜細胞的異常激活在其發(fā)生、發(fā)展中起關鍵作用；靶向成纖維樣滑膜細胞的研究可為有效治療RA 提供新思路［8-9］。研究報道LINC01419 在肝癌組織及其細胞系中上調(diào)表達，促進肝癌細胞的生長和遷移［10］。LINC01419 介導miR-519a-3p/PDRG1 軸，促進骨肉瘤細胞增殖及侵襲［11］。本實驗結果顯示，小兒類風濕關節(jié)炎患者滑膜組織中LINC01419 表達水平升高；抑制LINC01419 表達，滑膜成纖維細胞活性降低，遷移和侵襲細胞數(shù)降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達水平降低，p21 表達水平升高；表明抑制LINC01419 表達可抑制滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲。

研究表明，miRNA 在類風濕關節(jié)炎滑膜細胞異常增殖的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［12］。已有研究表明上調(diào)miR-320a 可抑制類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞的激活、遷移和侵襲［7］。還有研究報道塞來昔布治療后膝骨關節(jié)炎患者miR-320a 表達水平升高［13］。miR-320a 的過表達可能增強白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導的軟骨降解因子［14］。miR-320a 通過調(diào)節(jié)軟骨細胞中BMI-1 和runt相關基因2（RUNX2）的表達來預防骨關節(jié)炎軟骨退化［15］。以上研究表明miR-320a 不僅影響類風濕關節(jié)炎，還影響骨關節(jié)炎的進展。此外，癌癥相關的成纖維細胞中miR-320a 過表達可抑制肝癌細胞增殖、遷移和轉移［16］。本實驗結果顯示，小兒類風濕關節(jié)炎患者滑膜組織中miR-320a 表達水平降低；過表達miR-320a 抑制了小兒類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲；與MENG 等［7］研究結果一致。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，LINC01419 靶向調(diào)控miR-320a的表達；且干擾miR-320a 表達逆轉了抑制LINC01419表達對小兒類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，抑制LINC01419 表達可能通過靶向上調(diào)miR-320a 抑制小兒類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移和侵襲。