徐 飛，馮繼偉，李 鵬，孟玉嬌，陳玉明，王龍康，王寅彪

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

流行性乙型腦炎是由流行性乙型腦炎病毒(epidemic encephalitis B virus，EEBV)感染引起的一種經(jīng)蚊蟲(chóng)傳播的急性人畜共患病[1],在我國(guó)流行性乙型腦炎發(fā)病率為(2～10)/10萬(wàn)，其臨床表現(xiàn)以頭痛、高熱、嘔吐、意識(shí)障礙、呼吸衰竭等中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀為主要特征，病死率較高[2-3]。近年來(lái)，隨著疫苗的廣泛使用，流行性乙型腦炎在我國(guó)的整體發(fā)病率有所下降，但其在西南部農(nóng)村地區(qū)的發(fā)病率仍然較高，是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[4]。開(kāi)展大規(guī)?？贵w篩查以確定人群感染和免疫情況,對(duì)于防控流行性乙型腦炎具有重要意義。本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了EEBV的囊膜(envelope，E)蛋白，并通過(guò)免疫印跡(Western blot)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及免疫熒光分析(immunofluorescence assay，IFA)對(duì)E蛋白的免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，旨在為建立診斷EEBV感染的免疫學(xué)檢測(cè)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物3只健康雌性新西蘭大白兔購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均以正常飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)同意(倫理審查批件號(hào)：XYLL-2020018)。

1.2 病毒、質(zhì)粒與細(xì)胞株EEBV病毒株SA14-14-2、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(baby hamster kidney cell line，BHK)-21、載有E蛋白基因片段(1～1 248堿基對(duì))的pET32a-E質(zhì)粒由河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.3 主要試劑與儀器抗EEBV單克隆抗體由河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，氨芐青霉素購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)(nickel-charged nitrilotriacetic acid，Ni-NTA)購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)購(gòu)自德國(guó)Merck公司，化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測(cè)試劑盒、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、山羊抗小鼠IgG及異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.4 EEBV E蛋白生物化學(xué)特性分析利用DNAStar軟件中的蛋白質(zhì)序列分析模塊(Protean)分析E蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性、親水性等生物化學(xué)特性。

1.5 pET32a-E質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在冰浴中緩慢融解大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(100 μL)，待細(xì)胞完全融解后，向其中加入1 μL pET32a-E質(zhì)粒(10 mg·L-1),輕輕用手指彈動(dòng)離心管以混勻細(xì)菌和質(zhì)粒，在冰浴中靜置30 min后，將離心管置于42 ℃水浴熱激90 s，然后快速將離心管轉(zhuǎn)入冰浴中靜置10 min，向離心管中加入900 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)2 h，5 000 r·min-1離心5 min，棄去800 μL上清。之后，使用剩余培養(yǎng)基重懸管底的菌體沉淀并將重懸液加至含50 mg·L-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基固體平板上，使用無(wú)菌彎頭玻璃棒輕輕將細(xì)胞均勻涂開(kāi)，然后將平板倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，次日，挑取單一菌落，于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)后，進(jìn)行E蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.6 EEBV E蛋白表達(dá)與純化將10 mL轉(zhuǎn)化有pET32a-E質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞接種于1 L含50 mg·L-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、250 r·min-1搖床搖菌3～4 h，待菌液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度(absorbancy，A)值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，取2 mL菌液作為未誘導(dǎo)對(duì)照。向剩余菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1，于37 ℃、250 r·min-1搖床搖菌8 h，取2 mL菌液作為誘導(dǎo)對(duì)照；然后，6 000 r·min-1離心20 min，收集菌體沉淀，以1/10菌液體積的10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液重懸沉淀，于冰浴中超聲裂解。9 000 r·min-1離心20 min，收集沉淀并使用變性結(jié)合緩沖液(100 mmol·L-1NaH2PO4、10 mmol·L-1Tris-HCl、8 mol·L-1尿素，pH 8.0)溶解沉淀；之后，在變性條件下采用Ni-NTA親和層析法純化重組E蛋白：首先，使用2 mL變性結(jié)合緩沖液平衡Ni-NTA親和層析柱，然后將2 mL變性樣品加入層析柱，使E蛋白與Ni-NTA介質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合，再以8倍柱床體積的變性洗滌緩沖液(100 mmol·L-1NaH2PO4、10 mmol·L-1Tris-HCl、8 mol·L-1尿素，pH 6.3)洗滌層析柱，最后以3倍柱床體積的變性洗脫緩沖液(100 mmol·L-1NaH2PO4、10 mmol·L-1Tris-HCl、8 mol·L-1尿素，pH 4.5)洗脫目的蛋白，收集各組分進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測(cè)蛋白純度。之后，將變性蛋白液裝入透析袋并依次置于含7、6、4、2、1、0 mmol·L-1尿素的復(fù)性緩沖液(100 mmol·L-1NaH2PO4、10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)中，于4 ℃下進(jìn)行透析復(fù)性。在每種緩沖液中透析4 h，最后以9 000 r·min-1離心10 min，收集上清，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western blot法檢測(cè)重組E蛋白的生物活性將按上述方法培養(yǎng)收集的未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)菌體沉淀按1/10菌液體積的比例重懸于Tris-HCl緩沖液中，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。之后，通過(guò)半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，將PVDF膜置于50 g·L-1的脫脂奶中，37 ℃封閉1 h，使用含體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline containing Tween-20，PBST)洗滌3次后，加入抗EEBV單抗，37 ℃反應(yīng)1 h，使用PBST洗滌6次后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG于37 ℃下反應(yīng)1 h。同上洗滌后，加入ECL試劑進(jìn)行顯影，在預(yù)測(cè)的相對(duì)分子質(zhì)量處觀察蛋白條帶，確定其與抗EEBV單抗的反應(yīng)性。

1.8 EEBV E蛋白兔抗血清的制備和鑒定

1.8.1 EEBV E蛋白兔抗血清的制備取體質(zhì)量約2.5 kg的新西蘭大白兔，免疫前3 d經(jīng)耳緣靜脈采血制備陰性對(duì)照兔血清。首次免疫時(shí)，將200 μg復(fù)性后的E蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化，以1.0 mL的劑量進(jìn)行皮內(nèi)及皮下注射免疫；再次免疫時(shí)使用相同劑量的E蛋白與弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，同上注射免疫。后續(xù)免疫均使用弗氏不完全佐劑乳化E蛋白，以4周作為免疫間隔共進(jìn)行4次免疫后，經(jīng)耳緣靜脈采血1.0 mL，采用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，采用IFA法檢測(cè)兔抗血清與EEBV的反應(yīng)性。之后進(jìn)行心臟采血，4 000 r·min-1離心20 min，收集血清，-80 ℃保存。

1.8.2 ELISA法測(cè)定兔抗血清抗體效價(jià)使用碳酸鹽緩沖溶液(pH 9.6)在4 ℃條件下過(guò)夜，將E蛋白包被于ELISA反應(yīng)孔，次日以PBST洗滌3次后，每孔加滿50 g·L-1脫脂奶，37 ℃作用2 h，然后以二倍稀釋法稀釋E蛋白兔抗血清和陰性兔血清并加入反應(yīng)孔，于37 ℃下反應(yīng)30 min。PBST洗滌6次，每孔加入110 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，于37 ℃下反應(yīng)30 min。同上洗滌后，加入TMB顯色5 min，以2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)并使用酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。每組樣品設(shè)立3個(gè)重復(fù)，以樣品A450平均值與陰性對(duì)照A450平均值的比值≥2.2作為陽(yáng)性反應(yīng)判定依據(jù)，兔抗血清的效價(jià)為給出陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度的倒數(shù)。

1.8.3 IFA法檢測(cè)兔抗血清與EEBV的反應(yīng)性在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞至匯合度為80%～90%時(shí)，接種EEBV SA14-14-2，感染24 h；同時(shí)預(yù)留未接種EEBV的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，作為未感染對(duì)照。利用預(yù)冷的無(wú)水乙醇(含體積分?jǐn)?shù) 1%～2% H2O2)室溫固定15 min，每孔加滿50 g·L-1的脫脂奶，37 ℃封閉1 h，PBST洗滌3次后，加入11 000稀釋的抗EEBV單抗或E蛋白兔抗血清，37 ℃反應(yīng)1 h，然后以PBST洗滌6次，向各孔加入1500稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG或FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌6次后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，出現(xiàn)綠色熒光點(diǎn)時(shí)說(shuō)明抗EEBV單抗或E蛋白兔抗血清與EEBV發(fā)生了特異反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 EEBV E蛋白的生物化學(xué)特性結(jié)果見(jiàn)圖1。DNAStar軟件分析表明，E蛋白具有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)，含有較多的α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)，絕大部分區(qū)域的抗原指數(shù)較高，親水性較強(qiáng)，抗原指數(shù)高低與親水性強(qiáng)弱具有較高一致性。

圖1 EEBV E蛋白的生物化學(xué)特性

2.2 重組E蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖2。SDS-PAGE鑒定顯示，與未誘導(dǎo)對(duì)照組相比，IPTG誘導(dǎo)組在相對(duì)分子質(zhì)量約 53 000處出現(xiàn)了清晰的特異性條帶，與預(yù)測(cè)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量一致，蛋白經(jīng)變性純化后，純度較高。復(fù)性后，從1 L培養(yǎng)物獲得了23.8 mg E蛋白。

M：預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET32a-E未誘導(dǎo)；2：pET32a-E誘導(dǎo)；3、4:純化后的E蛋白。

2.3 E蛋白生物活性檢測(cè)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖3。未誘導(dǎo)組菌液與抗EEBV單抗的反應(yīng)未出現(xiàn)任何條帶，誘導(dǎo)組菌液與抗EEBV單抗反應(yīng)時(shí)，在相對(duì)分子質(zhì)量 53 000處出現(xiàn)了特異性條帶，表明抗EEBV單抗與重組E蛋白發(fā)生了特異性反應(yīng)。

M：預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET32a-E誘導(dǎo)；2：pET32a-E未誘導(dǎo)。

2.4 E蛋白兔抗血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖4。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性兔血清不與E蛋白發(fā)生反應(yīng)，制備的兔抗血清能與E蛋白在體外發(fā)生特異性結(jié)合，抗體效價(jià)高達(dá)1×51 200。

圖4 ELISA法測(cè)定兔抗血清抗體效價(jià)

2.5 兔抗血清與EEBV反應(yīng)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖5?？笶EBV單抗能與EEBV感染的BHK-21細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，不與未接種病毒的細(xì)胞反應(yīng)。同時(shí)，兔抗血清能與EEBV感染的BHK-21細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，呈現(xiàn)特異性綠色熒光信號(hào)，不與未接毒的細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。

A：抗EEBV單抗與接種EEBV病毒的BHK-21細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)；B：抗EEBV單抗與正常BHK-21細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)；C：兔抗血清與接種EEBV病毒的BHK-21細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)；D：兔抗血清與正常BHK-21細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)。

3 討論

流行性乙型腦炎主要分布于東亞、東南亞及太平洋西部地區(qū)，每年有5萬(wàn)～10萬(wàn)人發(fā)病[5]。目前，流行性乙型腦炎仍是我國(guó)發(fā)病率較高、分布較廣、危害較重的蚊媒疾病之一，嚴(yán)重威脅人體健康[3]。當(dāng)前尚無(wú)治療流行性乙型腦炎的特異性藥物，除了控制蚊蟲(chóng)媒介外，疫苗免疫是防控流行性乙型腦炎最有效的手段[6-7]。隨著流行性乙型腦炎疫苗納入我國(guó)國(guó)家免疫規(guī)劃，兒童流行性乙型腦炎發(fā)病率持續(xù)下降；但2014～2018年監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，40歲以上成人流行性乙型腦炎病例構(gòu)成比由14.45%上升至64.04%[8-9]。鑒于此，開(kāi)展健康人群尤其是高發(fā)地區(qū)成人群體的流行性乙型腦炎抗體水平監(jiān)測(cè)，對(duì)流行性乙型腦炎防控至關(guān)重要。EEBV屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)度約11 kb，編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白[10]。E蛋白是EEBV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒粒子表面的主要成分，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，決定著病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力、病毒毒力、組織嗜性及血清特異性等[11-12]。E蛋白的高效表達(dá)對(duì)于EEBV感染檢測(cè)以及疫苗免疫水平評(píng)價(jià)等具有重要意義。

到目前為止，E蛋白在畢赤酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)中均獲得了表達(dá)[13-14]。然而，上述表達(dá)系統(tǒng)制備外源蛋白的成本較高，而且產(chǎn)量較低；相對(duì)而言，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有成本低廉、生產(chǎn)率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，故本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)E蛋白進(jìn)行了表達(dá)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，在預(yù)測(cè)的相對(duì)分子質(zhì)量處出現(xiàn)了特異條帶，表明本研究成功表達(dá)了E蛋白。本研究以終濃度為 0.5 mmol·L-1的IPTG在37 ℃條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá) 8 h后，E蛋白以包涵體形式表達(dá)。包涵體不具有生物活性，因此，為獲得具有生物活性的E蛋白，本研究對(duì)包涵體形式的E蛋白進(jìn)行了復(fù)性，復(fù)性過(guò)程中采用逐漸降低尿素含量的方式進(jìn)行透析復(fù)性，有效避免了因變性劑的含量下降過(guò)快導(dǎo)致蛋白再次錯(cuò)誤折疊形成沉淀的情況，最終從1 L培養(yǎng)物中獲得了23.8 mg的復(fù)性E蛋白。為確定復(fù)性后的E蛋白具有生物活性，本研究利用Western blot對(duì)復(fù)性E蛋白與抗EEBV單抗的反應(yīng)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)性E蛋白能被抗EEBV單抗特異識(shí)別，表明復(fù)性后的E蛋白含有與病毒粒子表面天然E蛋白相同的表位，具有良好生物活性。為制備特異性好、親和力高的兔抗血清，本研究以E蛋白為免疫原，采用低免疫劑量、長(zhǎng)免疫間隔的方式對(duì)新西蘭兔進(jìn)行了4次免疫；ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，兔抗血清能與E蛋白發(fā)生特異反應(yīng)，抗體效價(jià)達(dá)到1×51 200，說(shuō)明表達(dá)的E蛋白能有效刺激抗體產(chǎn)生，具有良好的免疫原性，同時(shí)也表明本研究成功制備了高親和力的兔抗血清。

此外，原核表達(dá)系統(tǒng)往往因?yàn)槿鄙俦匾牡鞍仔揎椂鴮?dǎo)致外源蛋白的結(jié)構(gòu)不同于天然蛋白，為進(jìn)一步確定表達(dá)的E蛋白具有和天然蛋白相同的表位，本研究對(duì)兔抗血清與EEBV的反應(yīng)性進(jìn)行了檢測(cè)，首先以抗EEBV單抗與EEBV的特異反應(yīng)為基礎(chǔ)建立了有效的IFA分析方法，采用此方法對(duì)E蛋白兔抗血清與EEBV的反應(yīng)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，兔抗血清能夠與EEBV發(fā)生特異反應(yīng)，說(shuō)明表達(dá)的E蛋白含有與天然蛋白相同的表位，也表明本研究制備的兔抗血清特異性強(qiáng)。

綜上所述，本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了SA14-14-2株的E蛋白，同時(shí)制備了特異性強(qiáng)、親和力高的兔抗血清，為建立診斷EEBV感染的免疫學(xué)檢測(cè)方法準(zhǔn)備了材料，為開(kāi)展健康人群流行性乙型腦炎抗體水平監(jiān)測(cè)、進(jìn)而更加有效地防控流行性乙型腦炎奠定了基礎(chǔ)。